This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

<ol>
	<li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks.">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li><li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome.">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li><li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia.">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+Alzheimer's+disease-related+neurofibrillary+changes.">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation.">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li><li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies.">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+properties+of+Tau+protein:+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target.">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles.">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds.">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li><li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer's+Disease.">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo.">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li><li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

מערכת cytometry זרימת סריג המתוארת כאן היא כלי רב עוצמה להערכת פעילות זריעת טאו במהירות ובכמותית. זה דורש רק ניסיון מתון תרבית תאים וידע בסיסי של סריג וcytometry זרימה. מבחני זריעה אחרים, כגון Thioflavin T - אשר מציגה משופר הקרינה כאשר חייב מבנה גיליון בטא - הם מייגע ודורשים מצע חלבון טהור, רקומביננטי. בנוסף, במבחנה מבחני זריעה לטאו הם חצי כמותית בלבד, ובדרך כלל רגישים לרמות subnanomolar חומר זרע 23,24. סריג cytometry זרימה, לעומת זאת, מספק מדד כמותי ורגיש להפליא של פעילות זריעה מדגימות או רקומביננטי או ביולוגיות. יתר על כן, עיבודים להליך יכולים לעשות את זה שימושי ללמוד מגוון רחב של הפרעות צבירת חלבון. בעוד הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתמקד בזריעת טאו, רק שינויים פשוטים נדרשים to לאפשר למשתמש לעקוב אחר פעילות זריעה מסוגים חלופיים של זרעי proteopathic. כפי שהודגם בהולמס ופורמן ואח &#39;., יצירת קו תא חד שבטי יציבות להביע α-סינוקלאין מחסה המוטציה A53T הקשורים למחלות מתויגת לאו CFP או YFP אפשר זיהוי רגיש של פעילות זריעה מסיבי α-סינוקלאין באורך מלא רקומביננטי 16 . ניסויים דומים בוצעו באמצעות תאי biosensor Huntingtin, שגם ביעילות לזהות צבירת חלבון. לפיכך, רק על ידי שינוי biosensor החלבון, סריג cytometry זרימה תואם מקורות זרע רבים. שינויים אחרים לassay, כולל פרדיגמה טיפול ומודל תא, ניתן להשתמש כדי להפוך את סריג cytometry זרימה יותר ישים להערכת מנגנונים פיסיולוגיים. בפרוטוקול זה, זרעים הוכנסו ישירות לתאי biosensor באמצעות התמרה תיווך liposome כדרך להגביר את הרגישות. חשוב nOTE, עם זאת, כי זה לא דרישה. טאו אגרגטים מדגימות ביולוגיות רקומביננטי או עכבר עדיין מסוגלת זריעת תאי biosensor בהעדר יפוזומים (איור 5). כך, מעבדות מעוניינות ללמוד התפשטות פיזיולוגית ו / או מנגנוני קליטה של ​​זרעי טאו עדיין עשויה להעסיק את assay. בנוסף, סריג cytometry זרימה תואם תרבויות עצביות עיקריות. על ידי הדבקה של תאים עם CFP- ומבני lentiviral קידוד YFP בזמן של ציפוי, היענות סריג יעילה מושגת בריכוזים של ננו-מולר בעקבות טיפול בסיבי טאו רקומביננטי, גם בהיעדרו של יפוזומים (איור 5). יחדיו, נתונים אלה מצביעים