אנו מודים למאט Parsek באוניברסיטת וושינגטון (סיאטל, וושינגטון) למתן פ aeruginosa וא זני coli ורוג&#39;ר נוקס באוניברסיטת קנטרברי (ניו זילנד) למתן גישה לתוכנת זרמים. עבודה זו נתמכה על ידי R01AI081983 מענק מהמכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. ההדמיה confocal בוצעה במתקן נורת &#39;ווסטרן הביולוגי ההדמיה (BIF).

התקנת תא 1. זרימה והרכבה הערה:. השתמש תא זרימת microfluidic כניסה כפולה למתואר בשיר et al, 2014 14 לגדול biofilms. תא זרימה זה מסוגל ליצור מעברי צבע כימיים חלקים מוגדרים היטב. עיצוב תא הזרימה מוצג באיור 1 וזרימת ייצור תאים תוארו בעבר בשיר et al., 2014 14. השיטות שלנו כאן פירוט על ידי שימוש P. aeruginosa וא coli כדי ליצור biofilms, אבל מינים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר. אנחנו השתמשנו P. aeruginosa PAO1- GFP, אשר constitutively מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כאורגניזם מודל לפיתוח biofilm. בנוסף, השתמשנו E. coli DH5α כדי ליצור biofilms מעורבים-מינים עם פ aeruginosa. P. aeruginosa וא coli זנים גדלו על צלחות אגר LB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את polydimethylsiloxane באמצעות תא זרימה (PDMS) הקשור לcoverslip זכוכית באמצעות טיפול פלזמה חמצן כפי שתואר ב -14. הממדים של חדר תא הזרימה הם 23 מ&quot;מ × 13 מ&quot;מ × 0.24 מ&quot;מ (אורך × רוחב × עומק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שונה מדיום גידול FAB 15. להתבונן צמיחת biofilm תחת שיפוע תזונתי בתוך תא הזרימה, להציג שונה FAB בינוני 15 עם גלוקוז 0.6 מיקרומטר בכניסה אחת ולהציג את מדיום FAB ללא כל מקור פחמן דרך פתח האחר. מסנן לעקר (גודל נקבובית = 0.2 מיקרומטר) מניית גלוקוז הפתרון (60 מ&quot;מ) לפני הוספתו למדיום FAB. גם חיטוי בינוני FAB עם מחזור 1 (נוזל, 15 דקות, 121 מעלות צלזיוס, 17 psi) לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מערכת הזרימה. לפני החיסון, חיטוי את כל נתיב הזרימה (בקבוקים בינוניים, צינורות, מלכודות בועה, תאי זרימה) באמצעות מחזור 1, פרט לשסתומי פלסטיק שלושה-כיווני (חד פעמי ומעוקר מראש) הממוקמים במעלה הזרם של תא הזרימה. (שסתומים שלוש דרכים המשמשים להזרקת התא גulture, נותב וmicrobeads ניאון.) כדי למנוע זיהום בזמן ההרכבה, לכסות את כל פתחי צינורות ומחבר ברדיד אלומיניום או שקיות החיטוי לפני מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מערכת הזרימה. להרכיב את הרכיבים של מערכת תא זרימה בזהירות (ראה וידאו להרכבת מערכת זרימה) ולספק מדיום גידול לתא הזרימה באמצעות משאבת peristaltic שדווקא שולטת בקצב הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבית תאי חיסון על ידי העברת מושבה של P. aeruginosa או E. coli מצלחות LB עד 3 מיליליטר של מרק LB ולנער את התרבות O / N ב 225 סל&quot;ד ו -37 מעלות צלזיוס. לדלל את O / תרביות תאי N ב 1 מיליליטר מים המעוקרים לOD סופי 600 = 0.01 כבידוד. (תרבות ולדלל את החיידקים בזרימה למינרית כדי למנוע זיהום.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויים עם biofilms מעורבים-מינים, לדלל שתי תרבויות חיידקים ליחס של 1: 1 ב 1 מיליליטר עם OD שווה 600 = 0.01 עבור כל חיידק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תא הזרימה. הזרק 1 מיליליטר של הבידוד לכניסת תא זרימה משסתום שלוש הדרך. לאחר ההזרקה, להשהות את הזרימה עבור שעה 1 כדי לאפשר לתאי חיידקים לצרף את מכסה הזכוכית. (ודא שתא הזרימה ממוקם בצד coverslip למטה כדי לאפשר לתאים מושעים להתיישב על coverslip.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לחדש את הזרימה ולשאוב את מדיום הגידול לתא הזרימה בקצב קבוע של 0.03 מיליליטר / דקה עבור כל כניסה במשך 3 ימים. </li></ol> 2. אפיון Biofilm פיתוח בתגובה לGradients התזונתי באמצעות מיקרוסקופיה confocal הערה: פ aeruginosa ניתן הדמיה עם GFP constitutively-הביע, אבל E. coli בbiofilms מעורב-מינים חייב להיות צילם על ידי counterstaining. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב biofilms 3 הימים באמצעות מיקרוסקופ confocal. לקבלת תוצאות הנציג, להתבונן biofilms באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 63X. לפני ההדמיה, סימןתא זרימת כניסה הכפול לעם רשת בצד מכסה הזכוכית. (המטרה של רשת זו היא לאפשר לניסוי כדי לאתר את אזורי ההדמיה בתוך תא תא זרימה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לcounterstain, לדלל 10 μl של כתם תא-permeant אדום ניאון חומצות גרעין, כגון כתם ירוק ניאון גרעין חומצה כגון STYO 62, פתרון מניות (1 מ&quot;מ) ב990 μl מעוקר מים ואז מזריק את הכתם בדילול באמצעות מזרק לתוך לאט תא תא זרימה משלוש דרך השסתום במעלה הזרם. שמור את תא הזרימה קופא על שמריו ובחושך במשך 30 