המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר ג&#39;ון Harbell לתמיכתו המדעית והזמן שהוקדש לפרויקט EIT. המחברים גם רוצים להודות לBeiersdorf AG (גרמניה), IIVS (ארה&quot;ב), מרי קיי בע&quot;מ (ארה&quot;ב), אבון מוצרים בע&quot;מ (ארה&quot;ב), פרוקטר אנד גמבל / Cosmital (שוויץ), Laboratoire פייר פאבר (צרפת), הרלן מעבדות (בריטניה), וLVMH parfume (צרפת) להשתתפות בMulti-מרכז בינלאומי טרום אימות ואישור במחקרים של מבחן העין גירוי 15.

<ol>
	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. L396 (49), 1-849 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , (2013).</li><li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes.">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li><li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage/eye+irritation:+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS/EU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods.">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li><li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EC/HO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test.">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+safety:+a+silent+(in+vitro)+success+story.">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, 69-74 (2002).</li><li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Draize+Eye+Test.">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation.">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li><li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent.">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243 (2002).</li><li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies.">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249 (2007).</li><li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model.">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378 (2009).</li><li>Harbell, J., Curren, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+the+prediction+of+ocular+and+dermal+toxicity.">In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity.</a> Handbook of Toxicology. , (2001).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation.">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li><li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation.">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li><li>MatTek Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , (2014).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiOcular+Eye+Irritation+Test+(EIT)+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals:+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times.">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li><li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+validation+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation.">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructed+Human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+Test+Method+for+Identifying+Chemicals+Not+Requiring+Classification+and+Labelling+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.+Draft+proposal+for+a+new+test+guideline..">Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline..</a> OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).</li><li>Blazka, M. E., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+ocular+irritation+potential+of+54+test+articles+using+the+EpiOcular+Human+tissue+Construct+Model.">Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model.</a> Toxicol. In Vitro. , (2003).</li><li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+&#8212;+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test.">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests &#8212; An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li></ol>

עמלות פרסום לכתבה זו שולמו על ידי חברת MatTek.