על כך שזרימת סריג cytometry הוא שימושי לחקר מנגנונים פיסיולוגיים של זריעה עבור מגוון רחב של אגרגטים חלבון ובדגמי תרבית תאים מרובים. בעוד סריג cytometry זרימת המערכת הוא ידידותי למשתמש והתאמה, צעדי מפתח מסוימים צריכים להיותאחריו כדי להבטיח תאימות, כולל הכנת מדגם וconfluency תאים התקין בזמן טיפול. sonication בדיקה בעצימות גבוהות של דגימות מוח הוא קריטי עבור בידוד יעיל ואופטימלי של פעילות זריעה. במהלך פיתוח ואופטימיזציה, זה היה ציין כי כי שיטה זו היא מעל 10 פעמים יעילה יותר בבידוד פעילות זריעה ממוח P301S עכבר ביחס לטכניקות נפוצות אחרות, למשל הומוגניזציה כף יד. ייתכן שיש לי אגרגטים טאו גדולים מאוד נטיית זריעה נמוכה יחסית, וכי sonication הבדיקה הוא יעיל ביותר לשבירת אגרגטים אלה לרסיסים קטנים, זרע תואם. משך ותדירות של sonication ניתן לשנות במידת צורך, אם כי ההגדרות שתוארו לעיל מומלצות לזיהוי רגיש של פעילות זריעה. confluency הסלולרי בעת הטיפול גם הוא בעל חשיבות עליונה, כפי שהוא משפיע על רגישות ובריאות תא. אם תאיםמחדש ומחוברות מדי, הם לא בקלות לקחת את פוספוליפידים וחומר זרע, וכך באופן דרמטי הפחתת רגישות. אם confluency הוא נמוך מדי, תוספת של פוספוליפידים וחומר זרע יכולה להיות רעילה. בדיקות אמפיריות מראה כי confluency biosensor של 60-65% הוא אופטימלי לטיפול והיענות שלאחר מכן. כפי שצוין בפרוטוקול, אלגוריתמי פיצוי משמשים באופן קבוע להוציא גלישת CFP לתוך YFP וסריג ערוצים, ובכך למנוע אותות כוזבים והגברת רגישות. להערכה איכותית ומהיר של פעילות זריעה, עם זאת, צעד זה עשוי להיות מושמט או שבוצע לאחר מעשה באמצעות cytometry זרימת תוכנת ניתוח. אות נקיה וחזקה יותר מתקבלת בעקבות פיצוי, לעומת זאת, ובכך לניתוח הקפדני וכמותיים ביותר בשלב זה מומלץ מאוד. הגבלה של assay היא חוסר היכולת שלה לדווח על יוכימיים הרכבזרעי proteopathic. הפעילות השוטפת אמצעי assay הזריעה, רכוש פונקציונלי של זרעים. קביעת הטבע ביוכימיים וbiophysical של הזרעים תדרוש צימוד למבחנים מסורתיים כגון immunoprecipitation, כרומטוגרפיה, dichroism המעגלי, ספקטרוסקופיית מסות, וכו &#39;עם זאת, assay זה יהיה שימושי בהערכת עצמת זריעה כנקודת סיום מדגימות עצום. assay זה היה בשימוש לאחרונה לכמת ולאפיין את timecourse של זריעת התפתחות והתקדמות בעכברי P301S ביחס לסמנים אחרים נפוצים בתצהיר טאו, כגון כתמים היסטולוגית. במחקר זה, פעילות זריעת טאו הייתה ברורה יותר משישה שבועות לפני הסמן המוקדם היסטולוגית (MC1) שבדקנו 16. בהתחשב במראה שלה מוקדם, זריעת פעילות עשויה לייצג משלימה חשוב, או אפילו חלופי, מדד תוצאה להערכת יעילות של התערבויות טיפוליות, לפחות למחקרים ראשוניים.על ידי קיצור כמובן טיפול ולומדים בעלי חיים, עלויות דיור צעירות וזמן אספקה ​​ניסיוני יקטן. זה מתקבל על הדעת כי תרופות יכולות להיות מנוהלות על עכברי P301S ב4-6 שבועות ומוח הערכה לפעילות זריעה 2-4 שבועות לאחר מכן. לחלופין, הערכה של תרופות אנטי-טאו בתאים יכולה להתבצע בתוך ימים על ידי הערכת יכולתם כדי לחסום אינדוקציה של פעילות זריעה בתאי biosensor, כפי שמודגם באיור 5. לסיכום, סריג cytometry זרימת זריעת assay היא דרך קלה ויעילה לגילוי זריעת טאו ממקורות רקומביננטי או ביולוגיים. הרגישות שלה היא שאין כמותו על ידי אחרים במבחני זריעת טאו מבחנה, וזה יכול להיות מועסק על מנת לזהות את שינוי פתולוגי המוקדם בעכברי tauopathy P301S. יתר על כן, הגמישות שלה בניטור זרעי proteopathic רבים בתנאי טיפול שונים, ועם מודלים תרבות תאים מרובים, עושה את זה שימושי לכל מעבדה צבירת חלבון מעוניינת באיסוף נתונים כמותיים במהירות.

