עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק NS065183 וקרנות הזנק מבית הספר לרפואת ראטגרס רוברט ווד ג&#39;ונסון.

1. הכנת עכברוש astrocyte תרבות למדיה אוויר וastrocyte נוירון cocultures. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ דיסקציה (BSS, ראה טבלת מס &#39;1 למתכון) ולאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי גורי ילוד חולדה (P0-P2) עם isoflurane בכוס 500 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר גורים הם נייחים, תרסיס עם אתנול 70% ולערוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזק היטב את הראש עם זוג דומון # 5 מלקחיים, ולהשתמש במספריים בסדר לעשות חתך קו האמצע דרך העור והגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את המוח על ידי המשקף את הגולגולת לצדדים, ולהסיר את המוח לתוך צלחת המכילה BSS הקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את אונות המוח מdiencephalon וגזע המוח תחת בהיקף לנתח. מוציא בזהירות את כל קרומי המוח על ידי ייצוב הרקמות עם זוג אחד של מלקחיים ומשייכתו בעדינות משם קרומי המוח עם זוג נוסף של מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל אונות in אחד 60 מנה מ&quot;מ. בעזרת מספריים קטנים, רקמת בשר טחון כדק ככל האפשר. לאחר מכן להעביר את הרקמות טחונות לצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מיליליטר של 1% DNase אני וטריפסין 1.5 מיליליטר של .2.5% ו12 מיליליטר של BSS (נפח כולל של 15ml) למוח. דגירה באמבט מים רועד במשך 15 דקות ב37 ° C. כדי להבטיח ערבוב טוב, צינור התערבל ביד כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant דרך מסננת 70 מיקרומטר תא מעל צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. הוסף 3 מיליליטר FBS לsupernatant זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתיכות שנותרו, להוסיף 13.5 מיליליטר של BSS וטריפסין 1.5 מיליליטר 2.5% דגירה בwaterbath הרועדת לעוד דקות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant שנותר דרך מסננת התא ולשלב עם supernatant משלב 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות עד גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת גליה. Supernatant ניתן centrifuged שוב לגלולת התאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cel פלייטls בצפיפות של 1 x 10 7 סנטימטר ל150 2 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת לתקשורת גליה טרי היום לאחר ציפוי. לאחר מכן, תאים להאכיל פעמיים בשבוע עם תקשורת גליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים הגיעו confluency&gt; 80% (כ 10 ימים לאחר ציפוי), להקפיא את התאים למטה ב90% בסרום סוס וDMSO 10% ולהחזיק מלאי בחנקן נוזלי. תאים קפואים ב2 x 10 6 לכל בקבוקון. אפשר להקפיא כ 5 בקבוקונים מבקבוק אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על 10-14 ימים לפני הגדרת התרבות בהיפוקמפוס, ותאי גלייה הם מצופים מהמניות הקפואות. בדרך כלל אנחנו צלחת חמש 6 צלחות היטב, וזה מספיק כדי לתמוך בצמיחה של 90 coverslips של נוירונים בהיפוקמפוס (שלושה coverslips 15 מ&quot;מ עגול לכל טוב). אנחנו גם צלחת שמונה עד עשר מנות נוספות 60 מ&quot;מ של תאי גליה, המשמשת לתקשורת N2.1 האוויר עבור transfection. היום לפני התרבות עצבית, צריכים להיות מוזנים בתאים עם תקשורת NB27. האסטרוציטים אידיאלי צריכים להיות מחוברות 90%&gt; ב ההוא נקודה. אנו מוצאים כי הקפאה מקטינה באופן משמעותי את מספר מיקרוגליה בתרבויות astroglial. מאז רעילות העצבית מוגברת נצפתה כאשר