We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-&#945;4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH פרסומי מס &#39;80-23, מתוקן 2012) ולימודים אושרו על ידי מוסדי טיפול בבעלי חיים והשתמשו לועדות מחקר בסטוני אוניברסיטה ברוק (# -1618 ו# 1792). 1. vHipp-nAcc Synaptic שיתוף תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי קורבן (יום לידה 0 - 3, מwild-type (WT) או nAChRs α7 קו עכבר מהונדס) עם CO 2. לערוף כל גור ולשמור את הזנב בצינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגות לgenotyping בדיעבד. בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק העליון של הגולגולת עם מספריים ומלקחיים כדי לחשוף את המוח כולו. החל בצומת שבו הקורטקס המוחי חלק מcaudally אחר, להשיג סעיף עטרה המכיל את קליפת המוח האחורי כולל vHipp 5,21 תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נ &#39;רצועות באוקטובר יהוה רקמה המכילות את אזור CA1-subiculum לפי אטלס מוח עכבר 22 (איור 1 א) פיתוח. העברה לצלחת תרבות 35 מ&quot;מ המכילה תקשורת הקרה תרבות (4 מעלות צלזיוס), לחתוך לפרוסות דקות קטנות (סביב 100 מיקרומטר × 100 מיקרומטר microslices). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירה פולי-D ליזין / coverslips זכוכית מצופה laminin 12 מ&quot;מ בתוך 24 צלחות תרבית רקמה טובות עם תקשורת ותרבות (~ 500 μl) לפחות 30 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס. הסר תקשורת לפני ציפוי microslices. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עם פיפטה פסטר אש מלוטשת במרכז coverslip עם כמות מינימאלית של תקשורת (~ 50 μl, המכילה ~ 20 חתיכות של microslices) כדי להקל על התקשרות של explants. microslices vHipp צלחת שמקורם בבעלי חיים בודדים (או + / + או - / - גנוטיפ של קו α7 המהונדס) על כל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר explants להתיישב על coverslip, בעדינות להוסיף מדיה נוספת (~ 100 μl) על ידי הקיר דואר, כך שרמת התקשורת גבוהה מספיק כדי לכסות את explants בפריפריה לחלוטין, אבל לא אלה שבמרכז coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה O / N 37 ° C, 5% CO 2 באינקובטור, לפזר נוירונים nAcc מימים עובריים 18 לעכברי WT יום 1 לאחר לידה ולהוסיף לexplants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רקמות nAcc לפי אטלס פיתוח מוח עכבר 20 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך לחתיכות קטנות (כ -500 מיקרומטר × 500 מיקרומטר microslices) ולהעביר צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק עם טריפסין 0.25% (2 מיליליטר) במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לשטוף נתחי רקמות שלוש פעמים עם תקשורת כביסה קרה (5 מיליליטר, 4 ° C) ואחריו לשטוף אחד בתקשורת והתרבות הקרה (5 מיליליטר, 4 ° C). לאפשר השעיה לנוח במשך 5 דקות בכל שלב לשטוף, ואז לשפוך את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים על ידי טחינה דקה עדינה ב 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות עם פיפטה פסטר קל אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transהשעיה תא FER לעוד צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 סל&quot;ד x למשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים בתקשורת והתרבות ב1 מיליליטר לכל 6 גורים. לפזר תאים על ידי pipetting בעדינות בתקשורת כמה פעמים עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.25 מיליליטר של תאי nAcc התפזרו לכל coverslip עם explants vHipp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התרבויות ב37 ° C humidified, 5% CO 2 באינקובטור. הנח צלחות תרבות על פדה גזת סטרילי לחה כדי לייצב מכאני ולשמור על לחות, להקל היווצרות סינפסה. </li></ol></li></ol> 2. Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) ב -4% סוכרוז paraformaldehyde / 4% / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 20 דקות, RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Permeabilize עם 0.25% Triton X-100 / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות, RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות בלוק עם 10% חמורים בדם נורמלי בPBS (~ 500 μl לכל coverslip, 30 דקות, RT) לפני antibodצביעת y. דגירה עם נוגדנים עיקריים O / N ב 4 ° C. