The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. P&#233;bay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay); Australian Research Council Future Fellowship (A. P&#233;bay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.

האוסף של מדגם שיער אדם מאנשים דורש אישור אתי על ידי ועדת האתיקה מחקר האנושית במוסדות המארח וצריך להיעשות בהתאם להנחיות מוסדיות. 1. בידוד של קרטינוציטים משיער פריטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מטריקס הפשרת פתרון (ECM) (כלומר, Matrigel) בO קרח / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת הטיפים פיפטה מראש צונן, להוסיף 200 פתרון ECM μl 12 מיליליטר של מדיום DMEM / F12 המצונן. מעיל צלחת 12-היטב עם 1 מיליליטר של תמיסת ECM מדוללת לכל אחד. דגירה O הצלחת המצופה / N על 37 מעלות צלזיוס. לשטוף את הצלחת המצופה עם DMEM בינוני F12 / מראש חימם לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את שיער אנושי ראשוני מראשו של הפרט על ידי הצבת את אצבעות קרובות לשורש השיער ומריטת השיער בתנועה אחת מהירה וחלקה. בדוק כדי לוודא שכל שיער שנאסף מכיל זקיקי שיער ללא פגע ולקבוע את שלב הצמיחה של האו&quot;ם השיערder מיקרוסקופ לנתח (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 5-10 שערות anagen מכל אדם כדי לחלץ קרטינוציטים. תהליך קטף שערות בהקדם האפשרי על מנת להבטיח גזירה מוצלחת של קרטינוציטים. הערה: איור 1 מדגים את המורפולוגיה של שערות בשלבים שונים של מחזור הצמיחה. שיער אנגן הוא בשלב הצמיחה, עם שכבה חיצונית גלויה של האפיתל המקיף את אורכו של השיער, הידוע בשם ORS. מצד השני, שיער telogen מייצג שיער בשלב המנוחה ואין לי ORS גלוי, אך יש לו כדור ברור של תאים המכסים את השורש של השיער, הידוע בשם בליטת telogen. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות שיער לתוך צלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר של האנטיביוטיקה מיקס לשטוף במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים ומלקחיים מעוקרים, מנותק שערה מוגזמת, עוזב בר שיער עם זקיק שיער ללא פגע וסביב 0.5-1 סנטימטר של שערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרה בזהירותnsfer בר שיער 1 לבאר כל צלחת ECM מצופה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 1 מיליליטר, להוסיף טיפות כ 3 של החלפת נוק סרום בינוני (KSR) (~ 100 - 200 μl) על דגימות השיער. הערה: שמור את שברי השיער בקשר הדוק אל פני השטח הצלחת כדי לאפשר התקשרות ותולדת keratinocyte שלאחר מכן. הוספת תקשורת מוגזמת בשלב זה רשאי גורם ברי השיער לצוף ומקטין את הסיכוי של קובץ מצורף שיער מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות השיער בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 ולאפשר את זקיקי השיער לצרף O / N. ביום הבא, בעדינות להוסיף 3 טיפות נוספות של מדיום KSR (~ 100 - 200 μl) כדי לשמור על דגימות שיער לחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לדגימות השיער מדי יום כדי לוודא שזקיקי השיער צירפו בהצלחה. בדרך כלל חיבור של זקיקי שיער הוא לכאורה בתוך 1-3 ימים. שערות עבות הן בדרך כלל קלים יותר לצרף לעומת שערות, כמו שערות עדינות יש לי גבוהה יותרנטייה לצוף אשר מעכבת את תהליך העיקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהשיער שצורף לצלחת המצופה, להוסיף 500 μl של מדיום KSR לטוב. קח טיפול נוסף בעת הוספה בינוני כדגימות שיער אולי לא מחוברת היטב. מנקודה זו, לשנות תקשורת כל 2 ימים. הערה: בצמחים keratinocyte צריכים להיות גלויים מאזור ORS של בר השיער לאחר 3-7 ימים (איור 2 א-ב). לאפשר קרטינוציטים לגדול עד 14 ימים לפני passaging התאים כפי שתואר בסעיף הבא. </li></ol></li></ol> 2. תחזוקה וPassaging של קרטינוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל 6-גם צלחת באמצעות ערכת הציפוי מטריקס. להוסיף 680 μl של מדיום הדילול מהערכה היטב כל אחד, ואחריו 6.8 μl של ציפוי מטריקס פתרון. לנער את הצלחת על מנת להבטיח פיזור אחיד של פתרון מטריקס הציפוי על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הצלחת המצופה לדגירה במשך 30 דקות ב RT. הסרפתרון הציפוי מטריקס לפני הציפוי של קרטינוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק קרטינוציטים להשעית תא בודד עם 500 μl של טריפסין 0.25% בכל טוב במשך 2-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. להשבית טריפסין עם 500 μl של סרום בינוני המכיל (למשל, שור עוברי סרום בינוני (FBS)) ולאסוף לתוך צינור 15 מיליליטר סטרילי. הסר את בר השיער באמצעות מלקחיים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התאים שנקטפו באמצעות haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים 3 דקות ב 200 x גרם. לשטוף את התאים עם PBS וצנטריפוגה החוזרת. לשאוב PBS וresuspend התא גלולה במדיום keratinocyte טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 4 × 10 4 קרטינוציטים לטובים אחד של צלחת ECM מצופה בנוכחות בינונית keratinocyte. שמור את קרטינוציטים בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 (איור 2 ג). שינוי תקשורת בכל יום ותאי מעבר כאשר התרבות היא ~ 80% ומחוברות, WHIפרק יכול לקחת כ 2-7 ימים בהתאם לשיעור מספר המעבר והתפשטות של קרטינוציטים. יש להרחיב קרטינוציטים נגזרים ליצור מניות קפוא מספיק בשיטות הקפאת הקפאה איטיות סטנדרטית 16. הערה: תנאי התרבות המתוארים לתמוך בהתרחבות של אוכלוסייה הומוגנית של קרטינוציטים עם מורפולוגיה מרוצפת טיפוסית (איור 2 ג). מדי פעם, כמה קרטינוציטים מובחנים, עם מורפולוגיה גדולה ושטוחה ואיבדתי את פוטנציאל replicative, אפשר לראות בתרבות. אפיון של קרטינוציטים יכול להתבצע על ידי immunostaining נוגדנים נגד שימוש cytokeratin 14 כפי שתואר קודם לכן 17. שורות תאי keratinocyte הוקמו גם צריכה להיבדק לmycoplasma אחרי 1-3 מעברים באמצעות ערכה זמינה מסחרי. </li></ol> 3. דור של hiPSCs מקרטינוציטים שימוש Episomal וקטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל 6-גם צלחת עםג&#39;לטין 0.1% (2 מיליליטר / טוב). לאפשר ג&#39;לטין למעייל לפחות 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי תכנות מחדש, קרטינוציטים שימוש לא יאוחרו מהחלוף 6. לנתק קרטינוציטים להשעית תא בודד עם 1 מיליליטר של 0.25% לטריפסין היטב במשך 2-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. להשבית טריפסין עם 1 מיליליטר של סרום המכיל תקשורת (למשל, תקשורת FBS) ולאסוף בצינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 תאי XG וגלולים במדיום keratinocyte. צלחת 1 × 10 × 10 5 -1.5 5 קרטינוציטים בכל טוב בצלחת O gelatinized / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא (יום 0), לבדוק את הצלחת כדי להבטיח תאים ומחוברות 50-60%. הערה: אם קרטינוציטים הם פחות מ ~ 50% ומחוברות הם עלולים לא לגדול גם לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0, לבצע transfection של וקטורי תכנות מחדש episomal על קרטינוציטים, באמצעות יחס של מגיב transfection 8 μl 2 מיקרוגרם הכולל פלסמיד דנ&quot;א.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 0.5 מיקרוגרם לכל אחד 4 פלסמידים (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-גבעת הרמה) ולדלל בסרום של מדיום מופחת (למשל, OPTI-MEM) 100 μl. הערה: פלסמיד pCXLE-eGFP משמש כדי לפקח יעיל transfection בקרטינוציטים ואינו נדרש לתכנות מחדש מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של מגיב transfection ל- DNA בדילול מלא. מערבבים על ידי מצליף את הצינורית. לאפשר את תערובת תגובת DNA לנוח ללא הפרעה על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום keratinocyte עם מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף את תערובת תגובת DNA לתרבות keratinocyte דגירה בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 4 שעות. הערה: לא מומלץ לבצע O transfection הממושך / N בקרטינוציטים כפי שהם מפגינים הישרדות נמוכה לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לאחר transfection 4 שעות, להחליף בינוני keratinocyte עם מדיום חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 (יום 1 פוסט-טראנסfection), לשנות את מדיום keratinocyte ולבדוק יעילות transfection על ידי אומדן אחוז התאים חיוביים eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל&gt; 60-70% יעילות transfection הוא ציין לקרטינוציטים ראשוניים תוך שימוש בפרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, חוזר transfection כמתואר בשלב 3.5. שני transfections רצוף בדרך כלל היה להשיג&gt; 90% יעילות transfection. תרבות keratinocyte בדרך כלל מגיעה למפגש בסוף transfection השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת 10 סנטימטרים של מזין עכבר פיברובלסטים עובריים (MEF) עבור כל תגובת תכנות מחדש. הכן ניזונים MEF mitotically מומתים כפי שתואר קודם לכן 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל צלחת 10 סנטימטרים עם 5 מיליליטר של ג&#39;לטין 0.1% לפחות 20 דקות. הצלחת 4 × 10 6 MEF mitotically מומת לכל צלחת 10 ס&quot;מ בינוניים FBS. אפשר התאים להתיישב ולצרף O / N בחממה 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, הריבשילו קרטינוציטים עם טריפסין 0.25% כפי שמתואר בשלב 3.2 ו -3.3. Resuspend קרטינוציטים במדיום KSR וצלחת 90% מקרטינוציטים מהיטב 1 של 6-גם צלחת לתוך צלחת מזין MEF 10 סנטימטרים עם מדיום KSR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיום 4 ואילך, לשנות את מדיום KSR כל יום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין לאחר 18 יום, להחליף בינוני תרבות בכל יום שני. הערה: קרטינוציטים-לתכנות מחדש ללא יחדלו להתרבות, ואילו מושבות hiPSC עם גבול מוגדר דומים לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) תצא מהיום 14-21. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מושבות hiPSC ידי נתיחה ידנית מיום 21 ואילך. הימנע מושבות hiPSC שהתקבצו יחד באופן הדוק ורק להרים מושבות hiPSC שברורות מופרדות מאחרים. ניתן לאסוף מושבות hiPSC קודם לכן, אבל המושבה עם גבולות מוגדרים לא יכולה להיות ברורה בנקודות זמן קודמות בהתחשב בגודל המושבה הקטן: הערה. יעילות תכנות מחדש עשויה להשתנות בין ההבדלשל מטופל erent קרטינוציטים, והוא גם מושפעים מגורמים אחרים כגון מספר מעבר או שיעור התפשטות של קרטינוציטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה במדריך של מושבות hiPSC, להשתמש במחט 26G לחתוך מושבות hiPSC תחת מיקרוסקופ לנתח. חותך מושבה hiPSC לחתיכות קטנות סביב 300-600 מיקרומטר באורך. העבר את החתיכות מאחד המושבה hiPSC לתוך צלחת חדשה MEF מזין (2.5 × 10 MEF 4/2 סנטימטר) להקים קו משובט של hiPSCs. בתחילה, תרבות כל שורה משובט hiPSC ובאחד 12 מנות צלחת או תרבות איבר היטב, לאחר מכן להרחיב עד 6 פורמט צלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קווים הוקמו משובטים של hiPSCs במדיום KSR על מתקני האכלת MEF. ברגע שהתרבות להגיע 70 - 80% confluency עם מושבות hiPSC ~ 1.5 מ&quot;מ קוטר, hiPSCs מעבר תוך שימוש בשיטות סטנדרטיים האנזימטית passaging (Accutase, Dispase או Collagenase IV) על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין קו hiPSC הוקםים כדי לאשר pluripotency ויכולתם להתמיין לתאי נציג של שלוש השכבות נבט במבחנה ו / או בvivo 13,19. כמו כן, קווי hiPSC באופן שגרתי בדיקה שהוקמו לmycoplasma באמצעות ערכות זמינות מסחרי כדי לוודא שהם ללא הפתוגן. באופן שיגרתי לפקח יציבות גנומית של קווי hiPSC ידי karyotyping או ניתוח הווריאציה עותק מספר מבוסס מערך (CNV). </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells.">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine.">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Peters, A., Zambidis, E., Ye, K., Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16.+Generation+of+nonviral+integration-free+induced+pluripotent+stem+cells+from+plucked+human+hair+follicles.">Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles.</a> Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. , 203-227 (2012).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li><li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles.">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li><li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors.">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li><li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li><li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells.">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li><li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation.">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li><li>Conner, D. A., et al., Ausubel, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryo+fibroblast+(MEF)+feeder+cell+preparation.">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. 23, Unit 23 22 (2001).</li><li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li><li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration.">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hair+cycle.">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li><li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives:+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper.">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li><li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li><li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells.">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency.">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation.">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li><li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues.">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li><li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li></ol>