דקות, ולאחר מכן לחדש את הזרימה כדי לשטוף את הכתם מאוגד במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה confocal. הפעל את לייזר 488 ננומטר ארגון לעירור ופליטת איסוף ערוצים לGFP (500-535 ננומטר) וכתם חומצות גרעין (לכתם חומצה ירוק ניאון גרעין, 650-750 ננומטר). התאם רווחים וקיזוז בשני הערוצים יש תמונות בהירות ונקיות. xyz בחר ומצב הדמיה בו זמנית. השתמש בכפתור z-השליטה לIDENתצדיק את התחתית והחלק העליון של biofilm בתחום. הגדר את z-הצעד לרמה של 0.5 מיקרומטר לרכישת מחסנית תמונה 3-D. (כדי להבטיח איכות תמונה גבוהה, להשתמש ממוצע שורה של ארבע לרכישת תמונה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למפות את הדפוסים המרחבי של פיתוח biofilm בתוך תא הזרימה, biofilms תמונה בשלוש או יותר אורך (x) מרחקים לאורך כניסת תא זרימה, ובשלוש רוחבי (y) ממקם יחסית לשיפוע התזונתי שהוטל, כפי שמוצג באיור 1 . </li></ol> 3. אפיון הפנימי מומסת תחבורה על ידי זריקות של הקונסרבטיבי פלורסנט Tracer הערה: נותב ניאון שמרני, כגון Cy5, ניתן להשתמש בו כדי לאפיין את דפוסי תחבורה מומסת בתוך biofilm. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר Cy5 (Mono-reactive NHS אסתר) במים לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מיליליטר כפתרון מניות. אחסן את פתרון מניות Cy5 ב-20 ° C במקפיא. הערה: כCy5 הוא אור-sensitive, חנות, לדלל ולהזריק פתרונות Cy5 בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקות של נותב הניאון, לקחת ערימת 3-D תמונה של biofilm 3 הימים עם מיקרוסקופיה confocal (עם מטרת 63X). (אזורים רחבים של מושבות biofilm הם אידיאליים עבור תצפיות בזמן סדרה של תחבורת צבע.) כמו כן לבחור z-מטוס עם מושבות מופרדות היטב להדמיה (כפי שמוצג באיור 5 א &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ניסוי הזרקת Cy5, לדלל 2 μl של פתרון מניות Cy5 ב998 μl מעוקר מים להניב פתרון הזרקה יש ריכוז Cy5 של 20 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה כדי להשהות את הזרימה ולהזריק את פתרון Cy5 לזרם של תא הזרימה באמצעות מזרק דרך שסתום 3-הדרך. (זה חשוב כדי למנוע בועות אוויר מלהיכנס לנתיב הזרימה תוך הזרקה. צריכה להישמר מלכודות בועה פתוחות במהלך ההזרקה בחזרה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקת פתרון Cy5, לסגור את מלכודות הבועה, להתאים את שסתום 3-בדרך, והפעל מחדש אתלשאוב כדי לספק את פתרון Cy5 מוזרק לתוך תא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב הדמיה confocal לxyt. הפעל ערוצי Cy5 וGFP תחת מצב הדמיה בו זמנית. התאם את הגדרות confocal על עוצמת Cy5 (עוצמת לייזר, להרוויח וקיזוז), כדי למנוע להרוות אותות, שהוא קריטי לכימות. (החלטה זמנית גבוהה עדיפה להמחשת חדירת צבע. עם זאת, סריקה מהירה מקטינה את איכות תמונה.) בחר את מהירות סריקה נכונה וממוצע קו כדי לאזן את הזמן ברזולוציה של הדמיה ואיכות התמונה. לפרוטוקול זה משתמש בממוצע שורה של ארבע ומסגרת שיעור של 0.15 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדש את הזרימה לספק Cy5 לתוך תא הזרימה (עדיין בקצב זרימה של 0.03 מיליליטר / דקה). במקביל יתחיל הדמיה confocal זמן סדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת חדירת Cy5 ידי רדיאלית ממוצע עוצמת Cy5 בתוך מושבה biofilm עגולה 2-D. בממוצע, ראשון לזהות את קצה אשכול biofilm, לאחר מכן ליצור מפת מרחק לסעיף 2-D של האשכול, ובסופו דפוסי רדיאלי הממוצע של עוצמות Cy5 כדי ליצור עקומת חדירה (ראה איור 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לממש את המחשוב צעד 3.8, להשתמש BioSPA (ניתוח תבנית Biofilm מרחבי) חבילת תוכנה (, חבילת תוכנה שלא פורסם ומדריך לזמין על פי בקשה) או תוכניות ניתוח תמונה אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש בBioSPA, לייבא ראשון תמונה שנקבעה לBioSPA. לאחר מכן, בחר סף ראוי לערוצי GFP וCy5 כדי להפוך את התמונות בינארי. בתפריט ניתוח / חישוב, בחר מתקדם ניתוח ולאחר מכן ניתוח דיפוזיה. השתמש בערוץ ה- GFP להגדיר את הקצה של אשכול ולהשתמש בכלי המצולע כדי לבחור אשכול אחד כמו האזור של העניין (ROI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על אשכול biofilm נבחר לבצע ניתוח דיפוזיה. שמור את תוצאות ניתוח דיפוזיה ולכייל עוצמת Cy5 לריכוז Cy5 באמצעות עקומת כיול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור עקומת כיול ריכוז Cy5, למדוד עוצמות Cy5 על conce Cy5שיפוע ntration תחת מיקרוסקופ confocal. (עוצמת Cy5 וריכוז יש קשר ליניארי.