This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.

<ol>
	<li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).</li><li>Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+assays+and+diagnostic+laboratory+procedures+in+human+biological+fluids.">Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids.</a> Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).</li><li>Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+among+plasma+cortisol,+catecholamines,+neuropeptide+Y,+and+human+performance+during+exposure+to+uncontrollable+stress.">Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress.</a> Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).</li><li>Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+Biomarkers+of+Physical+Fatigue+as+Markers+of+Sleep+Deprivation.">Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation.</a> J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).</li><li>Kwak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+biomarkers+from+human+melanoma+cells.">Volatile biomarkers from human melanoma cells.</a> J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).</li><li>Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Cortisol+in+Saliva+with+a+Flow-Filtered,+Portable+Surface+Plasmon+Resonance+Biosensor+System.">Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System.</a> Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).</li><li>Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+functionalized+interdigitated+&#956;-electrode+(ID&#956;E)+based+impedimetric+cortisol+biosensor.">Antibody functionalized interdigitated &#956;-electrode (ID&#956;E) based impedimetric cortisol biosensor.</a> Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).</li><li>Kapczinski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allostatic+load+in+bipolar+disorder:+Implications+for+pathophysiology+and+treatment.">Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+RNA+domain+that+binds+Zn2.">Selection of an RNA domain that binds Zn2.</a> RNA. 1 (5), 538-550 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Aptamers+Specific+for+Adipose+Tissue.">Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue.</a> PlosOne. 7, e37789 (2012).</li><li>McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+biosensor+arrays+for+detection+and+quantification+of+biological+macromolecules.">Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules.</a> Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+electrochemical+biosensor+based+on+a+DNA+aptamer+against+codeine.">A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine.</a> Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX&#8212;A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX&#8212;A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+An+Emerging+Class+of+Molecules+That+Rival+Antibodies+in+Diagnostics.">Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics.</a> Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Morse, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+of+RNA+beacon+aptamers.">Direct selection of RNA beacon aptamers.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).</li><li>Nutiu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Switching+Signaling+Aptamers.">Structure-Switching Signaling Aptamers.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).</li><li>Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aptamer-based+fluorescence+biosensor+for+multiplex+detection+using+unmodified+gold+nanoparticles+Chem.">An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem.</a> Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).</li><li>Li, H., Rothberg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction.">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li><li>Ch&#225;vez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer&#8211;gold+nanoparticle+conjugates:+effect+of+aptamer+length+on+response.">Colorimetric detection with aptamer&#8211;gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).