This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1. עצבי תרבות הערה: תכנות מחדש פיברובלסטים בתאי גזע pluripotent, מחויבת לשושלת telencephalon הגב, גזירה, הגברה, ובנקאות של אבות קליפת המוח מאוחר (LCP) תוארה באל Boissart et 4. בידול עצבי של תאים כמו LCP-גם ביצע על פי אל Boissart et 4 עם שינויים קלים. נהלים אחרים פותחו עבור תכנות מחדש ישיר של fibroblasts לתאי גזע pluripotent המושרה ואחריו הבידול שלהם לתאי עצב. פרוטוקול זה נשמר שכן הוא מאפשר ייצור סלקטיבית של תאי עצב glutamatergic פירמידה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את תרבות צלחות 6-גם עם coverslips זכוכית עם פולי-ornithine (בדילול ל1/6 בDPBS, ריכוז המניה 0.01%) O / N, ואחריו שלושה שוטף בDPBS. לאחר מכן להוסיף laminin (ריכוז מניות 1 מ&quot;ג / מיליליטר, בדילול 500 פעמים בDPBS) לפחות 10 שעות תחת מכסה המנוע הזרימה<html> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת ולשגר המל&quot;ל בצפיפות נמוכה (50,000 תאים / 2 סנטימטר) בתרבות צלחות 6-גם עם coverslips זכוכית ב 3 מיליליטר של מדיום התרבות המורכב DMEM / F12 (500 מיליליטר), 2 בקבוקונים (5 מיליליטר כל אחת) של תוספת N2, 2 בקבוקונים (10 מיליליטר כל אחד) של תוסף B27, 10 מיליליטר של העט, סטרפטומיצין (פניצילין = 10,000 יחידות / מיליליטר וסטרפטומיצין = 10,000 יחידות / מיליליטר), 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol (פתרון במלאי: 50 מ&quot;מ) וlaminin (1 / 500), ללא גורמי גדילה. שלב קריטי: לבצע את הצעד הזה בזהירות על ידי הוספת תאים עם תנועות סיבוב איטיות על מנת לצמצם אשכולות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות. הוסף בינוני N2B27 טרי המכיל 2 מיקרוגרם / מיליליטר של פתרון laminin הטרי כדי לשמור על תא העצב מצורף על coverslips הזכוכית ולהימנע clumping. לשנות הבינוני כל 3 ימים. שמור חלק מבינוני שנותר (200 μl) לפני הוספה בינונית טרי כדי למנוע את התא מהתייבשות. לחלופין, להמשיך במהירות ולשנות את הנפח הכולל (3 מיליליטר). </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. lentiviral התמרה הערה: וקטורי lentiviral GFP נמסרו באדיבות על ידי ד&quot;ר Uwe Maskos מעבדה במכון פסטר (פריז) והוכנו על פי הפרוטוקול שפורסם 5. הביטוי של GFP הוא מונע על ידי האמרגן קינאז phosphoglycerate העכבר (PGK). במחקר זה, כייל נגיף היה של 400 ng / μl (פתרון מניות בPBS 1x). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce נוירונים נגזר iPSC אדם בכל צעד של התבגרות על ידי חלקיקים נגיפיים על ידי הוספת 1 μl של פתרון המניות המכיל 40 ng של וקטור GFP lentiviral לתרבות ו( 6-גם צלחות) ודגירה של 48 שעות במדיום תרבות טרי. הערה: פרוטוקול זה, משך הדגירה מאפשר תיוג טוב של מבני עמוד השדרה. </li></ol> 3. Immunofluorescence הערה: על מנת לשפר את התיוג של כל מורפולוגיה עמוד השדרה, תיוג immunofluorescence בוצע באמצעות נוגדן אנטי GFP בתנאי permeabilized. </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות ולתקן את תאי transduced על coverslips paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS (10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips טובלים בPBS בתוספת 0.05% טריטון (100x) ו -10% בסרום סוס עבור שעה 1 ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של 1x PBS 100 μl בתוספת 4% בסרום סוס ונוגדן ראשוני (1/1000) שהועלה נגד GFP ומדולל בפקטור של 1000 על כל coverslip. דגירה בO תיבה כהה / N ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן אלקסה פלואוריד 488-מצומדת (1/200) בPBS בתוספת 0.5% מTween 20 ו דגירה עבור שעה 1 ב RT. לאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS והר coverslips על שקופיות זכוכית עם ההרכבה בינונית למיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 4. דנדריטים השדרה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה confocal דרך מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נוירונים בריאים עם מורפולוגיה פירמידהND arborization הדנדריטים מלא, ולכמת לפחות 10 נוירונים לכל מצב מניסויים נפרדים. לכמת 60-100 מיקרומטר לדנדריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות שמן 40X NA = 1.3 אובייקטיביים וקו לייזר 488 ננומטר לעירור GFP, עם שיא כוח טיפוסי במדגם רמה סביב 20 μW. גודל פיקסל הגדר סביב 80 ננומטר לטעום כראוי קוצים הדנדריטים. הערה: שיחת הניתוח שלאחר מכן לתמונה שברעש אינו מתפשר הפילוח הנכון של דנדריטים וקוצים. עם הגדרות