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: nAChRs אנטי (α 4 -ECD 1: 500; אנטי-α 5 יחידות משנה, 1: 500), טרנספורטר גלוטמט אנטי-לפוחי 1 (1: 250), אנטי-GAD65 (1: 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נוגדנים ראשוניים עם PBS (3 פעמים / ~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות) ולאחר מכן דגירה תרבויות בנוגדנים משני מצומדת לAlexa 488 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 500) או Alexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip , 1: 500) לשעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות בαBgTx מצומדת לAlexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 1,000 בתקשורת והתרבות) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני הקיבוע לα7 משטח תיוג * nAChRs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips הר והחותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצוידים ביעדי התכנית-Apochromat (20X עם 0.8 NA או שמן 63X עם 1.4 NA) ומצלמת CCD. </li></ol> 3. FM1-43 מבוסס לפוחי Fusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) בחדר הדמיה, הר קאמרי על ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק. ברציפות perfuse (1 מיליליטר / דקה) עם קוקטייל HBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק תרבויות זלוף ועומס עם 10 מיקרומטר FM1-43 ב -56 מ&quot;מ K + ACSF (~ μl 500) למשך 90 שניות (צביעה), לשטוף צבע חיצוני משם במשך 15 דקות עם Ca 2 + HBS החופשי המכיל ADVASEP-7 (0.1 מ&quot;מ) כדי לחפש FM1-43 קרום הנכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את התרבויות עם 56 מ&quot;מ K + ACSF (~ 500 μl) ללא FM1-43 עבור 120 שניות (destaining), טען תרבויות עם FM1-43 באמצעות אותם התנאים, ולשטוף שוב עם Ca 2 + HBS חופשי המכיל ADVASEP-7 ל 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש FM1-43 תמונות הקרינה עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב מצוידים במטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטת 530 ננומטר) וללכוד תמונות עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות הקרינה FM1-43 בסיס (כל 2 של דקות 1) כשליטה מראש ניקוטין; תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 2 שניות למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את עוצמת הקרינה לפני FM1-43 (צביעת F) ואחרי (destaining F) יישום ניקוטין בכל אוטון הסינפטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב סכום כולל של הקרינה FM1-43 releasable לאורך האקסונים vHipp ידי כימות ההבדל של עוצמת הקרינה FM1-43 לפני ואחרי יישום ניקוטין (ΔF = destaining -F צביעת F). לנתח כל חלק של ירידת עוצמת הקרינה לאחר ניקוטין עם המשוואה הבאה:% מכתים = ΔF / F F ירידה. </li></ol> הדמיה 4. סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) במהירות עם HBS הנורמלי, לאחר מכן טען תרבויות עם 5 מחוון מיקרומטר Fluo-4 Ca 2 + (אסתר בבוקר) ושל 0.02% pluronic F-127 בHBS (2 מיליליטר) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פתרון Fluo-4 עם HBS (3 פעמים / 5 דקות). חזור תרבויות לחממה (37 CO / 5% מעלות צלזיוס 2) לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות באותו תא ההדמיה ואותם תנאים כפי שתואר בסעיף FM1-43 היתוך לפוחי מבוסס (ראה שלב 3.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות Fluo-4 הקרינה של תחזיות axonal ממייקרו-פרוסות vHipp עם מטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטה 530 ננומטר) ומצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות הקרינה Fluo-4 בסיס (כל 10 שניות למשך 2 דקות) כשליטה מראש ניקוטין, תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 10 שניות למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את כל המסגרות של התמונות גולמי fluo-4 הקרינה, יצוא כסדרה שלתמונות בפורמט TIFF לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את עוצמת המשולבת של fluo-4 הקרינה לאורך האקסונים vHipp לפני ואחרי יישום ניקוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל עוצמת הקרינה משולבת עם המשוואה הבאה: ΔF / F 0 = (FF 0) / 0 F, כאשר F 0 הוא עוצמת הקרינה משולבת מראש ניקוטין מתוקן רקע וF הוא עוצמת הקרינה המשולבת לאורך האקסונים vHipp בכל נקודת זמן לאחר יישום ניקוטין. לנתח ולתכנן עוצמת הקרינה משולבת מנורמלת. </li></ol>

<ol>
	<li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+nicotinic+receptors:+structure+and+regulation,+role+in+learning+and+reinforcement.">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li><li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function.">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li><li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system.">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li><li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+receptors+and+depression:+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis.">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li><li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons.">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719 (2013).</li><li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors.">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li><li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine.">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li><li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms.">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li><li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms.">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li><li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action.">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911 (2011).