</li><li>Hagen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+Zinc+Oxide+Field+Effect+Transistors+for+Selective+Sensing+of+Riboflavin+with+Current+Modulation.">Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation.</a> Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).</li><li>Han, K., Liang, Z., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Strategies+for+Aptamer-Based+Biosensors.">Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors.</a> Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).</li><li>Martin, J. A., Ch&#225;vez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol.">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li><li>Hall, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+and+Amplification+of+DNA+Pools+for+In+Vitro+Selection.">Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection.</a> Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).</li><li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O&#8217;Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX.">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li><li>Djordjevic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX+experiments:+New+prospects,+applications+and+data+analysis+in+inferring+regulatory+pathways.">SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways.</a> Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).</li><li>Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small+Molecules.">Targeting RNA with Small Molecules.</a> Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).</li><li>Jing, M., Boswer, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Methods+for+Measuring+Aptamer-Protein+Equilibria.">A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).</li><li>Sachs, E. -. F., Diederichsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Binding of Triostin Analogues to DNA. , (2011).</li><li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+aptamer-linked+gold+nanoparticle+purple+aggregates+for+colorimetric+sensing+of+analytes.">Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes.</a> Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).</li><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing.">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).</li><li>Martin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Aptamer+Antidote+to+the+Anticoagulant+Drug+Bivalirudin.">Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin.</a> Plos One. 8 (3), e57341 (2013).</li><li>Sch&#252;tze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+SELEX+Process+with+Next-Generation+Sequencing.">Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing.</a> Plos One. 6 (12), e29604 (2011).</li><li>Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclic+identification+of+aptamers+for+human+alpha-thrombin+using+over-represented+libraries+and+deep+sequencing.">Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing.</a> Plos One. 6 (5), (2011).</li><li>Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Ch&#225;vez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li><li>Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -. C., Hudgens, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+Responses+to+Psychological+Stress+in+Men+Preparing+for+Skydiving.">Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Multiplexed+Proteomic+Technology+for+Biomarker+Discovery.">Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery.</a> Plos One. 5 (12), (2010).</li><li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+Addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue.">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).</li><li>Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+metabolites+in+breast+cancer.">Progesterone metabolites in breast cancer.</a> Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).</li></ol>