מיקרוגליה קיים בתרבויות astroglial, אנחנו תמיד משתמשים בתרבות astroglial הוכנה ממניות קפוא לcoculture עם הנוירונים. </li></ol> 2. עצבי תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית נקי על ידי השטיפה הראשונה ב2x המים milliQ. אז הם ספוגים בחומצה חנקתית מרוכזת ל24 שעות, ולשטוף עם מים milliQ לפחות חמש פעמים על סך של 2 שעות. Coverslips הם מיובשים ועיקור על ידי אפייה בתנור בחום של C ° 225 במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips 60 מ&quot;מ מנות לאחר עיקור. הנח ארבע נקודות של פרפין סטרילי ליד הקצה החיצוני של כל coverslip כדי לשמור על תאי עצב להיפרד מתאי גליה במהלך coculture. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מעיל עם 1 מ&quot;ג / פולי-L-ליזין מיליליטר במאגר M 0.1 borate לילה בחממת 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף coverslips פעמיים במ &#39;סטריליilliQ מים לפחות 15 דקות כל אחד. אז הם מודגרות לילה בתקשורת ציפוי ב37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה בהריון (E18) על ידי הרדמה isoflurane אחרי חזה אוויר, ולהרדים חולדות עוברי על ידי עריפת ראש. הסר את המוח ולנתח את אונות המוח כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את hippocampi מחץ כדור מוחין. מניחים את כל hippocampi לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, ולעכל עם טריפסין 0.25% (0.5 מיליליטר 2.5% טריפסין, 4.5 מיליליטר BSS) על 37 ℃ במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hippocampi מתעכלת הם שטופים ב3x BSS במשך 5 דקות כל אחד. אז הם נכתשו עם זכוכית פיפטה פסטר, וצפיפות התאים נקבעת באמצעות hemocytometer. אז נוירונים הם זורעים בצפיפות של 2 x 10 5 תאים לכל 60 מנה מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 2-4 שעות לאחר ציפוי, העברת coverslips עם הנוירונים מחוברים למנות המכילות תאי astroglial, עם הנוירונים פונים כלפי מטה לכיוון גליה. בDIV3, להוסיף arabinoside ציטוזין לתאים בריכוז סופי של 5 מיקרומטר לעצור התפשטות גליה. </li></ol> 3. Transfection סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת N2.1 מצב על גליה היום לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection, לקחת תקשורת N2.1 התנתה הנחה של גליה ולהעביר לתוך צלחת חדשה. העברת coverslips עם נוירונים לתוך תקשורת N2.1 המותנה. תן לאזן באינקובטור במשך 10-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצה אחת של צינורות סטרילי, לשלב 1-4 מיקרוגרם של ה-DNA, 12.5 μl של 2 מ &#39;CaCl 2, וסטרילי H 2 O להיקף כולל של 100 μl. לסט שני של צינורות, להוסיף של 2x HBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ⅛ נפח של 2x HBS (12.5 μl) בכל פעם לצינור המכיל את תערובת CaCl 2 / ה-DNA, vortexing לכמה שניות בכל פעם. לאפשר הצינורות לשבת במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דגירה דקות, מוסיף את dropwise תערובת transfection לתאים. דגירה של 1-1.5 שעה. שכבה של משקעים כמו חול צריכה להיות גלויהתחת מיקרוסקופ באמצעות מטרת 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף coverslips פעמיים עם חיץ לשטוף HBS חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור coverslips למנות מקוריות עם גליה, להוסיף חומצת kynurenic לריכוז סופי של 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן הדמיה נוירונים transfected חי או מעובד לimmunocytochemistry כבר ביום שלמחרת. נוירונים יכולים לשרוד עד שלושה שבועות לאחר transfection. </li></ol>

