עבודה זו נתמכה על ידי האירופית פרויקט BRIANBOW (הסיירים צעירים FP7-, המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר יאקופו Tessadori על הערות מועילות על כתב היד, וסילביה Chiappalone על עזרתה בהפקת הגרפיקה המשמשת בוידאו.

ההליך נעשה בהתאם לתקני NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי ועדת אוניברסיטת תל-אביב הטיפול בבעלי חיים והשימוש (מספר רישיון - L-14-019). 1. הכנה של מכשירים וPDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הרקיק (טבלה של חומרים, או להורות על הרקיק ממעבדת microfabrication), אזמל, ופינצטה - העיקור אינו נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך poly-D- ליזין פתרון (PDL) על פי התנאים הבאים: 4 מ&quot;ג / מיליליטר במאגר M 0.1 borate, pH 8, ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סטנסילים PDMS על פי הנוהל הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן polydimethylsiloxane (PDMS, אלסטומר סיליקון) על ידי ערבוב יחד הבסיס וסוכן הריפוי עם יחס של 10: 1, ולאחר מכן מערבבים את החומרים 2 לכ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועות מניחים בתא ואקום פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם ולאמת נעלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיPDMS מוכן, להכין coater ספין: ידיות חנקן פתוחות על מנת לאפשר שימוש בגז, הנח את פרוסות סיליקון (איור 1 א) על טווה, ולהשתמש בוואקום כדי למנוע ממנה לזוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים PDMS על פרוסות סיליקון ולהפעיל את הטווה דקות 1 ב 1000 סל&quot;ד (יוצר כ 100 מיקרומטר גובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסות על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר PDMS יש קשוח, לסמן הגבולות של סטנסיל עם PDMS, באמצעות פיפטה פסטר. מניחים פרוסות על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר גבולות PDMS הקשיחו, השתמש באזמל כדי לחתוך שבלונות לפי הגבולות ולקלף את השבלונה סיליקון מהרקיק (PDMS ריבוע המכיל תבנית אחת). </li></ol></li></ol> 2. צלחת פטרי והכנת Slip כיסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 23 מ&quot;מ מכסה מחליק זכוכית מרובעת ולנקות אותם לפי הסדר הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים מזוקקים, 70% אתנול, ואצטון. </li><html><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם isopropanol ומהיר יבש עם חנקן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סטנסילים PDMS דוגמת על coverslip, ולחץ בעדינות כדי לוודא שהם מחוברים היטב למשטח הזכוכית. מניחים בתא ואקום במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של 1 מיליליטר של PDL בסטנסיל. הכנס את coverslip לתא הוואקום פעמיים במשך 20 דקות בכל פעם, ולהשאיר PDL O / N לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת פטרי ליצירת רשת סלולארי תומכת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את פני השטח של המנה (3.5 סנטימטרים) עם 1 מיליליטר של PDL לשעה 2 בRT. הסר את ירידת PDL בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים מזוקקים ולהשאיר לייבוש. מניחים ירידה קטנה מאוד של שמן סיליקון על כל פינה של coverslip. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslip במרכז צלחת פטרי (כלומר, PDMS צריך לפנות כלפי מעלה) ולחץ בעדינות כדי לוודא קובץ מצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות PDMS מcoverslip באמצעות פינצטה. לעיקור, לחשוף לתאורת UV במשך 7 דקות. </li></ol>&quot;&gt; 3 Multi אלקטרודה-Array le. (MEA) הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEA הנקי בצו זה (טבלה של חומרים): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים תחת ברז וsonicate בחומר ניקוי מרוכז, האנזימטית 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate במים מזוקקים 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים מזוקקים (במכסת מנוע, 1,000 קצה μl) במשך 3 פעמים ומקום תחת UV למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיכת הכנת רשת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עובש רשת תמיכה שתוכנן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים לתוך צלחת PDMS 12 גם (22 מ&quot;מ קוטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר PDMS הוא התקשה להוציא את התבנית ובאמצעות אזמל, לחתוך חור באמצע כדי ליצור צורת טבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים תבנית רשת תמיכה שתוכננה במרכז MEA (איור 2 א) ולכסות את שאר פני השטח עם PDL לשעה 2 ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PDL באמצעות פיפטה ולשטוף עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את התבנית ולהשאיר לייבוש (איור 2 א). &lt;/ Li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר סטנסיל לMEA באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סטנסיל על מניפולטור מיקרו מיועד. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי ליישר במדויק מבנה בדוגמת לאלקטרודות, ולהפחית את השבלונה עד שהוא ממוקם על פני השטח MEA (איור 2). הערה: לתקשר עם MEA לנקות היטב מספק הידבקות תחרותית בין PDMS וMEA עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את micromanipulator ואם יש צורך, להשתמש בפינצטה כדי למרוח כמות קטנה של לחץ מעל PDMS כדי למנוע את זה ניתוק מMEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעדינות על סטנסיל למשטח MEA, ולהשתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהוא מחובר היטב, ומיושר היטב. (איור 2C-D). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח MEA בתא ואקום במשך 15 דקות; לשים טיפת 1 מיליליטר של PDL בסטנסיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס לתא ואקום 2 פעמים במשך 20 דקות כל אחד. השאר PDL לייבוש O / N בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הציפוי, להסיר את PDMS סטנסילים מMEAs ולשטוף באמצעות סטרילי wאטר. הנח תחת תאורת UV במשך 7 דקות. </li></ol> 4. Dissection ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות כפי שמתואר בהרצוג et al. 2011 21. </li></ol> 5. ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מספר התאים הדרושים לציפוי, באמצעות hemocytometer (צפיפות אופטימלית בהתאם לגודלו של המעגל כפי שנדון בתוצאה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שחדר הספירה (hemocytometer) הוא נקי ובמקום להחליק כיסוי עליו (אלכוהול שימוש לנקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 10 μl של ההשעיה התא 190 μl של ציפוי בינוני (דילול 1:20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μl של התאים בדילול מלא על קצה חדר הספירה ולאט לאט פיפטה את התאים המאפשר לתא כדי למלא את עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, לדמיין את רשת haemocytometer. לקבוע את מספר התאים בתא על ידי ספירה ישירה (תאים בריאים צריכים להיות עגולים). ספירת התאים בתוך witho המרובע הגדולut אלה שחצו את הקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הריכוז של תאים: מספר כולל של תאים / 1000 μl = סה&quot;כ תאים נספרו × גורם לדילול × 10 4 (שטח של hemocytometer). הערה: לדוגמא, אם היה הגורם לדילול 20 והתאים הכולל נספרו היו 100: 100 × 20 × 10 4 = 0.1 10 7 תאים / μl 1,000 x או 1 x 10 6/100 μl. כדי צלחת 0.75 x 10 6 תאים, לקחת 75 μl מתוך התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מספר התאים הדרושים לציפוי לMEA הבודד או צלחת פטרי, resuspend התאים כדי למנוע צבירה, וצלחת אותם במרכז, על גבי שטח patternate (במידת צורך, ניתן לדלל את התאים במדיום) . לMEA, מקום טיפת 100 μl באמצע. לכיסוי להחליק, מקום טיפת 1,000 μl באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים המצופה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. הוסף בינוני ציפוי לתאים מצופים, עד 1מיליליטר לMEA ו -2 מיליליטר לכיסוי להחליק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על 37 מעלות צלזיוס ו, כל 4 ימים, לדלל עם מדיום גידול טרי מועשר עם 0.5 פן-דלקת, 2% Glutamax B-27 ושל 0.75%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ6/7 DIV, לאחר שראה את הקשרים בין האיים, לדלל בינוני עם 10 μl / מיליליטר FUDR (uridine deoxyuridine + 62.5 מ&quot;ג 25 מ&quot;ג ב12.5 מיליליטר ממ (בינוני נשר חיוני מינימאלי)), או כל סוכן אנטי mitotic אחר כדי למנוע גליה יתר. </li></ol>