توزيع بيان A: وافقت لاطلاق سراح العامة. توزيع غير محدود (88 ABW-2014-4103). تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

حقيقة أن جزيئات صغيرة ذات أهمية بيولوجية، ولكن تشكل فقط 19٪ من جميع الأبتامرات ذكرت يجعل طرق مصممة لاختيار الأبتامرات التي تنطبق على جزيئات صغيرة من أهمية كبيرة. SELEX من جزيئات صغيرة تحديا خاصا كجماعات وظيفية أقل، زخارف الهيكلية، ومساحة السطح المتاحة للتفاعل مع تسلسل مقارنة مع البروتينات 1، وتشير التقديرات إلى أن أقل من 30٪ من الاختيارات لجميع الأهداف حاول قد أدت إلى أبتمر 38. ولذلك، يجب على المرء أن يكون على علم بشكل استثنائي من التصميم التجريبي والتنفيذ من أجل تحديد أبتمر إلى هدف جزيء صغير بنجاح. طريقة اختيار أبتمر وصفها في هذا العمل هو مفيد لأنه ينطبق على جزيئات صغيرة دون الحاجة إلى أي تعديل الكيميائية التي قد تغير خصائص ملزم بها. بل هو أيضا شطف مقرها، مما يعني أنه منذ رانه DNA، بدلا من الهدف، لا بد في البداية ثم مزال من حبات مغناطيسية بواسطة هدف، لن يتم تضخيم DNA التفاعل مع مصفوفة حبة للجولة المقبلة من التحديد لأن يتم الإفراج المجلدات إلى جزيء من الفائدة في المخزن المؤقت طاف والمغلفات مصفوفة غير محددة تبقى مع ذلك ملتزمة. على العكس من ذلك، لا بد من طريقة سلبية للاختيار ضد مصفوفة لالأساليب التي لشل حركة الهدف إلى دعم قوي كل جولة لDNA التي تتفاعل مع المصفوفة سوف تتضخم بالإضافة إلى المجلدات الهدف 1. وقد تم تصميم الطريقة الحالية باعتبارها استراتيجية مجموعة محدودة T م. وهذا يعني أن T م لل/ تجمع تهجين [كدنا أبقي بالقرب من RT. تستخدم مورس استراتيجية مماثلة، ولكن تطبيق [كدنا التحقيق 6 مير مع T م &lt;10 ° C مع شروط الاختيار في 4 ° C 17. كان تطبيقنا للمقايسة biosensing أجريت في RT، لذلك تم تعديل طول كدنا] وفقالاي. هذا يحافظ على التشدد في اختيار منخفضة بما فيه الكفاية بحيث لا تضيع المجلدات المحتملة لأن التفاعل ملزمة الهدف يحدث في مكان بعيد أن لا يسبب تغيير متعلق بتكوين قادرة على تعطيل كدنا] ملزمة. ومع ذلك، فإن كفاءة تقسيم الطريقة المقترحة منخفضة لأن بعض متواليات سوف dehybridize تستند فقط على الديناميكا الحرارية. في المقابل، Nutiu وآخرون تطبيق [كدنا 15 مير، وكانت فقط قادرة على تحديد الأبتامرات لاثنين من الاهداف الاربعة، ربما لأن T م من مير 15 كان مرتفعا جدا للسماح بيان من هدف جزيء صغير 18. لذلك، في حين أن استراتيجية التحديد الحالي سيتطلب عدة جولات لإزالة متواليات الخلفية، من خلال التحكم في التشدد في اختيار والتقليل من فقدان المواد الرابطة المحتملة سيتم زيادة احتمالات النجاح. العديد من الباحثين جديد لاختيار أبتمر لا يدركون من الجوانب الهامة المتعلقة PCR منتجليد المحتملة. دورة الأمثل (القسم 4.5) ضروري لأن الإفراط في تضخيم المكتبات DNA ينتج غير المرغوب فيها من المنتجات (عادة أكبر في الحجم) في دورة أرقام عالية، والمنتج المطلوب قد تختفي تماما مع وجود فائض من فقط 5 دورات 39. في حالة الإفراط في تضخيم، والمنتجات PCR لم تعد تمثل تلك متواليات مزال بواسطة هدف، وتتناقص فرص النجاح الاختيار بشكل كبير. الشكل 4 يوضح مثالا للدورة الأمثل من الجولة 5 في هذا العمل. أدنى دورة تنتج الحد الأدنى من الفرقة المنتج، وزيادة الفرقة في كمية من خلال 8 دورات، في 10 دورات الفرقة تبدأ الانتقال إلى أعلى حجم الإفراط في تضخيم المنتج، وتضم ما يقرب تماما من المنتج تضخيمها عبر غضون 12 دورات. تفاصيل أخرى أن العديد من الباحثين عديم الخبرة في SELEX قد نغفل هو أن تجمع بأكمله يجب تضخيمه في PCR التضخيم على نطاق واسع (القسم 4.6) في التنوبالحادي جولة للتخفيف من فقدان المواد اللاصقة. عدد متواليات فريدة الممكنة من [أليغنوكليوتيد هو 4 N، حيث يمثل 4 أربع قواعد الحمض النووي، وN هو عدد القواعد في المنطقة عشوائية من المكتبة. لهذا العمل، N = 40، مما أدى إلى الفضاء متواليات من 1.2 × 10 24 متواليات فريدة الممكنة. 