דגימה והכוח במרחב שהוזכרו לעיל, שצפינו כי פיקסל להתעכב זמן של 3.15 מייקרו-שני הוא מספיק כדי לאסוף מספיק פוטונים לבנות תמונה כזו. עבור דגימות עמומות, ניתן לשפר את איכות תמונה על ידי חישוב ממוצע 2 עד 4 סריקות. ייתכן שתהיה צורך הרכישה של כמה אריחי XY כדי לכסות את האזור של עניין, אשר לאחר מכן יש מאוחה לפני העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעום את כל נוירון הנפח, לרכוש Z-ערימה, עםZ ריווח החל 150 ננומטר ל -300 ננומטר, מניב 20 עד 30 פרוסות Z. הערה: הרזולוציה מרחבית הרוחב הושגה עם הגדרות אלה היא 234 ננומטר והרזולוציה הצירית היא 591 ננומטר. הדגימה שנבחרה כאן היא נאותה, אלא כהחלטה הצירית היא גדולה יותר מהגודל הקטן ביותר של עמוד השדרה להיות צילם, הניתוח מעדיף את הקוצים שלהאריך רוחבית מדנדריטים. </li></ol> 5. 3D כימות של קוצים הדנדריטים הערה: בסעיפים הבאים במיוחד לתאר את השימוש בתוכנת Imaris לניתוח. מימושים אלטרנטיביים קיימים, כולל 15 NeuronStudio או Metamorph 8, אשר יכול לספק תוצאות דומות. השתמש בהגדרות המפתח הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשלב עיבוד מראש, להשתמש בסינון גאוס באמצעות מתקני עיבוד תמונה המוצעים על ידי התוכנה. בצע סינון גאוס באמצעות עיבוד תמונה&gt; Smooדבר&gt; סינון גאוס. הגדר את רוחב המסנן להיות שווה לגודל פיקסל בXY. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מעקב אוטומטי למחצה של דנדריטים, באמצעות מודול נימת Tracer של התוכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להעריך את קוטר דנדריט, על ידי שימוש בכלי המרחק בכרטיסיית Slice של התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה לעלות, לחץ על כלי החוטים. לאיתנות טובה יותר, פרוטוקול זה מסתמך על מעקב חצי אוטומטי; לחץ על יצירה אוטומטית דלג. ממשק מודול עכשיו מראה את כרטיסיית צייר. כאן, בחר AutoPath כשיטה, דנדריט כסוג, וקלט קוטר דנדריט המוערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב בחר של המצביע, הופך את הסמן לתיבה. לחץ Shift ימני על נקודת התחלת דנדריט. הערה: התוכנה מבצעת חישובים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את המצביע לאורך דנדריט. מנקודת ההתחלה (מייצגאד כתחום כחול), קו צהוב מייצג את נתיב דנדריט הסביר ביותר מוצג. לחץ-Shift-שמאל בנקודת סיום דנדריט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פילוח קוצים האוטומטי. הערה: הקוצים על דנדריט לייחס נמצאים באופן אוטומטי על ידי ממשק מודול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בממשק מודול, לחץ על כרטיסיית היצירה. ברשימה שחררה לבנות מחדש, לבחור לבנות מחדש קוטר דנדריט וסמן את תיבת הנתונים שמור. לאחר מכן לחץ על בנה מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הסף, כך שהנפח המפולח תואם את בפועל דנדריט הנפח. כאלגוריתם, בחר הקצרה ביותר מרחק ממרחק מפה. לחץ על הכפתור הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את קוטר ראש עמוד השדרה הקטן ואורך המקסימאלי, שוב על ידי שימוש בכלי המרחק בכרטיסיית Slice של התוכנה, ולאחר מכן לחזור לכרטיסייה לעלות ולהזין את הפרמטרים. Fאו בפרוטוקול זה, ערכים סביב 200-300 ננומטר לקוטר מינימאלי ו -4 מיקרומטר לאורך מקסימאלי הם נקודת התחלה טובה. אל תסמן את תיבת סניף שדרות אפשר. לחץ על הכפתור הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את סף זרע נקודות, כך שהנקודות הכחולות מייצגות קוצים למקם את ראשי עמוד השדרה בפועל. לחץ על הכפתור הבא. הערה: חישוב הליבה מתבצע עכשיו ויכול להיות ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג קוצים ידי מעבר ללשונית כלים של ממשק מודול. לחץ על לסווג קוצים. בממשק המשתמש תתבקש, לוודא שיש ארבע כיתות, שהוגדרו על ידי המורפולוגיה שלהם כדלקמן: סטאבי: אורך &lt;1 מיקרומטר; פטריות: אורך (עמוד השדרה)&gt; 3 ורוחב מקס (ראש)&gt; אומר רוחב (צוואר) x 2; ארוך דק: Mean רוחב ≥ Mean רוחב (צוואר) (ראש); כמו filopodia-: אורך ≤ 4 מיקרומטר (לא ראש). הערה: מוממשק Dule מייצר ארבעה חפצי נימה חדשים המכילים את התוצאות של הסיווג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים סטטיסטיים יצוא: על כל ארבעת ממשקי אובייקט אלה, עבור לכרטיסיית סטטיסטיקה. לחץ על כל סטטיסטיקת היצוא לקובץ לחצן. הערה: ערכים סטטיסטיים אחרים ניתן לייצא לדנדריטים (. למשל, אורך, שטח, אומר קוטר, עומק סניף, הסתעפות זווית, נפח, וכו &#39;.), ועבור עמוד השדרה (למשל, יושר, אזור של קובץ מצורף, אורך ונפח של מובחן חלקי עמוד השדרה, בקוטר עמוד השדרה, צפיפות, וכו &#39;.) </li></ol>