<ol>
	<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+syntax:+cell+assemblies,+synapsembles,+and+readers.">Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers.</a> Neuron. 68, 362-385 (2010).</li><li>Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+and+hierarchically+modular+organization+of+brain+networks.">Modular and hierarchically modular organization of brain networks.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).</li><li>Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neural+representation+capacity+by+modular+architecture+in+networks+of+cortical+neurons.">Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).</li><li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microelectrode+array+(MEA)+integrated+with+clustering+structures+for+investigating+in+vitro+neurodynamics+in+confined+interconnected+sub-populations+of+neurons.">A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).</li><li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations.">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PloS One. 9, e107400 (2014).</li><li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+synchronous+oscillations+in+freely-organized+small+neuronal+circuits.">Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits.</a> PloS One. 5, e14443 (2010).</li><li>Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+neuronal+circuits:+a+new+platform+for+studying+the+role+of+modular+topology.">Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology.</a> Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).</li><li>Bonifazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+large-scale+experimental+and+theoretical+studies+for+the+realization+of+bi-directional+brain-prostheses.">In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.</a> Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).</li><li>Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triangular+neuronal+networks+on+microelectrode+arrays:+an+approach+to+improve+the+properties+of+low-density+networks+for+extracellular+recording.">Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).</li><li>Marconi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+functional+properties+of+neuronal+networks+with+controlled+topology.">Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology.</a> PloS One. 7, e34648 (2012).</li><li>Taylor, A. M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+compartmentalized+platforms+for+neurobiological+research.">Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).</li><li>Sorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+self-wiring+in+cultured+neural+networks.">Compact self-wiring in cultured neural networks.</a> J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+properties+for+biomedical+micro/nanosystems.">Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems.</a> Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).</li><li>Campo, A. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8:+a+photoresist+for+high-aspect-ratio+and+3D+submicron+lithography.">SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography.</a> Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).</li><li>Liu, G. T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kan+Y+Fabrication+of+high-aspect-ratio+microstructures+using+SU8+photoresist.">Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist.</a> Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).</li><li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off.">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).</li><li>Pine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+action+potentials+from+cultured+neurons+with+extracellular+microcircuit+electrodes.">Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).</li><li>Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Fixed-Array+Multi-Microelectrode+System+Designed+for+Long-Term+Monitoring+of+Extracellular+Single+Unit+Neuronal-Activity+In+vitro.">New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro.</a> Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).</li><li>Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+of+spontaneous+activity+with+photoetched+microelectrode+surfaces+from+mouse+spinal+neurons+in+culture.">Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).</li><li>Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniature+microelectrode+array+to+monitor+the+bioelectric+activity+of+cultured+cells.">A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.</a> Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).</li><li>Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+validation+of+in+vitro+extra-cellular+neuronal+recordings.">Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings.</a> J Neural Eng. 8, 056008 (2011).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).</li><li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture.">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li><li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth.">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li><li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture.">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li><li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks.">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 36, 135-141 (1998).</li><li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays.">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li><li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates.">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול לגדול רשתות עצביות מודולרי 2D במבחנה המורכבת ממעגלים תפקודי-היתר קשור מתואר. ההליך מבוסס על דפוסי שכבת דבק סלולרית. דפוסים מושגת עם שבלונות PDMS לשחזר את התכונה השלילית של ארכיטקטורת הרשת הרצויה. סטנסילים PDMS להגדיר את האזורים שבם שכבת הדבק הסלולרית מופקד?...