2.5 نانومول من مكتبة المستخدمة في الجولة الأولى من اختيار يتوافق مع ~ 10 15 الجزيئات، وهذا يعني أن كل نسخة من الحمض النووي من المرجح ممثلة في التجمع الأولي باعتباره تسلسل فريد من نوعه. ولذلك، يجب تضخيم حجم كامل من الحمض النووي مزال من الخرز بواسطة هدف في الاحتفاظ بنسخة من كل الموثق المحتملين للجولة القادمة من الاختيار. وبمجرد حدوث هذا التضخيم الأولي، هي متاحة للاختيار في الجولات التالية حيث يفترض حلا متجانسا لأخذ العينات نسخ متعددة. وينبغي أيضا النظر تركيز الهدف بعناية في كل جولة. Nutiu آخرون استخدامتركيز دا من 1 ملي هدف في جميع مراحل عملية الاختيار، واختيار لأبتمر ATP مع K د = 600 ميكرومتر 18. بدأ كل من العمل الحالي والبحوث مورس 17 مع 100 هدفا ميكرومتر، وخفض طوال التحديد، وأسفرت عن الأبتامرات مع الانتماءات مكرومولي منخفضة. بالضبط الذي جولة التشدد ينبغي زيادة (أقل تركيز الهدف) يعتمد على عندما لوحظ تخصيب اليورانيوم. خطوة حاسمة أخرى تتمثل في تطبيق الخطوات المناسبة اختيار السلبية لذلك الأبتامرات تثبت خصوصية لجزيء الهدف. التي تستخدم فيها الضوابط يتوقف على مدى تطبيق المقصود من أبتمر المحدد. على سبيل المثال، تم تصميم أبتمر 15-1 لتكون بمثابة عنصر الاعتراف في مقايسة biosensing لالكورتيزول، لذلك تم استخدام هرمون البروجسترون كما جزيء اختيار سلبي لأنه هو مقدمة الأيضي لالكورتيزول التي وجدت في السوائل الفسيولوجية 40. وأبتمر ATP التي اختارها Nutiu وآخرون. &lt;/ م&gt; لم تتضمن خطوة اختيار السلبية، ويتفاعل مع جزيئات مماثلة بنيويا بما في ذلك ADP، AMP، الأدينوزين، وdATP 18. ملاحظة أخيرة للنظر هو أن الفحص AuNP غالبا ما يتطلب تحسين كبير لكل زوج أبتمر / الهدف. أبحث عن حجم الملح الذي يسبب تغير بالكاد بصريا نحو ونه الازرق بعد إضافة الملح هو نقطة انطلاق جيدة، ولكن قد تكون هناك حاجة لتعديل نقطة انطلاق لاحظت استجابة. لقد وجدنا أيضا أن فحص تنتج استجابات مختلفة بشكل كبير اعتمادا على تركيز عازلة (قد يتطلب عازلة اختيار التخفيف لأن تركيز الملح عال من مخازن وغالبا ما يسبب تجميع) وتكوينها، ودرجة التغطية DNA (الشكل 3)، وإعداد العينات (بعض العضوية المذيبات المستخدمة لإذابة الهدف قد يسبب خلفية عالية أن الأقنعة تستهدف الاستجابة)، ودرجة الحرارة، نوع الملح والتركيز، وincubaالوقت نشوئها (من كل من الحمض النووي DNA مع AuNP و/ AuNP مع الهدف). في ظل ظروف الأمثل تماما، وعادة ما تكون لاحظت النتائج مع فترة حضانة الهدف &lt;5 دقائق، مما يدل على الاستفادة من وجود استجابة الهدف السريع للمنصة biosensing AuNP. على سبيل المثال، في الشكل 5 فترة حضانة من أبتمر / تم تخفيض AuNP خطوة من O / N (الشكل 3) لمدة 30 دقيقة، وتمت إضافة الملح على الفور (&lt;10 ثانية) بعد إضافة الهدف بدلا من 20 دقيقة في وقت لاحق (الشكل 3 ) في مناطق ذات كثافة تحميل 73 D / NP. هذه الزيادة في استجابة الكورتيزول إلى ~ أعلى 82٪ من فارغة (الشكل 5A) في تركيز 10 ميكرومتر هدف مقابل ~ 40٪ باستخدام الشروط السابقة (الشكل 3). هذا الرد يمكن تمييزها بالعين المجردة (الشكل 5B). لاحظ أن مجموعة خطية من الكشف الكورتيزول هو مختلف من استخدام الشروط السابقة، مما يشير إلى أن هذه الظروف يمكن أن يكون الأمثل لالمطلوباكتشاف مجموعة. لم حمض الكوليك و2-methoxynaphthalene (2MNP) الضوابط لا تنتج استجابة كبيرة (أرقام 5A-B). يجب أن يكون الباحثون على علم بأن الحد من هذه الأوقات حضانة قد تسهل استجابة متزايدة من التحاليل مع سطح AuNP، والتي يمكن أن تسهم في إشارة الشاملة محسن (الهدف) أو الخلفية (جزيئات غير المستهدفة). ولذلك، دقيق AuNP تصميم فحص والأداء توصيف ضروري لكل زوج أبتمر / الهدف. يصف هذا الإجراء بروتوكول لاختيار الأبتامرات صغيرة جزيء تبديل هيكل التي تعمل في منصة biosensing مثل AuNP فحص وصفها، والتي تتطلب تغيير متعلق بتكوين من الحمض النووي للكشف عن وجود الهدف. ومع ذلك، وهذه الطريقة يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل جهاز الاستشعار البيولوجي الكهروكيميائية أو مضان التي تعمل على نفس المبدأ تقريبا لحجم أي هدف. قوة بروتوكول يمكن مواصلة تطوير تجريبيا من قبلعدة طرق. أولا، واختيار نفسها قد تكون محتملة تحسنت من خلال التحقيق أساليب التحسين مثل تحديد T المثالي م [كدنا] التهجين / المكتبة التي توفر التفاعل الذي هو ضعيف بما يكفي للتفاعل مع هدف جزيء صغير، ولكن قوية بما فيه الكفاية لتقليل كمية من خلفية متواليات dehybridized فقط من الديناميكا الحرارية. هذا وسوف تتكثف عدد الدورات اللازمة لاختيار، وتوفير الوقت في العمل والحد من استهلاك كاشف. أن تحقيقات أخرى إلى تعديلات على اختيار أن يكون لتحديد تركيزات الأكثر ملاءمة من الخرز وDNA بحيث يتم كشفها مجموعة متنوعة من السكان من متواليات لهذا الهدف، خصوصا في الجولة الأولي. نجاح هذه التجارب إثبات صحة المبدأ يوفر أساسا للاستثمار المزيد من الموارد من أجل تحسين وتكييف عازلة فحص AuNP إلى السوائل الفسيولوجية. هناك حاجة مشروعة ل، منصة biosensing قوية السريعة التي يمكن فوnction كأداة تشخيصية من الحالة الفسيولوجية للفرد، ومزيد من التطوير للمقايسة AuNP في مصل الدم البشري، والعرق، أو اللعاب سيجتمعون لهذه الفجوة الحالية.