</li><li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus.">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li><li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold:+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7*+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li><li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits:+effects+of+localization,+trafficking,+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons.">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li><li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+trafficking,+pentameric+assembly,+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits.">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological,+pharmacological,+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons.">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li><li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling.">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li><li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals.">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+alpha4*+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin:+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine.">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors.">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li><li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li><li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , (1998).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li><li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals.">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li><li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus.">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li><li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus.">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li><li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2++dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons.">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הכנת שיתוף התרבות מתוארת מחדש נכנע מעגלים בהיפוקמפוס-נסמכים הגחון במבחנה. בחינת היתרי הכנה פשוטה יחסית ואמינה זה של פרופילי מרחב ובזמן שבו הפעלה של nAChRs מראש הסינפטי לעורר משופרת שידור glutamatergic 5, 21. שיתוף תרבויות מוגדרות כצמיחת סוגי תאים ספציפיים שונים של במנה אחת שיכול לספק תנאים פיסיולוגיים במבחנה להפגין in vivo דמוי פונקציה. שיתוף תרבויות נוירון נוירון קונבנציונליים הוכנסו למחקר במדעי מוח לחקר האינטראקציות הסינפטי בין סוגי תאים שונים. עם זאת, קשה לזהות לפני ואחרי אתרים של סינפסות בשיתוף תרבויות אלה. פרוטוקול שיתוף תרבות נוירון ניתק microslice זה מאפשר זיהוי קל של אקסונים מראש הסינפטי ומטרות פוסט-סינפטי. microslices שימוש מאזורי המוח שונים oקו עכבר מהונדס F להביע חלבוני ניאון שונים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד אינטראקציות האקסון האקסון. השלב הקריטי של פרוטוקול שיתוף תרבות נוירונים ניתק microslice זה מספק סביבה יציבה, כדי לאפשר את הקובץ המצורף של explants, תולדה של התחזיות והיווצרות של סינפסות. ציפוי microslices בנפח מינימאלי של תקשורת ושמירה על תרבות הצלחות על פדה גזת סטרילי לחה הן שני השלבים העיקריים לקובץ מצורף microslice והיווצרות סינפסה. המגבלה העיקרית של פרוטוקול שיתוף תרבות זו היא שנוירונים nAcc לא כל מפוזרים יוצרים סינפסות פונקציונליות עם אקסונים vHipp. על ידי שינוי גנוטיפ של הרכיבים סינפטיים לפני ואחרי, הכנה זו מספקת גישה אינפורמטיבי ללמוד את המנגנונים לפני ואחרי-סינפטי של פלסטיות הסינפטית. שלוש תכונות ייחודיות של הכנה זו להפוך אותו אידיאלית ללימודים אלה. r המוחegions שבדרך כלל קשורים בvivo באמצעות נתיבי סיבים שלא יכול להישמר, או מזוהה בקלות בפרוסות חריפות, יכול להיות משולב במבחנת הכנה זו. לפני ורכיבי פוסט-סינפטי מגיעים מעכברים שונים הופכים מאפשרים שינוי עצמאי של כל אחד לפני או גנוטיפ פוסט-סינפטי. על ידי ציפוי רכיבים לפני ואחרי-סינפטי בזמנים שונים, שאפשר לבטא גנים אקסוגניים באו מראש או נוירונים פוסט-סינפטי באופן סלקטיבי. ניקוטין מושרה Ca 2 + ארעיים (בשניות למגוון דקות) על ידי הפעלה של nAChRs דווח בנוירונים בתרבית, האסטרוציטים ובכמה שורות תאים המבטאים nAChRs 25-27. עם זאת, רוב המחקרים הללו לא לזהות את ההשפעות ארוכת הטווח (מעל 10 דקות) של חשיפה לניקוטין זמן קצר בעיקר בשל נזק תמונה במהלך הדמיה לטווח ארוך. על ידי שימוש בפרוטוקול התרבות שתואר לעיל ואוסף תמונת confocal ספינינג-דיסק מהיר,איתות ניקוטין מושרה Ca 2 +, איחוי שלפוחית ​​הסינפטית ושחרור גלוטמט ניתן להקליט במשך שעה עד 1 ללא כל נזק נראה לעין לתאי העצב (סרט נוסף 1, 2).