עדויות ניסויית ותיאורטיות תומכות באפשרות שהמוח פועל באמצעות הפעלה מתואמת של מכלולי תא 1-5, שיכול להיחשב כיחידות פונקציונליות דינמיות שtransiently לתקשר אחד עם השני, עיצוב ומדינות שונות במוח בסיסי. המודולריות פונקציונלית תלויה גם ובקשור לארגון מודולרי המבני של המעגלים חשמליים במוח 6,7. איך תפקוד ומבנה של מעגלים חשמליים במוח באופן הדדי לעצב אחד את השני הוא עדיין אחת השאלות פתוחות העיקריות במדעי המוח. כדי לספק הבנה עמוקה יותר של שאלה זו, חשוב לזהות מסגרות ניסיוניות אופטימליות בו ניתן לטפל ב, לפחות באופן חלקי, בנושאים אלה. מאז נשלט מניפולציה של דינמיקת מרחב ובזמן של רשתות עצביות בניסויי in vivo הוא מאתגר, פיתוח המודלים רשתות עצביות במבחנה הוא עניין משמעותי בשל acc הקלessibility, ניטור, מניפולציה ודוגמנות 8,9. בשנים האחרונות, בטכנולוגיות מבחנה הנתמכות על ידי שיטות דפוסי מצע מתקדמות אפשרו לגרום לרשתות עצביות לפתח מגוון של מבנים מודולריים מוגדרים מראש 3 וללמוד את המאפיינים הפונקציונליים של רשתות עם טופולוגיות הוטלו 10. בפרט, שיטות שמשו לאחרונה לארגן רשתות על ידי הטלת מגבלות פיזיות 4,11. ואכן, כדי ללמוד את הקשר בין המבנה ותפקוד ברשתות עצביות ולספק ייצוג פשוט אך מתקבל על הדעת של אינטראקציה מכלולים עצביים, במבחנה מערכות אמורות לספק תת-אוכלוסיות עצביות בין המחובר. תרבויות הומוגני 2D נחקרו באופן נרחב עצביות לא להטיל מגבלות כלשהן על מרחבי החיווט מתהווה, באמצעות התארגנות העצמית של המעגלים. לכן גישה אפשרית לעצב אסיפות תא מלאכותי ביניהם היא למצב את האוכלוסיות עצביות שונות בירקאזורי ially מובחנים. המרחק בין האזורים אלה אינו מונע את הקשרים בין המכלולים. גישה זו, תוך הבטחת שליטה ניכרת על מורכבות רשת, הוכח לספק רפרטואר עשיר של דגמי סנכרון 6,7,12. על מנת להקל על culturing שחזור של מכלולים עצביים מודולרי, פרוטוקול להרכיב את הארגון העצמי של רשתות עצביות לאשכולות מקושרים על ידי אקסונים ודנדריטים מוצג ומתואר. מבנה פולימרים לבידוד הפיזי של תרבויות עצביות נוצר מpolydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS הוא אלסטומר בשימוש נרחב עבור יישומים ביו-רפואיים בשל biocompatibility, שקיפותה וחדירות לגזים 13. PDMS מוכן ולא נכלל בSU8 micromachined 2,075 14,15 מבנים על ידי PDMS נוזלי על &quot;אדון&quot;, כפי שתואר בעבר באל ג&#39;קמן et ציפוי ספין. 16 Tהוא השיג בדוגמת רשתות עצביות מורכבות ממודולים מחוברים בין גודל שונה והם התקבלו בהצלחה בשני coverslips ומערכי מיקרו אלקטרודה (MEAs) 17-20. הצפיפות של קשרים בין המודולים יכולה לשנות את התכונות של סנכרון הרשת, מרשת מסונכרנת באופן מלא, אופיינית לתרבויות אחידות, למדינות חולפות של סנכרון בין המודולים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Vacuum Chamber</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>5305-0609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine PDL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell - Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well culture plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8217;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA1060-Inv-BC</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC02</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>03-033-1c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>01-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Electrode Arrays 4Q</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td>
			<td>cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon wafer</td>
			<td>microchem</td>
			<td>SU8-2075</td>
			<td>Preparation protocol: www.microchem.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, surface treatment, cellular plating, and culturing of modular neuronal networks composed of functionally inter-connected circuits