منذ فترة طويلة المعترف بها جزيئات صغيرة مثل لعب الأدوار الحيوية في العمليات البيولوجية المختلفة مثل سمية الفسيولوجية أو التغذية، وإشارات الخلية، والعلاجات الدوائية لمرض 1. كما تم اقترح جزيئات صغيرة مختلفة، والمؤشرات الحيوية تدل على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التوتر 2،3، والتعب 4، والمرض 5. على سبيل المثال، ومستويات الكورتيزول المرتفعة ترتبط مع التوتر الذي قد يؤدي إلى انخفاض الأداء الفسيولوجي والشروط الصحية الأخرى 6-8. وبالمثل، والاختلافات في نسب بعض الببتيدات في اللعاب هي التنبؤية التعب، حيث تشمل المظاهر الفسيولوجية عدم القدرة على التركيز، وضعف وقت رد الفعل، وانخفاض وظيفة الادراك 4. ولذلك، فإن تطوير أجهزة الاستشعار الهدف محددة لمراقبة مستويات الجزيئات الصغيرة قد توفر متري لا يقدر بثمن لتقييم قدرات الصحة والأداء من السرعة الكلاسيكي فرديidual. تاريخيا، وقد تم تنفيذ الكشف عن جزيء صغير من خلال تقنيات فصل كثيفة العمالة أو عن طريق الأجسام المضادة الاعتراف استنادا 6،7. وفي الآونة الأخيرة، الأبتامرات الحمض النووي 9،10 ظهرت كعناصر الاعتراف بأن تمتلك مزايا واضحة على الأجسام المضادة في تطبيقات محددة. مع قدرتها على ربط هدف متفاوتة في حجمها من ايونات المعادن 11 إلى 12 الأنسجة، وقد طبقت على نطاق واسع الأبتامرات كعناصر الاعتراف في منصات biosensing 13،14. مقارنة مع الأجسام المضادة، وتوليفها كيميائيا الأبتامرات، ولذلك فمن بسيط لإدخال التعديلات الكيميائية استنساخه لتجميد سطح أو التقارير. يمكن اختيار الأبتامرات مع خصوصية هدف عالية وفقا للشروط المطلوبة عن طريق تعديل شروط الاختيار المستخدمة، في حين أن الأجسام المضادة تقتصر على الظروف الفسيولوجية 15،16. وبالإضافة إلى ذلك، الأبتامرات قادرة على أعلى كثافة يجند بسبب إلى thمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو حجم أصغر، مما أدى إلى هدف أعلى مما يشير إلى كفاءة على منصة جهاز الاستشعار البيولوجي، وتعزيز الاستقرار من الأبتامرات يسمح للاستخدام المتكرر والتخزين استشعار طويلة الأجل 16. يتم إنشاء الأبتامرات باستخدام إجراء يعرف باسم SELEX، حيث يتم تطورت مكتبة الأولية من متواليات من 10 13 -10 15 جزيئات فريدة من نوعها لحمام سباحة النهائي المخصب تحتوي على عدة (10 -10 1 2) متواليات مع القدرة على ربط جزيء الهدف. ثم يتم التسلسل بركة المخصب النهائي، ويتم الحصول على ثوابت التفكك (K د) من المقايسات من أعلى تسلسل عدد النسخ ملزم مع جزيء الهدف. وتتبع تطور تجمع للسكان النهائي المخصب من خلال رصد النسبة المئوية للتجمع ملزمة هدف في كل جولة، حتى يتم الحصول على تخصيب القصوى. ويحدث هذا على مدى عدد من جولات التطورية، حيث يتم تقسيم تسلسل ملزمة من nonbinders وAMPLified باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). القدرة على تقسيم فعال والاحتفاظ المجلدات هي واحدة من المحددات الرئيسية للكفاءة الآثار الاختيار ومباشرة خصائص الأبتامرات اختيار 15. مرحلة التقسيم SELEX هي أكثر تحديا لجزيئات صغيرة لأنها لا تمتلك حجم أو مجموعة من المجموعات الوظيفية التي تساعد عملية التقسيم من الأهداف بروتين 1،15. على سبيل المثال، العديد من المنصات البروتين تقسيم تعتمد على حجم أو الانفصال على أساس تهمة، لكن خصائص المربوطة المجمعات الهدف جزيء الحمض النووي صغير عموما لا تختلف بكثير من تسلسل غير ملزمة، مما أدى إلى تقسيم غير فعالة 1. طرق تقسيم SELEX البديلة قد تنطوي على تجميد أو وضع العلامات من الهدف، والتي يحتمل أن يغير خصائص ملزم من جزيء صغير. وبالتالي، تصميم إجراءات الاختيار لتوليد الأبتامرات لجزيء صغير يستهدف صequires اهتماما خاصا. تم تطبيق مجموعة متنوعة من التعديلات على منهجية SELEX الأصلية لتعزيز كفاءة تقسيم الإجراء، وتحسين تقارب أو خصوصية متواليات في التجمع النهائي، أو جعلها أكثر قابلية لتطبيقات مختلفة 15،16. وقد تم تصميم واحد تعديل SELEX قادر على اختيار لجزيئات صغيرة لتوليد الأبتامرات تبديل بنية، أو الأبتامرات أن يخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين على التفاعل مع جزيء الهدف 17،18. في مثال واحد من هذه الطريقة، يتم تهجين المكتبة إلى قطعة قصيرة من الحمض النووي مكملة غير ملزم ([كدنا]) ثبتوا على