יש לנו הצגתי את מבחן העין גירוי (איור 1) שפותח עבור דגם רקמת EpiOcular. EIT הוא מסוגל להפריד חומרים מגרים עיניות וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולב) מחומרים שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה) עם רמה גבוהה של רגישות וסגוליות 17. EIT כפי שהוצג במסמך זה אינו מפלה בין קטגוריה GHS 1 מקטגוריה 2 כימיקלים. EIT קבל תוקף לסיווג ותיוג של פוטנציאל גירוי העיני של מגוון רחב של כימיקלים, כולל מרכיבים קוסמטיים ותרופות. בשיתוף עם אחרים בבדיקות מבחנה, EIT ישמש כתחליף למבחן גירוי בעיני ארנב in vivo. EIT משתמש בשני פרוטוקולים דומים אך שונים לחומרים נוזליים ומוצקים, המשתנים באורך של חשיפה ותקופות שלאחר החשיפה דגירה (איור 1). נקודת הסיום בשימוש בEITהיא כדאיות רקמות, שנקבעה על ידי assay MTT, אשר שימש בעבר בדגמי תוקף אנושי אפיתל רקמת 20,21. כדי לבצע assay זה, אין צורך בציוד מיוחד מלבד ציוד תרבית תאים סטנדרטי. בשל הרמה הגבוהה של שחזור רקמות לרקמה, n = 2 רקמות במקום בדרך כלל מומלץ n = 3 משמשים. היכולת להשתמש n = 2 רקמות היא היבט קריטי של הפרוטוקול, שכן הוא מאפשר למפעיל מנוסה לעבד שתי רקמות בו זמנית, ובכך לצמצם את השונות של assay שיכול להתעורר כתוצאה מהטיפול של רקמות אדם שונה 14. כמו כן, על ידי השימוש בn = 2 רקמות למאמר בדיקה, IRRITANCY של 10 חומרי בדיקה של אותו מצב פיזי (נוזל או מוצק), יחד עם הבקרות החיוביות ושליליות, ניתן להעריך באמצעות ערכה אחת (24 רקמות). נקודות מפתח אחרות המבטיחות אמין סיווג של חומרי מפרטים לביקורת החיובית substance (כדאיות רקמות ≤50.0%), שחזור בין רקמות כפולות (הבדל &lt;20.0%), וקריאת OD בקרה שלילית (&gt; 0.8 ו&lt; 2.5). בעת ביצוע בדיקת EIT, חשוב לדבוק בפרוטוקול תוקף ולמינון הציע ולוחות זמני שטיפה (לוחות 3 ו -4), מאז סטייה מהפרוטוקול או השינויים בתקופות הדגירה עלולה לגרום לתוצאה שונה. כמו כן, סטיות מרגע 3 שעות לדגירת MTT יגרמו קריאות MTT שונות ועשויות להשפיע על תוצאת assay. מדי פעם, כימי בדיקה יכולה להיות אופטיות או אחרות תכונות שעלולים להפריע לassay כדאיות רקמות MTT או הפחתת גורם MTT. לדוגמא, כימי בדיקה עשויים להפחית באופן ישיר למוצר MTT תגובה כחול-סגול, או עשוי להיות חומר בצבע שסופג אור באותו הטווח כמו formazan MTT (~ 570 ננומטר). עם זאת, כימיקלים מבחן אלה יהיו יחסי ציבורesent בעיה היחיד, אם בזמן של assay MTT, כמות מספקת של החומר עדיין קיימת ב( או נספג על ידי) הרקמה. כדי למנוע הפרעה זו, נהלי שטיפה נרחבים ישולבו פרוטוקול EIT. אם שטיפה אינו מסיר את ת&quot;א ות&quot;א מפריעה להפחתת MTT, יש להשתמש בבקרות נוספות כדי לזהות ונכון עבורו. בקצרה, אם הפחתת MTT הישירה של חומר כימי בדיקת חשד, 50 μl (או 50 מ&quot;ג למוצקים) של הכימיקל בשאלה טופחו במשך 3 שעות עם פתרון MTT עובד בSCC (NC, 50 μl של מים ללא יונים סטרילי, צריך להיות לרוץ במקביל). אם פתרון MTT הופך לכחול-סגול, מאמר המבחן הוא בחזקת צמצמו את MTT. במקרה זה בדיקה פונקציונלית באמצעות פקדי רקמות נהרגו הקפאה צריכה להתבצע כדי להעריך אם חומר הבדיקה מחייב לרקמות ומובילות להפחתת אות MTT שווא. אם יש ירידה ניכרו בMTT החשוף-ת&quot;א שליטת הרקמה נהרגה,(ביחס לכמות ברקמת קיימא מטופל), כדאיות הרקמות הממוצעת של מאמר המבחן חייבת להיות מתוקנת על ידי הפחתת הכדאיות הממוצעת של השליטה נהרגה. EIT טועה בצד של בטיחות, כפי שהודגם על ידי השכיחות הנמוכה של סיווגים שליליים כוזבים 14,15,18. חשוב לציין, שאף אחד מהכימיקלים GHS קטגוריה 1, שהנם מאכל לעין ואשר מייצג את המפגע העיני החמור ביותר, סווגו כלא מעצבן בassay זה 14,15,18,19. לבסוף, אחד היתרונות הגדולים של RHCE בשיטת בדיקת מבחנה היא האפשרות של בדיקת נוזל מסודר וחומרים מוצקים (דבר שאינו אפשרי עם תרבויות דו-ממדיים, שקועות תא). EIT יתרום באופן משמעותי בקביעת פוטנציאל הגירוי העיני של מגוון רחב של חומרים על פי שיטת הסיווג ותיוג של האו&quot;ם GHS. ההחלפה של בעלי חיים כדי לקבוע oרעילות cular הייתה מטרה של מחקר טוקסיקולוגי במשך שנים רבות. שיטת בדיקת EIT השלימה מחקר אימות פורמלי נתמך על ידי EURL ECVAM בשנת 2014 וEIT EpiOcular יושם להנחיות מבחן ה- OECD כOECD TG 492 בשנת 2015.