המוח פועל באמצעות ההפעלה מתואמת והתקשורת הדינמית של מכלולים עצביים. שאלה פתוחה גדולה היא איך רפרטואר עצום של מוטיבים הדינמיים, העומדים ביסוד תפקודי מוח המגוונים ביותר, יכול לצאת מארגון טופולוגי ומודולרי קבוע של מעגלים חשמליים במוח. בהשוואה למחקרי in vivo של מעגלים עצביים המציגים קשיים ניסיוניים פנימיים, הכנות במבחנה מציעות אפשרות הרבה יותר גדולה כדי לתפעל ולחקור את התכונות מבניות, דינמיות וכימיות של מערכות עצביות ניסיוניות. עבודה זו מתארת ​​במבחנה מתודולוגיה ניסיונית המאפשר גידול של רשתות מודולרי הולחנו על ידי אסיפות מרחבית שונות, ביניהם מבחינה תפקודית עצביות. הפרוטוקול מאפשר שליטה הארכיטקטורה דו-ממדית (2D) של הרשת העצבית ברמות של מורכבות טופולוגי שונות. דפוסי רשת רצויים יכולים להיותהושג הן על מכסה מחליק רגיל ומערכי אלקטרודה מיקרו מצע מוטבע. מבני micromachined מוטבעים על פרוסות סיליקון ומשמשים ליצירת שבלונות פולימרים ביולוגית, אשר משלבות את התכונות השליליות של ארכיטקטורת הרשת הרצויה. סטנסילים מונחים על מצעי culturing במהלך הליך ציפוי פני השטח בשכבה מולקולרית לקידום הידבקות סלולרית. לאחר הסרת שבלונות, נוירונים הם מצופים והם יופנו באופן ספונטני לאזורים המצופים. על ידי הפחתת המרחק בין התא, ניתן להשיג מעגלים עצביים או מבודדים או מחוברים. כדי לקדם את הישרדות תא, תאי שיתוף תרבותיים עם רשת עצבית תמיכה הממוקמת בפריפריה של המנה התרבות. קלטות אלקטרו אופטיות של הפעילות של רשתות מודולרי המתקבלות על ידי שימוש בהתאמה מערכי מצע משובץ מיקרו אלקטרודה והדמיה סידן מוצגות. בעוד כל מודול תערוכות spontסינכרונים הגלובליים aneous, ההתרחשות של סנכרון בין-מודול מוסדר על ידי הצפיפות של חיבור בין המעגלים.

עובש SU8-2075 על פרוסות סיליקון בעובי תכונה של כ 100 מיקרומטר שימש לעצב את PDMS. הדפוס היה מורכב מריבועים של מספר ממדים, עם אורך צד ומרחק משתנים בין 200 ל 700 מיקרומטר (איור 1). הגודל של הכיכר נבחר כדי להתאים את שדה ראייה של 10X (לאיים עם אורך צד &lt;800 מיקרומטר) ושל מטרת 20X (לאי?...

Watch this Scientific Journal Video about Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits at JoVE.com

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.

עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

design-surface-treatment-cellular-plating-culturing-modular-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K Views.  Tel-Aviv University.  כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים ?...

Video: Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

מיפוי מעגלים עצביים מעכבים ידי Photostimulation סריקת הליזר

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

ניסויי נוירו-רובוטית לולאה סגורה כדי לבדוק את מאפיינים חישובית של רשתות עצבי

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...