<ol>
	<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li><li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons.">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li><li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA.">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li><li>Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+cultured+neurons.">Transfecting cultured neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14,+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI(3,5)P(2)+and+PI(5)P.">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).</li><li>Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Hippocampal+Neurons+in+Low-Density+Culture.">Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+formation+of+a+DNA/calcium+phosphate+coprecipitate:+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons.">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li></ol>

אין ניגודי מעוניינים הכריזו.

ישנם מספר פרמטרים מרכזיים שצריך להיות מבוקרים בקפידה לtransfections המוצלח באופן עקבי 10,11. הפרמטר הקריטי ביותר עבור transfection סידן פוספט הוא ערך ה-pH של 2x HBS, אשר בידיים שלנו בדרך כלל נע בין 7.10-7.15. אנו ממליצים להכין שלוש קבוצות של מניות עם ערכי ה-pH ב0.05 מרווחים כדי להסביר את ההבדל בין pH מטר. לחלופין, ערכת transfection היונקים Clontech מספקת 2x הרוורד כי באופן עקבי תשואות יעילות טובה. יש לזכור כי ה-pH של התמיסה תשתנה במשך זמן, גם כאשר הם מאוחסנים במקפיא. אנחנו בדרך כלל לשמור aliquots של 2x HBS על 4 מעלות צלזיוס עד לחודש אחד, וב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת. הפרמטר השני הוא ה-pH של המדיום לתרבות. כדי לשמור בינוני N2.1 זו עולה בקנה אחד, מותנים באופן שיגרתי על תרבויות astroglial לילה אבל לא יותר מ24 שעות. בנוסף, אנו מנסים להשתמש בתרבויות astroglial הבדומה בconfluency. השימוש במדיה ממוזג גליה גם עוזר להפחית את רעילות לתאי עצב במהלך transfection. מדיה אוויר הם equilibrated בחממה לפני transfection כדי לשמור את ה-pH עולה בקנה אחד. הגודל והצפיפות של משקעים סידן פוספט הוא מפתח לtransfection המוצלח. משקעים קטנים יובילו ליעילות transfection נמוכה, ואילו משקעים גדולים, מגושמים בדרך כלל להוביל לcytotoxicity 10. כדי להבטיח היווצרות משקע סידן זרחה עולה בקנה אחד, אנו משתמשים vortexing לסירוגין כאשר ערבוב DNA / CaCl 2 ו 2x 11 HBS. שיטה הנפוצה נוספת לערבוב היא באמצעות פיצוץ בועות אוויר באמצעות פיפטה פסטר 12. מצאנו vortexing לסירוגין להניב היווצרות משקע עקבית יותר, במיוחד לנפחים קטנים של תערובת transfection. משתנים אחרים לשקול לכלול באיכות של ה-DNA, ואת גיליו של נוירוNS. אנו מוצאים כי transfection להתחיל לעבוד באופן עקבי כאשר נוירונים להגיע DIV2, עם זאת, את היעילות מתחילה לרדת כאשר נוירונים הם מעבר DIV10. לבסוף, את בריאותם של התרבויות עצביות עצמם מייצג עוד פרמטר חשוב. אנו מוצאים את השימוש במערכת coculture להיות הדרך הטובה ביותר כדי ליצור תרבויות בהיפוקמפוס הראשוני בריאים. אם הנוירונים אינם בריאים, הם לא ישרדו זמן רב לאחר transfection. עם מערכת coculture, הנוירונים בצפיפות נמוכים יכולים לשרוד לתקופה של עד 3 שבועות לאחר transfection, המאפשר לימודים לטווח ארוך.