מוצרים צריך, כגון מוצרי קוסמטיקה, חומרי ניקוי, חומרי ניקוי ביתיים וכוללים מגוון רחב של חומרים כימיים העלולים לגרום לניזק רציני אם הם לפנות לעיניים. לכן, בדיקה של סוכנים אלה לגירוי בעיניים נדרשת על ידי הרשויות הרגולטוריות בארה&quot;ב ובאיחוד האירופי כדי להבטיח את בטיחות צרכן 1. הערכת פוטנציאל הגירוי בעיניים של תערובות וניסוחים גם דרישה לעמידה בREACH (רישום, הערכה, אישור, והגבלה של כימיקלים) חקיקה לתיוג של מרכיבים קוסמטיים תחת קוסמטיקת הנחיית האיחוד האירופי להובלת כימיקלים, ול התיוג של חומרי הדברה ומוצרים ביתיים 2. נכון לעכשיו, סוכנויות רגולציה דורשות הערכת סיכונים עינית באמצעות השיטה המתואמת הגלובלי של סיווג ותיוג של כימיקלים (GHS) 3. GHS מתבסס בעיקר על מבחן הגירוי בעיני דרייז, assay הגירוי בעיניים הנפוץ ביותר שבו חומרים זרים ומילxtures הציג ישירות לתוך שק הלחמית של העין ארנב 4. על פי סיווג GHS, קטגוריה GHS 1 (חומרים מאכלים עיני) מתייחסת לבדיקת כימיקלים שגורמים לפגיעה ראשונית חמורה לרקמות העין או הנזק חמור לעין והראייה שאינה הפיך במלואו בתוך 21 ימים לאחר חשיפת 3.5. GHS קטגוריה 2 מתייחסת לבדיקת כימיקלים שמייצרים שינויים משמעותיים בעיניים כי הם הפיכים לחלוטין בתוך 21 ימים מחשיפה. כימיקלים מבחן שאינם מאכלים או חומרים מגרים מכונים קטגוריה GHS לא. במשך יותר מ -40 שנים, בדיקת עיני ארנב דרייז זכתה לביקורת על החוסר של שחזור, הערכת יתר של תגובות אנושיות, והשימוש בבעלי החיים 5-8. חששות אלה עודדו את הצעות רבות לעידון, צמצום, והחלפת in vivo המבחן 9. הצורך בחלופות שאינן בעלי חיים תוקף התחזק עוד יותרעל ידי אימוץ התיקון השביעי לקוסמטיקת ההוראה, שאסר על השימוש בבעלי החיים בהערכת הבטיחות של מוצרי קוסמטיקה (בשנת 2005) ומרכיבים (בשנת 2009) 2. מאז 1996, מודל הרקמה כמו קרנית-שוחזר כבר בשימוש נרחב על ידי תעשיית הקוסמטיקה להעריך את פוטנציאל הגירוי של חומרי גלם, ניסוחים מבוססי פעילי שטח, ונוסף תערובות המיועדות לשימוש ב, או בקרבת, עין 10-13. שימוש במודל רקמת RHCE מאפשר יישום מקומי ישיר של החומר למבחן על פני השטח הרקמה בצורה מקורית, החייה. בדרך זו, ניתן לבדוק ניסוחים מסיסים שאינם מים מבלי לדלל אותם עם ממסים. בתגובה לשל ECVAM EURL (המעבדה ההפניה איחוד האירופי מרכז האירופי לתיקוף השיטות חלופיות) בקשה לשיטה נרחבת ישימה, פשוטה, וכלכלית מבחן גירוי בעיניים (EIT) אשר מנצל Singlזמן חשיפת דואר, והוא מסוגל להפריד בין חומרים מגרים ומאכלים עיני מחומרים שאינם דורשים תיוג פותח (איור 1) 14. על סמך התוצאות עבור 83 כימיקלים (44 נוזלים ו -39 מוצקים), EIT השיג 95.5 / 68.2 / ו81.8% רגישות / סגוליות ודיוק (SS ו) לנוזלים, 100.0 / 68.4 / ו84.6% SS ולמוצקים, ו97.6 / 68.3 / 83.1% ולאס-אס וכולל. בשינה 2007, בחסות הקוסמטיקה אירופה (לשעבר Colipa) בחסות ECVAM EURL מחקר מראש אימות רבת-מעבדה העריך את הרלוונטיות ואמינות של EIT במטרה להביא אותו לאימות פורמאלית 15. במחקר זה, 298 ניסויים עצמאיים בוצעו בשבע מעבדות עצמאיות. תוצאות המחקר הראו הסכם 99.7% בתחזית עם מקדמים נמוכים של וריאציה בכל המעבדות משתתפות 15. כתוצאה מכך, בשנת 2010 הפרוטוקול EIT נכנס EURL ECVAM רשמיתכנית אימות. מחקר האימות מנוצל 104 כימיקלים מבחן מקודדים, כוללים חומרים אישיים ותערובות כימיות, אשר נתונים התייחסות in vivo (נתונים גירוי בעיני דרייז) היו זמינים. בהתבסס על ההצלחה של עבודה זו, קו מנחה טיוטת מבחן OECD הוגש בשנת 2014. זה צפוי כי EIT יתרום באופן משמעותי לסיווג פוטנציאל לגירוי עיני של מגוון רחב של חומרים על פי שיטת הסיווג ותיוג של האו&quot;ם GHS.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