حبات مغناطيسية 17. على ملزما الهدف، فإن التغيير متعلق بتكوين سلاسل ملزمة تمكنهم من dehybridize من [كدنا]، الإفراج عنهم في حل طاف، في حين أن nonbinders المتبقية تهجين إلى كدنا] / والخرز تقسيم مغناطيسيا والتخلص منها. هذا الأسلوب هو يمضيtageous لجزيئات صغيرة لأنها لا تتطلب تجميد أو وضع العلامات من الجزيء المستهدف لتحقيق الانفصال. الأبتامرات التي هي قادرة على هيكل التبديل تمتلك ميزة قيمة لأي منصة جهاز الاستشعار البيولوجي المحتملة التي يتطلب تغييرا في بنية أبتمر للكشف عن وجود جزيء الهدف. على وجه التحديد، الأبتامرات يمكن الجمع بين جزيئات الذهب (AuNPs) لإنشاء المقايسات التي تعمل على أساس مبدأ تبديل بنية لإنتاج استجابة اللونية في وجود جزيء الهدف بعد التحدي الملح 19،20. في مقايسة AuNP، وDNA واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) أبتمر تمتز في البداية إلى السطح AuNP ويحميها من التحدي الملح. وجود هدف يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين في أبتمر الذي يعرض سطح AuNP، مما أدى إلى تغيير اللون الأحمر إلى اللون الأزرق-بعد إضافة الملح. وقد تبين أيضا AuNP المقايسات لتضخيم الإشارات، حيث مكرومولي تقارب أبتمرالصورة يمكن الكشف عن الهدف في مستويات أوامر من حجم أقل من ثابت التفكك (K د) 21. هذه الميزة هي جاذبية خاصة للأهداف جزيء صغير، حيث تتراوح الانتماءات عادة من انخفاض مكرومولي لتركيزات millimolar 1،15. عموما، فإن الاختبار هو أيضا سريع وبسيط نسبيا لأداء وتشجيع مزيد من الدراسة من المقايسات أبتمر-AuNP كمنصات كشف جهاز الاستشعار البيولوجي. والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول عالمي لاختيار الأبتامرات تبديل هيكل إلى جزيئات صغيرة لتطبيقات biosensing باستخدام الكورتيزول الإجهاد علامة كناقل تمثيلي. مخطط AuNP كشف جهاز الاستشعار البيولوجي هو من مصلحة نظرا لبساطته التشغيل وقراءات اللونية، ولكن الأبتامرات تبديل بنية قابلة للتطبيق على مخرجات منصة الاستشعار البديلة، مثل الكهروكيميائية 22 أو 23 مضان التي توفر أيضا كشف عن طريق تغيير في أبتمر conformatioن على هدف ملزم. بالمقارنة مع الطرق السابقة، وأدرجت عدة خطوات اختيار السلبية في تصميم 17،18، ونفذت خطة الكشف تخصيب القائم على الأشعة فوق البنفسجية بسيط (الشكل 1). هذا البروتوكول هو في تناقض مع نظام الكشف عن تخصيب جين مشع يستخدم في الطرق القديمة 17. كما أدرجت الطريقة المقترحة زيادة في طول المجسات التقاط [كدنا المستخدمة في اختيار لزيادة كفاءة وفعالية تقسيم ضبط التشدد في اختيار بعد لوحظ تخصيب القصوى 24. أدى الرصاص صرامة ضبطها إلى النسبة الإجمالية أقل من الحمض النووي مزال بواسطة هدف في التجمع النهائي، ولكن بأعداد نسخة أعلى من سلسلة التي تربط مع تعزيز التقارب مقارنة بأعلى نسخة تسلسل عدد من جولة سابقة. تم تطبيق أعلى نسخة تسلسل عدد من التجمع النهائي لمقايسة AuNP لتوضيح أن تسلسل كان قابلة للمنصةيتطلب التغيير الهيكلي للإشارة إلى هدف ملزم. ويظهر هذا الاختبار عازلة على أساس أن الاستجابة للمقايسة AuNP يمكن تعديلها عن طريق تغيير كثافة DNA تطبيقها على السطح، وبمثابة إثبات لمبدأ العمل على تكريس الجهود البحثية المستقبلية نحو تطوير جزيء صغير القائم على أبتمر أجهزة الاستشعار AuNP في السوائل الفسيولوجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dynabeads M280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with DynaMag-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Streptavidin Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td style="width:203px;">This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4001</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td>P0130</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholic Acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1129</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NanoDrop ND-1000</td>
			<td style="width:103px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:119px;">ND-1000</td>