ההצטברות של amyloids טאו תאיים מגדירה tauopathies כגון מחלת אלצהיימר. בשלבים המוקדמים של מחלה, פתולוגיה בדרך כלל מקומית לאזורים הנפרדים של המוח, אך עם התקדמות מחלה, פתולוגיה תמיד מתפשטת לאורך רשתות עצביות שונות 1-5. ראיות מצטברות מצביעות על התפשטות transcellular של אגרגטים חלבון רעילים בבסיס הפתולוגיה זה (שנסקר ב6-10). במודל זה, זרעי proteopathic (למשל, באוניברסיטת תל אביב) משתחררים מתאי תורם ולהיכנס תאי שכנים, הפיכת חלבון טאו ילידים לטופס misfolded באמצעות שינוי קונפורמציה בתבניות 11-15. Assay המתואר כאן פותח כדי לזהות פעילות זריעה כגון רגישות. זה תואם עם חלבון רקומביננטי ודגימות ביולוגיות ומאפשר כימות של רמות דקות של פעילות זריעת proteopathic 16. תאי HEK 293T שיציבות להביע ד חוזר טאוomain (RD) המכיל את המוטציה P301S הקשורים למחלות התמזגו או CFP או YFP (להלן כתאי טאו-RD-CFP / YFP) לשמש כbiosensor יציב של פעילות זריעה. בהעדר זרעי proteopathic, התאים לשמור על טאו כמונומר מסיס, ואין להם סריג רקע ניכר. ספיגה ספונטנית או התמרה תיווך liposome של זרעי טאו לתאים, עם זאת, תוצאות בRD-CFP וצבירת RD-YFP, אשר מייצר אות סריג שנמדד בתוך תאים בודדים באמצעות cytometry זרימה. רכיבים רבים של assay זה הונדסו כדי לשפר את הרגישות ולהפחית השתנות. שורת תאים חד שבטי עם יחס של 1: ביטוי RD-CFP / YFP 1 נבחרה, כפי שהיא מספקת אות אופטימלית: רעש. כדי להגביר את הרגישות, פוספוליפידים משמשים להציג זרעים ישירות לתוך תאים (למרות ללמוד מנגנונים ביולוגיים של ספיגה, זה יכול להיות מושמט). לבסוף, cytometry זרימת צגי סריג ברמת אוכלוסייה ותא בודד<html> רמה, שלא כמו מבחני צבירת חלבון אחרים. מדד התוצאה הסופי, צפיפות סריג משולבת, היא כמותי מאוד והחשבונות הן למספר תאים עם צבירה, והמידה שבה צבירה התרחשה בתוך כל תא. כל פרמטרים האופטימליים אלה לשפר את הרגישות ולהבטיח שחזור. מערכת זו הועסקה לאחרונה במחקר מקיף בעכברים מהונדסים tauopathy P301S 17 שהעריך את תחילת הזמן והתקדמות של פעילות ביחס זריעת טאו לסמנים פתולוגיים טאו הנפוץ אחרים (לדוגמא, MC1, AT8, PG5, וThioflavinS). פעילות זריעה היא רחוקה סמן המוקדם וחזק ביותר של פתולוגיה באוניברסיטת תל אביב העריך, שקדמו לגילוי היסטולוגית על ידי לפחות 6 שבועות. פעילות זריעה מופיעה ב 1.5 חודשים ועליות בהדרגה עם גיל, מה שמרמז תפקיד סיבתי של זרעי proteopathic בתחילה ו / או ההתקדמות של ניוון מוחיים 16. e_content &quot;&gt; כימות מדויק של רמות דקות של חומר זרע מדגימות ביולוגיות יכול להקל על מחקרים העוקבים אחר התקדמות מחלה מוקדמת. על ידי קיצור משך משפט ומאפשר שימוש בבעלי החיים צעירים, זה יכול להגביר את היעילות והדיוק של ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. לדוגמא, ב עכבר P301S שתואר קודם לכן, תרכובות עופרת יכולות להיות מועברות