אפנון כולינרגית של רגישות מעגל תורם להיבטים בסיסיים של הכרה, ואפנון כולינרגית שינה הוא תכונה של הפרעות ניווניות ונוירו-פסיכיאטריים, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סכיזופרניה והתמכרות 1-4. מנגנון שנקבע בהנחיית כולינרגית של שידור הסינפטי במערכת העצבים המרכזית הוא באמצעות הפעלה ישירה של nAChRs המקומי באתרים מראש הסינפטי. הפעלה של קולטנים מראש הסינפטי אלה מובילה לעליית 2 + (i [Ca 2 +]) במסופים מראש הסינפטי Ca תאיים - הן במישרין, בשל מוליכות סידן גבוהות יחסית של תת מסוימים nAChR, ובעקיפין, באמצעות מפלי איתות תאיות 5, ובכך משפרים את שחרור הנוירוטרנסמיטר. למעשה, ההפעלה של nAChRs מראש הסינפטי נקשרה עם שינויים בשחרור של מגוון רחב של נוירוטרנסמיטורים כוללים גלוטמט, GABA, ACH,דופמין ND 6-10. למרות שתהליך זה נחקר באופן עקיף באמצעות שיטות אלקטרו בהסינפסות שונות, כתבים אופטיים של [Ca 2 +] i ומחזור שלפוחית ​​סינפטית לאפשר מדידה ישירה ובזמן מדויק יותר של תופעות קדם-סינפטי. לוקליזציה טרום הסינפטי של nAChRs הודגמה באופן משכנע עם תיוג חיסוני זהב ישיר של nAChRs במיקרוסקופי אלקטרונים (EM) רמת 11,12. כמה טכניקות אחרות יש גם שימשו לטיפול בלוקליזציה nAChR בעקיפין, לרבות מיקומים של מפלצות חלבון פלואורסצנטי subunit- nAChRs גילוי בנוירונים בתרבית 13,14, הקלטת אלקטרו של זרמי nAChR במסופים הסינפטי 15,16, מעקב אחר שינויי ניקוטין מושרה ב[ Ca 2 +] i במסוף עצב הסינפטי על ידי הדמיה לחיות תא 17, וניטור עקיף של שחרור הנוירוטרנסמיטר במסוף הסינפטי על ידיטכניקות הדמיה תא חיות עם אינדיקטורים ניאון, כולל exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית שנצפה על ידי צבעי styryl amphipathic FM (FM1-43 וFM4-64) ו / או synapto-pHluorin ועל ידי כתבים ספציפיים ניאון עצבי, כגון CNiFERs לאח וiGluSnFr לגלוטמט 18-20. בסך הכל, גישות הנוכחיות אלה לזיהוי לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs הן מסובכות, ודורשות מערכות וטכניקות מיוחדות כדי לאפשר זיהוי אמין וניטור פיסיולוגי של פעילות טרום-סינפטי. כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד למערכת שיתוף תרבות במבחנה של היפוקמפוס הגחון (vHipp) - גרעין נסמך (nAcc) מעגל המספק גישה ישירה לזהות ולנתח את שני מרכיבים של לפני ואחרי-סינפטי של העברת הסינפטית. אנחנו מראים דוגמאות של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs והדמית התא החי של nAChR תיווך Ca 2 + ALO איתות ושחרור הנוירוטרנסמיטרהאקסונים ng vHipp. המשך טבעי (וברור) של הפרוטוקול המובא כאן הוא ההכנה של אנשי קשר לפני ואחרי-סינפטי המורכב מתאי עצב מגנוטיפים שונים. באופן זה את התרומה של מוצר גן מסוים למראש ו / או פוסט-סינפטי מנגנונים של אפנון ניתן להעריך באופן ישיר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1, Culture Media (50 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10888022</td>
			<td>48 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplements</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>0080085-SA</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10908-010</td>
			<td>0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2, washing media (HBSS, 100 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>99 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES ( 1M)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630-130</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3, HEPES buffered saline&#160; (HBS)&#160;&#160; pH=7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888&#160;</td>