The authors have no conflict of interest.

דור של hiPSCs מטופל ספציפי מציע גישה ייחודית ללימוד פתוגנזה בסוגים החולים תאים במבחנה, וגם מספק פלטפורמה להקרנת סמים לזהות מולקולות רומן שיכול להציל את פנוטיפים המחלה. גישת דוגמנות זה מחלה באמצעות hiPSCs הניבה תוצאות מבטיחות עבור מגוון רחב של מחלות, כולל תסמונת Long QT, ?...

הגילוי של תאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) חולל מהפכה בתחום של רפואת רגנרטיבית, מתן שיטה ריאלי עבור דור של תאי גזע מטופל ספציפי 1-3. hiPSCs כבר נוצר בהצלחה מסוגים שונים סומטי תא, כולל fibroblasts 4,5, תאי hematopoietic 6,7, תאי האפיתל כליות מהשתן 8 וקרטינוציטים 9,10. עד כה, fibroblasts עור ותאי hematopoietic מייצגים מקורות תא הנפוצים ביותר ליצירת iPSCs מטופל ספציפי. ניתן לטעון, וזאת בשל העובדה כי ביופסיות עור ואיסוף דם הם הליכים רפואיים שיגרתי וbiobanks הגדול של דגימות דם או עור מטופל הוקמו במדינות רבות. בניגוד לתאי דם ופיברובלסטים עור הדורשים שיטות מיצוי פולשנית, קרטינוציטים מייצגים סוג תא נגיש לדור hiPSC. Keratinocytes הם תאי אפיתל קרטין עשיר היוצרים את מחסום האפידרמיס החיצוני של העור ונמצאים גם בציפורניים ושיער 11. בפרט, ניתן למצוא קרטינוציטים על המעטפת החיצונית השורש (ORS) של זקיקי שיער, שכבה חיצונית סלולרית שכיסתה את השערה יחד עם נדן השורש הפנימי (IRS) תאים (12, איור 1). כאוסף שיער הוא הליך פשוט שאינו דורש הסיוע של צוות רפואי, הוא מספק הזדמנות לחולים כדי לאסוף ולשלוח דגימות השיער שלהם למעבדות, אשר תאפשר איסוף דגימות מטופל לדור hiPSC מאוד. קרטינוציטים אפידרמיס יש גם יעילות גבוהה יותר תכנות מחדש וקינטיקה תכנות מחדש מהר יותר בהשוואה לfibroblasts, מוסיף ליתרונות של שימוש בקרטינוציטים כתאים מתחילים לדור hiPSC 9,13. יתר על כן, hiPSCs יכול גם להיות שנוצר באמצעות אוכלוסיות תאים אחרות בתוך זקיק השיער,כולל תאי עורי papilla ממוקמים בבסיס 14,15 זקיק שיער. דיווחים קודמים של דור iPSC באמצעות תאים שמקורם בשיער לעתים קרובות להשתמש בשיטות תכנות מחדש retroviral או מבוסס lentiviral 9,14,15. עם זאת, שיטות נגיפיות אלה להציג את שילוב רצוי הגנומי של transgenes הזר בתכנות מחדש. לשם השוואה, השימוש בוקטורי episomal מייצג שיטה אפשרית, שאינה נגיפית תכנות מחדש כדי ליצור iPSCs ללא אינטגרציה 4. פיתחנו בעבר שיטה לתכנת מחדש keratinocyte לhiPSCs באמצעות וקטורי episomal 13 ביעילות פשוטה, חסכונית ושאינו נגיפית. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לדור של hiPSCs נגזר keratinocyte, כוללים הגזירה של קרטינוציטים מקטפו שיער, הרחבה ותחזוקה של קרטינוציטים ותכנות מחדש לאחר ליצור hiPSCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic Mix:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ng/ml Antimycotic amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942-20ml</td>
			<td>Antibiotic mix is made up in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% knockout serum replacement (KSR)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; MEM non-essential amino acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;bFGF (10 ng/ml, added fresh)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;EpiLife with 60&#160;&#181;M Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M-EPI-500-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Human keratinocyte growth supplement (HKGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE)&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Matrix (ECM):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354234</td>
			<td>Aliquot Matrigel stock and store in -80&#176;C following manufacturer&#8217;s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200&#181;l matrigel for coating a 12-well plate (~150&#181;g/well).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Matrix Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R-011-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td rowspan="5">Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-eGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent Fugene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td>Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Serum medium: OPTI-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN2613R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Use at 10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>Use at 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-160 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>Use at 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Detection kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of integration-free human induced pluripotent stem cells using hair-derived keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

השיער עובר 3 שלבים שונים של מחזור צמיחה: anagen (שלב הצמיחה), Catagen (שלב רגרסיה) וטלוגן (שלב המנוחה) 20,21. זקיק שיער anagen מכיל מספר שכבות של אפיתל; שכבות אלה כוללות ORS, מס הכנסה ושערה (איור 1). שיער Anagen סופו של דבר עובר במעבר לשלב Catagen, שמסומן על ידי אפופטוזיס של ORS וסי?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes at JoVE.com

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K Views.  University of Melbourne. This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors. 

Video: Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...