מוקדם ככל 4-6 שבועות (מייד לפני, או בתחילתה של פעילות זריעה), ופיקוח על יעילות 2-4 שבועות לאחר מכן. assay צריך במדויק לכמת הפחתה כלשהי בזריעה פעילות. סריג cytometry זרימה שניתן לבדוק במבחנה יישומי הקרנה גם כן. לדוגמא, ריאגנטים אנטי-טאו (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו &#39;) במהירות ליכולתם לחסום זריעת אינדוקציה ישירות בתרבות, או באמצעות טאו רקומביננטי אגרגטים או lysates נגזר מוח כמקור זרע (איור 5). עם התקנה זו, מהרגע שחומר זרע מוכן, לשעברperiment לוקח רק שלושה ימים כדי להשלים, כולל ניתוח נתונים. הכימות המהיר של פעילות זריעת proteopathic יכול כך להקל על מחקרים רבים של ניוון של מערכת עצבים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

סריג cytometry זרימה מאפשר רגיש, כמותי, וזיהוי מהיר של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטי או ביולוגיות. התקנת assay היא קלילה: שורות תאי יציבות הנגזר חד שבטיים להביע טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם חומר זרע, טופח במשך 24-48 שעות, ונתונים לניתוח תזרים cytometry (איור 1 א). בהעדר זרעים, תאי biosensor לשמור טאו בצורה מסיסה, monomeric (איור 1). בנוכחות של זרעים, לעומת זאת, תאי biosensor להמיר טאו למדינה מצטברת (איור 1 ג), ייצור תגובת סריג שהוא זוהה על בסיס לכל תא עם cytometry זרימה. הערכה כמותית מראה כי תאי biosensor להגיב לריכוזי femtomolar חומר זרע וכי פעילות הזריעה ניתן למדוד בצורה יעילה על פני שלושה סדרי הגודל (1D איור). הפרמטרים gating הוקמו כדי להבטיח זיהוי של TRUE סריג אות, גם בריכוזים נמוכים זרע. ראשית, שיטות gating סטנדרטיים משמשות כדי לבודד את אוכלוסיית התא (איור 2 א) ותאים בודדים (איור 2). אות סריג שווא יכולה לנבוע מהפעלה ישירה של YFP על ידי לייזר 405 ננומטר. לפיכך, שער סריג False נמשך מאוכלוסיית תא בודדת חיובית YFP להוציא אות זיהום (איור 2 ג). אחרון, שער סריג מוגדר מתאי unseeded CFP / YFP הכפול חיוביים (איור 2 ד). שער מצויר ליד המדרון של האוכלוסייה המשתרעת כלפי מעלה ושמאלה ממנה. תאי unstimulated צריכים רקע סריג הערך מוגדר כ 1%, ותאי סריג חיובי יעברו לשער הזה באופן תלוי-מינון (השווה איור 2E ו2F). מספר פרמטרים נלקחים בחשבון עם סריג cytometry זרימה, ובם: חיוביות אחוזים (כלומר, מספר תאי סריג-חיוביים לכלל ספירת תאים) ובעוצמת הקרינה החציונית (כלומר, המידה שבה תגובת סריג מיוצרת בתאי סריג-חיובי). צפיפות משולבת סריג היא מדד התוצאה המועדף, כפי שהוא התוצר של שני משתנה אלה ומלאים מייצג את מידת פעילות זריעה הנגרמת על ידי כל מדגם נתון. סריג cytometry זרימה תואם lysates מוח P301S tauopathy נגזר עכבר, אפילו בגילים צעירים, כמוצג באיור 3. בעקבות microdissection של ארבעה אזורים שונים במוח, סריג cytometry זרימה שימש למדידת פעילות זריעה מגזע