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. אפיון שדה הזרימה סביב ידי מעקב פלורסנט חלקיקים הערה: חלקיקי פלורסנט, כגון microbeads פלורסנט, יכול לשמש כדי לאפיין את שדה הזרימה סביב biofilms. שדה זרימה סביב biofilms ניתן לחשב מהתצפיות בזמן שורה של תפקידי חלקיקים באמצעות תוכנת velocimetry מעקב אחר חלקיקים. התוצאות מוצגות כאן התקבלו עם זרמי 2.02 תוכנת חבילת 16 (להורדת תוכנה והמדריך למשתמש זמין <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">בhttp://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml).</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את microbeads הניאון (קוטר ~ מיקרומטר 1) במים מעוקרים לריכוז סופי מוצק של 0.2% ונפח סופי של 0.5 מיליליטר. מערבולת לוודא כי microbeadsהם התפזרו גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק ולספק את microbeads פלורסנט המדולל לתוך תא הזרימה בעקבות הליכים מצעדים 3.3-3.5. כדי לאפשר מעקב מדויק של מסלול החלקיקים, השתמש קצב זרימה נמוך יחסית (0.01 מיליליטר / שעה לתוצאות מעקב חלקיקים במאמר זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור הגדרות confocal לxyt מצב כדי לעקוב אחר תנועת חלקיקים בz-פרוסה אחת ולקחת תמונות בזמן סדרה. (במסגרת שיעור של 1 הרץ שימש לתוצאות הנציג שמוצגים במאמר זה.) הזרקת חלקיקים חזרו ותמונה במקומות שונים z לייצר תזרים שדה 3-D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום תהליך בזמן הסדרה תמונות confocal על ידי הפחתת אות הקרינה רקע (אות בתמונה נרכשה הראשונה של סט התמונה) באמצעות ImageJ (להורדת תוכנה ומדריך לנגיש <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">בhttp://imagej.nih.gov/ij/)</a> או תוכניות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בImageJ, לפתוח את התמונה הראשונה של קבוצת תמונה ולאחר מכן לייבא את סט התמונה. במסגרת הליך / תמונה Calculator, לחסר את התמונה הראשונה מסט התמונה. שמור את סט דימוי מעובד מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את זרימת וקטורים, תמונות confocal זמן סדרת יבוא בזרמים 2.02. תחת &quot;תצוגת תהליך פתוחה&quot;, לבחור ולבצע &quot;זהה את החלקיקים&quot;. השתמש סף ראוי לזהות חלקיקים. השתמש 0.5 ו -5 מיקרומטר כספי מינימום וקוטר מרבי ל1 מיקרומטר חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, תחת &quot;תצוגת תהליך פתוחה&quot;, לבחור ולבצע &quot;צינור ניתוח PTV&quot; כדי ליצור נתיבי חלקיקים. בדקו את נתיבי חלקיקים כדי לראות אם הם מייצגים תנועת חלקיקים. לבסוף, בחר ולבצע &quot;צור שדה מהירות&quot; כדי ליצור מפת זרימת וקטור. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li><li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease.">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms.">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+A+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li><li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure.">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear:+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology.">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li><li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk/biofilm+interface.">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Convection+around+biofilms.">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorption+sites+in+biofilms.">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms.">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li><li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers.">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li><li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells.">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel.">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms.">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li><li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm.">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li><li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs.">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport.">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li><li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge.">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions.">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin.">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li><li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection.">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנחנו הוכיחו חבילה של שיטות כדי לאפיין שלוש אינטראקציות biofilm-סביבה חשובות: תגובת biofilm הדרגתי כימי, השפעות של צמיחת biofilm על זרימת מייקרו-הסביבה שמסביב, וההטרוגניות biofilm כתוצאה ממגבלות תחבורה פנימיות. אנחנו הראיתי לראשונה את השימוש ...