			<td style="width:203px;">Replaced by ND-2000 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris Base</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5135</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9888</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td style="width:103px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63068</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">500 mL Filter System</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430769</td>
			<td style="width:203px;">0.22 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNA Library</td>
			<td style="width:103px;">Operon</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:203px;">HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">All other DNA</td>
			<td style="width:103px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:203px;">Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">R</td>
			<td style="width:203px;">Any model with&#160; temperature and mixing speed control will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td style="width:203px;">Taq polymerase can be used as well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td>200415</td>
			<td style="width:203px;">Other brands will work here</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:119px;">200532</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GeneAmp PCR System</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">9700</td>
			<td style="width:203px;">Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose-LE</td>
			<td style="width:103px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9040</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-1510</td>
			<td style="width:203px;">Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Empty Synthesis Columns, 1 &#181;m Expedite Style</td>
			<td style="width:103px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">20-0021-01</td>
			<td style="width:203px;">This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replacement Filters Expedite</td>
			<td style="width:103px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">20-0021-0F</td>
			<td style="width:203px;">1 &#181;m size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Illustra NAP-25 Columns</td>
			<td style="width:103px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0852-01</td>
			<td style="width:203px;">Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66205</td>
			<td style="width:203px;">2k MWCO used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride hydrate</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">254169</td>
			<td style="width:203px;">99.999% purity is important</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td style="width:103px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">W302600</td>
			<td style="width:203px;">We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">M5</td>
			<td style="width:203px;">Results were similar to Bio-TEK system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synergy</td>
			<td style="width:103px;">Bio-TEK</td>
			<td style="width:119px;">HT</td>
			<td style="width:203px;">Results were similar to Molecular Devices system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">J848</td>
			<td style="width:203px;">Any brand that makes a sterilized product will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">250 mL Filter System</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430767</td>
			<td style="width:203px;">0.22 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Spectrophophotometer</td>