המוח (איור 3 א), הניאוקורטקס (איור 3), אונה קדמית (איור 3 ג), וההיפוקמפוס (איור 3D) בעכברי P301S על פני טווח של גילים. בכל אזור, פעילות זריעה עלתה עם גיל ונראית במרחק של 1.5 חודשים. עם זאת, עכברי נוקאאוט טאו (&quot;KO&quot;)&gt; 12 mos לא מוצגים פעילות זריעה. בהשוואה לשעותistological ניתוחים שבוצע באותה חיות, זה שישה שבועות מוקדם יותר מהמראה של כל סמן אחר של בתצהיר טאו (איור 3E), כוללים סמנים של טאו conformationally-הסוטה (MC1), טאו hyperphosphorylated קונפורמציה (AT8 וPG5), ועמילואיד (ThioflavinS). ממבט מכניסטית, זיהוי הפרוקסימלי של פעילות זריעת זרעי טאו מציע כמתווך סיבתי של תחילת ו / או התקדמות tauopathy. ממבט ניסויי, זה מצביע על כך שניתוח של פעילות זריעה עשוי להיות תוספת אידיאלית למדדי תוצאה סטנדרטיים של תצהיר טאו, נתן הופעתה המוקדמת וחזקה. בנוסף לעכברים הטרנסגניים, סריג cytometry זרימה תואם lysates המוח האנושי וקלות יכולה לזהות אגרגטים טאו המבודדים מנושאי מחלת אלצהיימר (איור 4). כאשר רקמת מוח אנושית קפואה הומוגני באותו אופן כפי שתואר כאן לlysates מוח P301S, זריעת פעילותהוא זוהה וחסונה מכל המדגמים נגזרו מנושאים לספירה. לעומת זאת, פעילות זריעה לא זוהתה מlysates של נושאי בקרת מחלות של התאמה-גיל או הנטינגטון. זה מדגיש את הייחוד של assay לאגרגטים טאו. למרות ההתמקדות של מאמר זה הוא גילוי רגיש של פעילות זריעת טאו באמצעות משלוח בתיווך liposome של אגרגטים לתאי biosensor 293T HEK, יכולות גם להתבצע פרדיגמות תרבית תאים פיסיולוגיות יותר עם סריג cytometry זרימה להעריך מנגנוני קליטה סלולרית בסיסיים. לדוגמא, יכולות להיות נגועות תרבויות עצביות עיקריות עם lentivirus להביע טאו-RD-CFP וטאו-RD-YFP בונה בזמן של ציפוי. בDIV4, צבירה נעדר בתאים שלא טופלו (איור 5 א), אבל לזיהוי בתאי עצב שטופלו בחומרים המכילים זרעים (איור 5). חשוב לציין, פוספוליפידים אינם נכללים בניסויים אלה, המתירים את החקירה של פיסיולוגי וטפיחה<html> מנגנוני זריעת hophysiological. לפיכך, יישום של סיבי טאו מוביל לספיגה בתיווך HSPG עצבית וממגר צבירה באופן תלוי-מינון שניתן לכמת עם זרימת סריג cytometry (איור 5 ג). בנוסף, assay יכול להיות מועסק להערכה טיפולית של ספיגת טאו וזריעת מצור במבחנה באמצעות תאי biosensor טאו 293T HEK. גם בהיעדרו של פוספוליפידים, שני סיבי רקומביננטי (איור 5D) וlysates המוח P301S (5E איור) לגרום לצבירת טאו. טרום דגירה של זרעים אלה טאו עם הפרין (הראתה בעבר להיות מעכב חזק של ספיגת טאו תיווך HSPG), עם זאת, מבטל את יכולת זריעתם. הגדרת ניסוי זה יכול להיות מיושמת על כל תרופה (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו &#39;) ותאפשר הערכה מהירה של ספיגה ו / או תרופות המשנה את הזרע. &quot;Src =&quot; איור 1 &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 