			<td>135 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266&#160;</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375&#160;</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500&#160;</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888&#160;</td>
			<td>135 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266&#160;</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375&#160;</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500&#160;</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrodotoxin&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td>2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicuculline</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>131</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-AP-5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>105</td>
			<td>50 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1045</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY341495</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1209</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5, Calcium-free&#160; HBS&#160;&#160; pH=7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888&#160;</td>
			<td>135 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266&#160;</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375&#160;</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500&#160;</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>119 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td>56 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td>1.3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td>2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>26.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500&#160;</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of nicotine induced calcium signaling and neurotransmitter release along ventral hippocampal axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

ההכנה המועסקות מורכבת משיתוף תרבויות גן chimeric של מעגלי vHipp-nAcc במבחנה. תחזיות נובעות מmicroslices vHipp, כקלט axonal מראש הסינפטי, יכולות ליצור קשרים סינפטיים עם מטרות פוסט-סינפטי, תאי העצב המפוזרים מnAcc. ניקוטין מושרה סיוע מתמשך (≥ 30 דקות) של שידור glutamatergic מהנוירונים nAcc מעוצבבים על ידי vHipp האקסונים 21 וממושך סידן איתות לאורך האקסונים vHipp 5 באמצעות α7 מראש הסינפטי * nAChRs. איור 1 מדגים ישירות שהתחזיות ממייקרו-פרוסות vHipp הן glutamatergic (vGluT1 חיובי) ושקשר נעשים עם נוירונים קוצניים מפוזרים GABAergic בינוניים מnAcc (GAD חיובי, איור 1 ג, ד). nAChRs שני * α7 ולא α7 * (כולל תת-יחידות α4 וα5) נמצא לאורך האקסונים vHipp (איור 1E-G) ובמיוחד באתריםהיכן השלכות vHipp קשר עם הנוירונים nAcc. יש לציין כי תאי עצב מפוזרים מnAcc לא להביע nAChRs α7 * (איור 1H); כלומר אשכולות קולט באנשי קשר הם בהחלט presynaptic (איור 1 ט), גם ראה איור 1 בהפניה 5. ברגע ששיתוף תרבויות chimeric הוקמו, הדמיה חיה של [Ca 2 +] i והסינפטי שלפוחיות היתוך לאורך האקסונים vHipp עם ו / או בלי ניקוטין ניתן להקליט עד 30 דקות ללא כל נזק נראה לעין לתאים העצב. נציג תמונות, סרטי הזמן לשגות וquantifications למושרה ניקוטין fluo-4 [Ca 2 +] אני איתות לאורך האקסונים vHipp מוצגות באיור 2 ומשלימת סרט 1 ו -2. מצאנו כי ההפעלה של vHipp nAChRs ידי גורם ניקוטין ספגה Ca 2 + הזרם לתוך האקסונים מראש הסינפטי (איור 2 א, ד). השלב המתמשךעליות ניקוטין מושרה ב[ Ca 2 +] אני איתות לאורך האקסונים vHipp נחסם על ידי α7 הספציפיים * nAChR אנטגוניסט αBgTx אבל לא על ידי nAChR אנטגוניסט DHβE (2A-C איור) * שאינו α7. הדמיה ישירה של אנדוציטוזה FM1-43 צבע פעילות תלויה וexocytosis נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר שחרור בעקיפין presynaptic הנוירוטרנסמיטר 23, 24. הנה, תמונות נציג וכימות להיתוך לפוחי מושרה ניקוטין לאורך האקסונים vHipp דמיינו ידי FM1-43 מוצגות באיור 3 (איור 3 א, ג). הנוכחות של α7 מראש הסינפטי * nAChRs נדרשת להיתוך מקסימאלי ניקוטין מושרה שלפוחית ​​ושחרור הנוירוטרנסמיטר (איור 3, C). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52730/52730fig1.jpg" /> איור שיתוף תרבות 1. Synaptic של vHipp עם nAcc מאפשרת examination של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs. (AC) קריקטורה סכמטי של במבחנה מעגלי גנוטיפ הספציפי (ג) שהוכנו על ידי ציפוי נפרד של ההיפוקמפוס / subiculum הגחון (). &#160; פרוסות מWT או α7 בודדים - / - נוירונים עכבר ומפוזרים מגרעין נסמך WT (B). Aq, אמת מים (סילביוס); DG, gyrus המשונן; MM, גרעין הפיטמתיים המדיאלי; PMCo, גרעין posteromedial קליפת המוח אמיגדלה; RF, סדק rhinal, FMI, מלקחיים קטנים של הכפיס המוח; LV, חדר לרוחב; ט&quot;ו, גבשושית חוש הריח; סמנכ&quot;ל ,. Microslices (ד) vHipp pallidum הגחון להאריך תחזיות vGluT1 חיוביות (אדום) axonal שקשר עם GAD65 חיובי (ירוק) נוירונים nAcc (חיצים לבנים הם דוגמאות לאתרים אלה מגע). בר סולם: 10 מיקרומטר (E.-G) Micrographs נציג של אקסונים WT vHipp (צביעה עם vGluT1, ירוק) מוצג לα4 * nAChR (E), α5 * nAChR (F) וα7 משטח * nAChR (צביעת G) באשכולות אדומים (חצים לבנים). בר סולם:.. 5 מיקרומטר (H) אין α7 משטח * אשכולות nAChR על נוירונים GABAergic מפוזרים (GAD65 חיובי) מnAcc לבד &quot;אשכולות&quot; (אני) אדום של α7 משטח * nAChR (חיצים לבנים) שניתן לראות באלה נוירונים התפזרו שיתוף תרבותי עם microslices vHipp. בר סולם:. 5 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52730/52730fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52730/52730fig2.jpg" /> איור שיתוף תרבות 2. Synaptic של vHipp עם nAcc מאפשרת בדיקה של אות סידן ניקוטין מושרהing לאורך האקסונים vHipp. () Fluo-4 נציג תמונות של סידן קשור fluo-4 בסולם צבעים פסאודו לאורך האקסון WT vHipp לפני (למעלה), 1 &#39;(תיכון), ו -30&#39; (תחתונה) לאחר יישום ניקוטין. השלב המתמשך (30 &#39;) של 2 + התגובה מושרה ניקוטין Ca מתבטל על ידי תוספת של α7 * אנטגוניסט סלקטיבי nAChR αBgTx (100 ננומטר) (ב), אך לא על ידי התוספת של היריב שאינו α7 * nAChR סלקטיבית DHβE (1 מיקרומטר) (ג). בר סולם: 5 מיקרומטר עלילת נציג (D) של עוצמת הקרינה מנורמלת fluo-4 משולבת מהאקסון WT vHipp חי perfused עם ניקוטין (1 מיקרומטר) 1 דקות.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52730/52730fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52730/52730fig3.jpg" /> איור שיתוף תרבות 3. Synaptic של vHipp עם nAcc מאפשרת בחינה של שחרור ניקוטין מושרה לפוחי מוליך עצבי (עם FM1-43) לאורך האקסונים vHipp. (א) נציג תמונות של אקסונים WT vHipp (עמוסות FM1-43, ירוק) לפני (למעלה) ואחרי יישום ניקוטין (תחתון). (ב) נציג תמונות של אקסונים WT vHipp (עמוסות FM1-43, קודם לכן בα7 * אנטגוניסט nAChR סלקטיבית αBgTx במשך 15 דקות) לפני (ואחרי (יישום עליון) למטה) ניקוטין. בר סולם:. 