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כימות של תכונות מורפולוגיות של נוירונים פירמידה הסתמכה על התוכנה. ממשק נימת Tracer שימש לפילוח של נוירונים וקוצים, ואת מודול XT שימש לניתוח שלהם. כדי לנתח את הדיוק של הטכניקה שלנו, אנחנו בהשוואה ראשונה פרמטרים שנמדדו מורפולוגיים (אור...

קוצים הדנדריטים של תאי עצב בקליפת המוח הם פירמידה בליטות קטנות ודקים אשר מופצות לאורך הדנדריטים הבסיסיים ופסגה של תת העצבי אלה במכרסמים, קופים, ומוח אנושי. הם האתרים של רוב סינפסות מעוררות ולהציג פונקציות מרכזיות בלמידה ובתהליכים קוגניטיביים. המבנים מפורטים של קוצים הדנדריטים אדם נחקרו מבחינה טכנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 2. עם זאת, גישה כזו היא זמן רב ומייצגת עומס עבודה כבדה. לאחרונה, שחזור תלת ממדים (3D) במורפולוגיה של קוצים הדנדריטים דווח בקליפת המוח אנושית באמצעות תוכנה ספציפית בשילוב לניתוח בעמוד השדרה במדריך גדול 3. טכנולוגיה ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) מצמידים את immunofluorescence מייצגת כלי מדויק לזיהוי עמוד השדרה ומדידת צורה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יכולה להיות מיושמת בקלות לנוירונים בתרבית. האוVer, אין נתונים דווחו על הניתוח של התבגרות עמוד השדרה ומורפולוגיה על נוירונים אנושיים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC). מטרת המחקר הייתה לתאר את פרוטוקול, המאפשר הדמיה בעמוד השדרה הדנדריטים מתאי עצב אנושיים בתרבית במבחנה. תיוג GFP, מיקרוסקופיה confocal וניתוח 3D עם מודול נימת Tracer של תוכנת Imaris שמשו בפרוטוקול הנוכחי. צעדי תרבות שנחוצים כדי להשיג תאי עצב בקליפת המוח glutamatergic של שכבות השניה לIV מתאי גזע עצביים (המל&quot;ל) הם גם תאר בקצרה כאן. הפרוטוקול כולו לייצור המל&quot;ל אדם כבר פורסם במקום אחר 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

קוצים הדנדריטים הם בליטות קטנות שמתאימות לתאי פוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות במערכת העצבים המרכזית. הם מופצים יחד דנדריטים. המורפולוגיה שלהם תלויה במידה רבה בפעילות עצבית, והם דינמיים. קוצים הדנדריטים לבטא קולטנים glutamatergic (קולטני AMPA וNMDA) על פני השטח שלהם וברמות של צפיפות פוסט-סינפטי. כל עמוד השדרה מאפשרת נוירון כדי לשלוט בפעילות מקומית ואת מדינתו באופן עצמאי. מורפולוגיות עמוד השדרה נחקרו רבות בתאים פירמידליים glutamatergic של קליפת המוח, באמצעות שני גישות in vivo ותרבויות עצביות המתקבלות מרקמות מכרסמים. יכולים להיות קשורים לתנאי נוירו אינדוקציה עמוד השדרה שינו והתבגרות, כפי שמוצגים בנוירונים בתרבית מכרסמים וניתוח כמותי חד-ממדי 1. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניתוח כמותי של מורפולוגיות עמוד השדרה 3D באמצעות cortic אדםנוירונים אל שמקורם בתאי גזע עצביים (אבות קליפת המוח מאוחר). תאים אלה בתחילה התקבלו מתאי גזע pluripotent מושרה. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של מורפולוגיות עמוד השדרה בתקופות תרבות שונות, ועם השוואה אפשרית בין תאי גזע pluripotent מושרה מתקבלים מאנשים שליטה עם אלה המתקבלים מחולים במחלות פסיכיאטריות.

<html> המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול סטנדרטי לכימות עמוד השדרה של דנדריטים תרבית של תאי עצב פירמידה נגזרים מiPSC. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של התבגרות עמוד השדרה על נוירונים אנושיים והשוואה האפשרית שלה עם ההתבגרות של עמוד השדרה בתרבויות עצביות מכרסם סטנדרטיים, כמו גם in vivo</...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  Institut Pasteur.  קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה. 

Video: Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...