מיקרואורגניזמים לצרף למשטחים וbiofilms טופס - אגרגטים תא סגורים במטריצה ​​תאית-פולימר 1. Biofilms להתנהג בצורה שונה מאוד מתאי חיידקים בודדים, כי יש לי biofilms ההטרוגניות המרחבית דרמטית כתוצאה משילוב של מגבלות תחבורה מומסת הפנימיות ווריאציות מרחבית בחילוף חומרים תאיים 2,3. ריכוזי חמצן וחומרים מזינים להקטין באופן דרסטי בממשק שבין biofilm והסביבה נוזל ומתמעט נוסף בתוך בbiofilm 2. וריאציות מרחבית בנשימת biofilm וסינתזה של חלבון יכולות להתרחש גם כתגובה לחמצן מקומי וזמינות חומרי מזון 2. בסביבות מימית ואדמה, רוב החיידקים שוכנים בbiofilms. biofilms הטבעי לבצע תהליכים חשובים biogeochemical כולל רכיבה על אופניים פחמן וחנקן והפחתת מתכות 4,5. מבחינה קלינית, היווצרות biofilm היא responsידיהם לריאות ממושכות וזיהומים בדרכי שתן 6. הזיהומים הקשורים biofilm הם בעייתיים מאוד, כי יש לי תאים בbiofilms גבוהה מאוד התנגדות לאנטיביוטיקה בהשוואה לעמיתיהם הפלנקטון 6. בגלל biofilms חשוב בהגדרות שונות, כמות משמעותית של מחקר התמקדה בהבנת הגורמים הסביבתיים השולטים פעילויות biofilm וההטרוגניות המרחבית בbiofilms ומייקרו-הסביבה שמסביב. מחקרים קודמים מצאו כי פיתוח biofilm מוסדר מאוד על ידי מספר הגורמים סביבתיים: biofilms לפתח מורפולוגיות שונות תחת תנאי זרימה שונים; חמצן וbiofilm השפעת זמינות חומרי מזון מורפולוגיה; ומאמץ גזירה הידרודינמית משפיע על הקובץ המצורף של תאי פלנקטון למשטחים והניתוק של תאים מbiofilms 7-9. יתר על כן, זרימת מצב חיצוני משפיע על המשלוח של int מצעיםo ובתוך biofilms 10. הצמיחה של biofilms גם משנה מקיפה תנאים פיזיים וכימיים. לדוגמא, צמיחת biofilm מובילה לדלדול המקומי של חמצן וחומרים מזינים 2; biofilms לצבור תרכובות אורגניות ואורגניות מהסביבה 11; ואשכולות biofilm להסיט חיכוך זרימה ומשטח עליית 12,13. בגלל biofilms אינטראקציה עם סביבתם סביבה בדרכים מורכבות מאוד, זה קריטי כדי להשיג מידע על מאפייני biofilm ותנאים סביבתיים בו-זמנית, וגישות רב-תחומיות צריכים לשמש כדי לאפיין באופן מקיף אינטראקציות biofilm-סביבה. כאן אנו מציגים סדרה של שיטות משולבות לאפיון דפוסים מרחביים בהתפתחותם של חיידקים בתוך מונו-מינים וbiofilms כפולים מינים תחת שיפוע תזונתי שהוטל, ולצפות בשינוי של כימי המקומית ומייקרו-סביבת נוזל וכתוצאה מכך. אנו אשוחרח &#39;מתאר את השימוש של זרימת microfluidic תא כניסה כפולה לפותח לאחרונה להתבונן צמיחת biofilm תחת מילויים כימיים מוגדרים היטב. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש בתא זרימת microfluidic זה להתבונן הצמיחה של שני מינים של חיידקים, Pseudomonas aeruginosa וEscherichia coli, בbiofilms תחת מגוון של תנאים תזונתיים. אנו מראים כיצד בהדמיה באתרו של התפשטות נותב ניאון למושבות biofilm ניתן להשתמש כדי להעריך כמותית דפוסי התחבורה מומסת בbiofilms. לבסוף, אנו מראים כיצד velocimetry מעקב חלקיקים המיקרוסקופי, שבוצע תחת מיקרוסקופ confocal, יכול לשמש כדי לקבל שדה זרימה מקומי סביב biofilms גדל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