הנוירונים עיקריים הם אחד מסוגי התאים בצורה הקשה ביותר לtransfect כפי שהם postmitotic ורגישים מאוד לשינויי מיקרו סביבתיים. ישנם ארבעה סוגים נפוצים של שיטות לביטוי של גנים אקסוגניים וRNAs קצר סיכה (shRNAs) בתאים אלה 1. לכל אחד יש יתרונות משלה וחסרונות. לדוגמא, electroporation מבוצע בדרך כלל על נוירונים מבודדים טרי 2, כמו תאים חייבים להיות מועברים לcuvettes עבור transfection. זיהום בנגיף בדרך כלל ניתן להשיג יעילות גבוהה מאוד 3, אבל הוא יותר עתיר עבודה ומסוכנת למפעילים. ריאגנטים transfection בתיווך שומנים רבים זמינים באופן מסחרי, בדרגות שונות של הצלחה בתאי עצב ורמות שונות של cytotoxicity. transfection סידן פוספט מייצג שיטה נוחה וחסכונית להחדרת גנים זרים לתוך תאי עצב. השיטה שימשה לראשונה להציג את ה-DNA adenovirus לתוך cel היונקיםls ידי גרהם ואן דר Eb (1973) 4. Transfection בוצע על ידי ערבוב של סידן כלורי עם ה-DNA רקומביננטי בחיץ פוספט. זה מאפשר היווצרות של פוספט DNA / סידן שוקע בו, כאשר ירד בהדרגה על monolayer של תאים, לדבוק בתא השטח, נתפס על ידי אנדוציטוזה וסופו של דבר להיכנס לגרעין 5. תהליך זה יביא לביטוי של גנים זרים הציגו בתא היעד. יעילות אופיינית למגוון transfection סידן פוספט בין 0.5-5% 6-8. עם זאת, עם אופטימיזציה מדוקדקת וביצוע של פרוטוקול הניסוי עולה בקנה אחד, אפשר להגיע ליעילות transfection של כמעט 50%. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים, אשר cocultured עם תאי astroglial בפורמט כריך 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14090-09</td>
			<td>straight / sharp 8.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Vannas-Tubinger spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15008-08</td>
			<td>angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Student surgical scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91401-14</td>
			<td>blunt / 14.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15006-09</td>
			<td>angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:207px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">14043-225-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">100 mM Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Glucose</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">1 M HEPES, pH 7.3</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>21130-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">DNase I</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Cytosine arabinoside</td>
			<td style="width:207px;">Calbiochem/EMD Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">251010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Kynurenic acid</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