5 מיקרומטר (C) מראה כימות של השינויים בקרינת FM1-43 axonal (ירידת F) לאחר טיפול ניקוטין בהעדר (WT) או נוכחות (WT + αBgTx) של α7 * אנטגוניסט nAChR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52730/52730fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הזז 1" src="/files/ftp_upload/52730/52730mov1.jpg" /> סרט נוסף 1: הדמיה חיה זמן לשגות של Fluo-4 הקרינה / Ca 2 + בסיס לאורך האקסונים vHipp. התמונות של Fluo-4 הקרינה / Ca 2 + לאורך האקסונים vHipp הזמן לשגות נרכשו עם עדשת מים אובייקטיבית 60x כל 10 שניות למשך 30 דקות עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. תמונות שנרכשו היו מצויינים בקנה מידת צבע פסאודו ושיחקו בחזרה כסרט ב 2 מסגרות לים. סרט זה מציג את הבסיס של Fluo-4 / Ca 2 + פעילות הקרינה לאורך האקסון לחיות WT vHipp perfused עם קוקטייל HBS. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/52730/52730mov2.jpg" /> סרט נוסף 2: ההדמיה חיה זמן לשגות של הניקוטין המושרה ספגה Fluo-4 / Ca 2 + </sעד&gt; הקרינה לאורך האקסונים vHipp. התמונות של Fluo-4 הקרינה / Ca 2 + לאורך האקסונים vHipp הזמן לשגות נרכשו עם עדשת מים אובייקטיבית 60x כל 10 שניות למשך 30 דקות עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. תמונות שנרכשו היו מצויינים בקנה מידת צבע פסאודו ושיחקו בחזרה כסרט ב 2 מסגרות לשנייה. סרט זה מראה ניקוטין (1 מיקרומטר, perfused בשלב 43 זמן, נשטף החוצה עם קוקטייל HBS בנקודת זמן 49) מושרה Fluo-4 / Ca 2 + פעילות הקרינה לאורך האקסון לחיות WT vHipp. יישום ניקוטין מוגבר fluo-4 / Ca 2 + עוצמת הקרינה לאורך האקסונים vHipp.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons at JoVE.com

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Google

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Views.  Stony Brook University. We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Video: Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

The development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out axons to innervate specific targets, which in humans are often more than 100 cm away from the soma of the neuron. Neuronal survival during development depends on target-derived growth factors but also on the support of Schwann cells (SCs). To this end SC ensheath axons from the region of the neuronal soma (or the transition from central to peripheral nervous system) to the synapse or neuromuscular junction. Schwann cells are derivatives of the neural crest and migrate as precursors along emerging axons until the entire axon is covered with SCs. This shows the importance of SC migration for the development of the peripheral nervous system and underlines the necessity to investigate this process. In order to analyze SC development, a setup is needed which next to the SCs also includes their physiological substrate for migration, the axon. Due to intrauterine development in vivo time-lapse imaging, however, is not feasible in placental vertebrates like mouse (mus musculus). To circumvent this, we adapted the superior cervical ganglion (SCG) explant technique. Upon treatment with nerve growth factor (NGF) SCG explants extend axons, followed by SC precursors migrating along the axons from the ganglion to the periphery. The beauty of this system is that the SC are derived from a pool of endogenous SC and that they migrate along their own physiological axons which are growing at the same time. This system is especially intriguing, because the SC development along axons can be analyzed by time-lapse imaging, opening further possibilities to gain insights into SC migration.

Here we describe a Schwann cell (SC) migration assay in which SCs are able to develop along extending axons.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.