Biofilms קהילות חיידקים מצורף משטח שיש לי מבנים מורכבים ולייצר heterogeneities מרחבי משמעותי. פיתוח biofilm מוסדר בחום על ידי הזרימה סביב והסביבה תזונתית. צמיחת biofilm גם מגדילה את ההטרוגניות של מייקרו-הסביבה המקומית על ידי יצירת שדות זרימה מורכבות ודפוסי תחבורה מומסת. כדי לחקור את הפיתוח של ההטרוגניות בbiofilms ואינטראקציות בין biofilms ומיקרו-בית הגידול המקומי שלהם, שגדלנו biofilms מונו-מינים של Pseudomonas aeruginosa וbiofilms כפולים מינים של P. coli aeruginosa וEscherichia תחת הדרגתיים תזונתי בתא זרימת microfluidic. אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליצירת שיפועים מזינים בתוך תא הזרימה ולגידול והדמית פיתוח biofilm בתנאים אלה. אנחנו גם פרוטוקולים הנוכחיים לסדרה של שיטות אופטיות לכמת תבניות המרחביות במבנה biofilm, לזרום distributions על biofilms, ותחבורה המונית סביב ובתוך מושבות biofilm. שיטות אלו תומכות חקירות מקיפות של הפיתוח המשותף של ההטרוגניות biofilm ובית גידול.