כדי לעמוד בתיקון השביעי לחקיקת הוראת הקוסמטיקה והאיחוד האירופי REACH של האיחוד האירופי, שיטות חלופיות שאינם בעלי חיים תוקף להערכה אמינה ומדויקת של רעילות עינית באדם יש צורך. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו מבחן גירוי בעיניים (EIT) אשר מנצל מודל תלת ממדים משוחזר אדם אפיתל כמו קרנית (RHCE) רקמה המבוסס על תאים אנושיים רגילים. EIT הוא מסוגל להפריד חומרים מגרים עיניות וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולב) ואלה שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה). המבחן מנצל שני פרוטוקולים נפרדים, אחד מיועד לכימיקלים נוזליים ופרוטוקול שני, דומה למאמרי מבחן מוצקים. מודל חיזוי EIT משתמש תקופת יחידה חשיפה (30 דקות לנוזלים, 6 שעות למוצקים) וכדאיות רקמות חתך בודד (60.0% כפי שנקבע על ידי assay MTT). על סמך התוצאות עבור 83 כימיקלים (44 נוזלים ומוצקים 39) EIT השיג 95.5 / 68.2 / 81.8 וsens%itivity / סגוליות ודיוק (SS ו) לנוזלים, 100.0 / 68.4 / 84.6% ואס-אס ולמוצקים, ו97.6 / 68.3 / 83.1% ולאס-אס וכולל. EIT יתרום באופן משמעותי לסיווג הפוטנציאל לגירוי העיני של מגוון רחב של כימיקלים נוזליים ומוצקים, ללא שימוש בבעלי החיים כדי לעמוד בדרישות רגולציה בדיקות. שיטת EpiOcular EIT יושמה בשנת 2015 להנחיות מבחן ה- OECD כTG 492.

Watch this Scientific Journal Video about Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model at JoVE.com

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

פיתחנו מבחן גירוי בעיניים אשר מנצל מודל רקמת האפיתל שלושה כמו קרנית-ממדי משוחזר אנושי (RHCE). המבחן הוא מסוגל להבחין בין גירוי העיני וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולבים) ואלה שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.0K Views.  MatTek Corporation.  פיתחנו מבחן גירוי בעיניים אשר מנצל מודל רקמת האפיתל שלושה כמו קרנית-ממדי משוחזר אנושי (RHCE). המבחן הוא מסוגל להבחין בין גירוי העיני וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולבים) ואלה שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה). 

Video: Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

טכנולוגיית תאים באנקפסולציה להעברת מוצרים ביולוגיים לעין העכבר

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

כימות ארגון קולגן פיברילאר עם כלים מבוססי המרה של Curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...