			<td style="width:103px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary 300&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Other brands will work here</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5 mL Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td style="width:203px;">This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ThermoEC Minicell Primo</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EC320</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with Power Supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Power Supply</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB300</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with ThermoEC Minicell Primo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:203px;">Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 Methoxynaphthalene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">148245</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td>96-well Flat Bottom, Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for selecting structure-switching aptamers applied to a colorimetric gold nanoparticle assay

توفر جزيئات صغيرة أهداف غنية لتطبيقات biosensing بسبب آثارها الفسيولوجية على النحو المؤشرات الحيوية لمختلف جوانب صحة الإنسان والأداء. وقد طبقت الأبتامرات الحمض النووي على نحو متزايد مع عناصر الاعتراف على منصات جهاز الاستشعار البيولوجي، ولكن اختيار الأبتامرات نحو أهداف جزيء صغير يتطلب اعتبارات التصميم الخاصة. يصف هذا العمل تعديل والخطوات الحاسمة لطريقة تصميم لتحديد الأبتامرات تبديل الهيكل لأهداف جزيء صغير. يتم فصل ملزم متواليات من مكتبة DNA تهجين لتحقيقات تكميلية التقاط DNA على حبات مغناطيسية من nonbinders عن طريق التغير بفعل هدف في التشكل. هذا الأسلوب هو مفيد لتسلسل ملزمة مصفوفة دعم (الخرز) لن يتم زيادة تضخيمها، وأنها لا تتطلب الشلل في جزيء الهدف. ومع ذلك، يتم الإبقاء على حرارة ذوبان القبض على التحقيق ومكتبة عند أو أعلى قليلا RT، مثل أن متواليات روقبعة dehybridize على أساس الديناميكا الحرارية يكون حاضرا أيضا في حل طاف. وهذا يحد بشكل فعال كفاءة التقسيم (القدرة على الهدف منفصل متواليات من nonbinders ملزمة)، وسوف تكون هناك حاجة لذلك العديد من جولات اختيار لإزالة متواليات الخلفية. يختلف أسلوب ذكرت من التحديدات السابقة أبتمر تبديل هيكل بسبب تنفيذ خطوات اختيار السلبية، ورصد تخصيب مبسطة، وتمديد طول القبض على التحقيق التالية تخصيب التحديد إلى توفير وتعزيز صرامة. والأبتامرات تبديل هيكل المختارة هي مفيدة في منصة فحص جسيمات متناهية الصغر الذهب التي تفيد وجود جزيء الهدف من التغيير متعلق بتكوين لأبتمر. تم تطبيق فحص جسيمات متناهية الصغر من الذهب لأنه يوفر لذلك، قراءات اللونية السريعة البسيطة التي تعود بالنفع في بيئة السريرية أو نشرها. يتم عرض تصميم والأمثل اعتبارات للمقايسة كما إثبات صحة المبادئ الشخصيهالعمل الإلكترونية في عازلة لتوفير أساس لمزيد من تمديد عمل نحو biosensing جزيء صغير في السوائل الفسيولوجية.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay at JoVE.com

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

a-method-for-selecting-structure-switching-aptamers-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  Wright-Patterson Air Force Base. A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Video: A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

كامل الجسم جسيمات متناهية الصغر الهباء التعرض بالاستنشاق

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

غير الأنزيمية، خالية من مصل زراعة الأنسجة من آفات الثدي ما قبل الغازية لتوليد عفوية من Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

تصميم وتطوير أبتمر الذهب الجسيمات النانوية وبناء اللونية فحوصات للتطبيقات الموجودة على الشبكة العالمية الحقل

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

الأغشية الدهنية ثنائية الطبقات المربوطة لمراقبة نقل الحرارة بين الجسيمات النانوية الذهبية والأغشية الدهنية

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...