תא זרימת כניסה הכפולה לmicrofluidic מאפשר תצפית של צמיחת biofilm תחת שיפוע כימי מוגדר היטב שהוקם על ידי ערבוב של שני פתרונות בתוך תא הזרימה. השיפוע הכימי וכתוצאה מכך נצפה בעבר על ידי הזרקת צבע ומאופיין בפירוט על ידי et al שיר. 14. הדרגתיים ריכוז חלק נוצרו בכיוון הרוחבי, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity at JoVE.com

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Views.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

Video: Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To this end, our laboratory has applied the principles of nanomedicine to simplify ART regimens and as such reduce toxicities while improving compliance and drug pharmacokinetics. Simple and reliable methods for manufacturing nanoformulated ART (nanoART) are shown. Particles of pure drug are encapsulated by a thin layer of surfactant lipid coating and produced by fractionating larger drug crystals into smaller ones by either wet milling or high-pressure homogenization. In an alternative method free drug is suspended in a droplet of a polymer. Herein, drug is dissolved within a polymer then agitated by ultrasonication until individual nanosized droplets are formed. Dynamic light scattering and microscopic examination characterize the physical properties of the particles (particle size, charge and shape). Their biologic properties (cell uptake and retention, cytotoxicity and antiretroviral efficacy) are determined with human monocyte-derived macrophages (MDM). MDM are derived from human peripheral blood monocytes isolated from leukopacks using centrifugal elutriation for purification. Such blood-borne macrophages may be used as cellular transporters for nanoART distribution to human immunodeficiency virus (HIV) infected organs. We posit that the repackaging of clinically available antiretroviral medications into nanoparticles for HIV-1 treatments may improve compliance and positively affect disease outcomes.

Nanoparticles of indinavir, ritonavir, efavirenz and atazanavir were manufactured using wet milling, homogenization and ultrasonication. These nanoformulations, collectively termed nanoformulated antiretroviral therapy (nanoART), assessed macrophage-based drug delivery. Monocyte-derived macrophage nanoART uptake, retention and sustained release were determined. These preliminary studies suggest the potential of nanoART for clinical use.

שיטות פיתוח תובלה דם ברנה macrophage של תרופות תרופתי Nanoformulated

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

שיטות העצמי הוא השילוב של Biopolymers Megamolecular על ממשק האוויר-LC הייבוש

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

התקני שדה חשמליים ומגנטיים לגירוי רקמות ביולוגיות

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...