כאשר הפרמטרים השונים של transfection מותאמים ונשלטים בקפידה מניסוי לניסוי, ניתן להשיג יעילות transfection של עד 50%. איור 1 מציג שדה של נוירונים שהם transfected עם GFP על DIV4. השדה מכיל בסך הכל 28 נוירונים, ביניהם 16 היו transfected. זה מייצג את יעילות של מעל 50%. דגימה של שדות אחרים באותו coverslip מראה את היעילות הכוללת היא 50% בערך (מידע לא מוצג). עם מערכת coculture astroglial, הנוירונים להישאר בריאים ולהתפתח באופן נורמלי לאחר transfection. איור 2 מראה נוירון בהיפוקמפוס בDIV15, 10 ימים לאחר transfection עם מבנה PSD-95-GFP. נוירון פיתח קוצים בצורת פטרייה בוגרים רבים הדנדריטים, אשר מציין את תאי העצב בריאים. יעילות transfection הגבוהה והרעילות מינימאלית של פרוטוקול זה הופך אותו לכלי רב ערך ללימוד פונקציות גן בהיפופוטם עיקרינוירונים campal. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי לtransfect תרבויות של סוגים אחרים של תאי עצב במוח, כמו גם סוגי תאים שקשה transfect אחרים. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50808/50808fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50808/50808fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. נוירונים בהיפוקמפוס transfected עם GFP בDIV4, מראים יעילות transfection גבוהה. 16 מתוך 28 נוירונים בתחום הם חיוביים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50808/50808fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50808/50808fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50808/50808fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. נוירון היפוקמפוס transfected עם PSD-95-GFP בDIV15, מראה עמוד השדרה בצורת פטרייה בוגרת רב הדנדריטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50808/50808fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> טבלת 1. / מתכוני מדיה מאגר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> רכיבים </td></tr><tr><td> גליה מדיה </td><td> 425 מיליליטר MEM 5 מיליליטר Glutamax 5 פירובט מיליליטר נתרן, 100 מ&quot;מ גלוקוז 15 מיליליטר 20% FBS 25 מיליליטר (סופי 5%) עגל בסרום 25 מיליליטר (5% סופיים) 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין </td></tr><tr><td> 0.1M Borate הצפת </td><td> חומצה בור 2.48 גרם tetraborate נתרן 3.9 g (בורקס) 800 מיליליטר milliQ H2O pH עם NaOH ל8.5 סנן לעקר </td></tr><tr><td> ציפוי מדיה </td><td> 425 מיליליטר MEM 5 מיליליטר Glutamax 5 פירובט מיליליטר נתרן, 100 מ&quot;מ גרם 15 מיליליטר 20%lucose 50 מיליליטר FBS </td></tr><tr><td> NB27 מדיה </td><td> 485 מיליליטר Neurobasal מדיה 5 מיליליטר Glutamax 2 תוסף B27 מיליליטר (50x) </td></tr><tr><td> נתיחה חוצץ (BSS) </td><td> 50 מיליליטר 10x HBSS 5 מיליליטר 1 M HEPES, pH 7.3 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין 440 מיליליטר H 2 O </td></tr><tr><td> N2.1 מדיה </td><td> 425 מיליליטר MEM 5 מיליליטר Glutamax 5 פירובט מיליליטר נתרן, 100 מ&quot;מ גלוקוז 15 מיליליטר 20% ovalbumin 50 מיליליטר, 1% בממ תוסף N2 5 מיליליטר </td></tr><tr><td> 2x HEPES נאגרו מלוח (HBS), סטרילי </td><td> 274 מ&quot;מ NaCl 9.5 מ&quot;מ KCl 15 מ&quot;מ גלוקוז 42 HEPES מ&quot;מ 1.4 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 הכן את קבוצות של 3 pH שונה (7.05, 7.10, 7.15) </td></tr><tr><td> הצפת לשטוף (HEPES ופר) </td><td> 50 מיליליטר 10x HBSS 5 מיליליטר 1 M HEPES, pH 7.3 445 מיליליטר H 2 O</td></tr><tr><td> 50 מ&quot;מ Kynurenic חומצה </td><td> ממיסים 0.473 גרם של חומצת kynurenic ב 1x PBS. להוסיף טיפות של NaOH כדי לקבל אותו לפתרון. ואז להשתמש HCl להתאים בחזרה ל-pH 7.0 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. קו זמן להכנת תרבות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יום </td><td> פעולה </td></tr><tr><td> לפני שמתחיל </td><td> הכן את תרבות astrocyte ולהקפיא את תאים. צרור אחד של תרבות astrocyte בדרך כלל יכול לתמוך בכמה חודשים של תרבויות בהיפוקמפוס. </td></tr><tr><td> שבוע השנייה 1 </td><td> להפשיר האסטרוציטים. </td></tr><tr><td> שבוע שלישי 1 </td><td> להאכיל את האסטרוציטים. </td></tr><tr><td> שבוע שישי 1 </td><td> להאכיל את האסטרוציטים. </td></tr><tr><td> שבוע 2 שני </td><td> להאכיל את האסטרוציטים. יש לשטוף coverslips ב H 2 O, ולאחר מכן לטבול בחומצה חנקתית ל24 שעות. </td></tr><tr><td> שבוע 2 יום שלישי </td><td> ריןse coverslips 5x. יבש לעקר coverslips. </td></tr><tr><td> שבוע 2 יום רביעי </td><td> הנח נקודות פרפין על coverslips. מעיל coverslips עם פולי-L-ליזין. </td></tr><tr><td> שבוע 2 יום חמישי </td><td> יש לשטוף coverslips המצופה בH2O סטרילי, אז דגירה coverslips בציפוי מדיה הלילה בשעה 37 ° C. שינוי בתקשורת על האסטרוציטים לNB27. </td></tr><tr><td> שבוע 2 יום שישי </td><td> נתיחה בהיפוקמפוס וציפוי. </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons at JoVE.com

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

calcium-phosphate-transfection-of-primary-hippocampal-neurons

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.1K Views.  Rutgers University.  המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי a...

Video: Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...