53,205 / 53205fig1.jpg איור 1. סריג cytometry זרימת רגישות מזהה פעילות זריעת טאו 16. תאי 293T חד שבטיים HEK להביע טאו-RD-CFP / YFP היו transduced עם דגימות רקומביננטי או ביולוגיות, טופחו במשך 24-48 שעות, ונותחו על בסיס תא בודד באמצעות cytometry זרימה (). תאי unstimulated לשמור טאו-RD במדינה (B) monomeric, ואילו תאים שטופלו עם תכלילים המכילים זרעי תצוגת חומר בולטים (C). הערכה כמותית (ממוצע ± SEM) של מופעי פעילות הזריעה שסריג cytometry זרימה היא רגיש לריכוזי femtomolar (שווה ערך מונומר) של חומר זרע רקומביננטי וגילוי משתרע על פני שלושה סדרי הגודל (ד &#39;). שווה ערך מונומר מייצג את הכמות הכוללת של חלבון בתוך תגובת fibrillization ולא לתקן שלם ו# 160; התאגדות של מונומר לחומר מצטבר. לפיכך, הריכוז של אגרגטים בפועל (זרעים) חייב להיות קטן או שווה ל&#39;שווה ערך מונומר &quot;שלה. * השתנה מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53205/53205fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig2.jpg" /> איור 2. אסטרטגית gating לסריג cytometry זרימה. אוכלוסיית תא () וגופיית כפיל שערים / (ב) נמשכות עם זרימה סטנדרטית cytometry המתודולוגיה. שער סריג שווא (C) נמשך מהתאים בודדים חיוביים YFP לחסל YFP bleedthrough לתוך מסנן סריג. שער סריג (ד &#39;) בנוי מהתאים שטופל liposome ריקים, כגוןשסריג הרקע הוא ≥1%. שינוי אוכלוסייה לשער סריג מופיע לאחר טיפול בחומר הזרע חיובי (E) והמשמרת הופכת בולטת יותר ויותר עם ​​כמויות גדולות יותר של חומר זרע (F). קריאות סופיות כוללות:. אחוז סריג חיובי, עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של אירועי סריג-חיוביים, וצפיפות סריג המשולבת (תאים חיוביים אחוז הצפיפות המשולב סריג = * MFI) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53205/53205fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig3.jpg" /> התקדמות איור 3. פעילות זריעת טאו בעכברי P301S 16. פעילות זריעה (± אומר SEM) מhomogenates המוח של עכברי P301S ניכר בחודשים 1.5 בגזע המוח (), הניאוקורטקס (ב &#39;), באונה הפרונטלית (C), וההיפוקמפוס (ד&#39;). עם זאת, פעילות זריעה מעולם לא נצפתה בעכברי נוקאאוט טאו (&gt; 12 חודשים). פעילות זריעה עולה עם גיל ומקדימה את ההופעה של סמנים אחרים נפוצים היסטולוגית, כולל MC1, AT8, וPG5 (E). * הודפס מחדש באישור מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53205/53205fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig4.jpg" /> איור 4. תאימות של סריג cytometry זרימה עם דגימות ביולוגיות אנושיות 16. כאשר תאי biosensor טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם 20 מיקרוגרם lysate המוח אנושי, זריעה חזקה (ממוצע ± SEM) מתרחש בכל disea אלצהיימר נבדקמוח se, ואילו lysates שליטת מחלת מותאם-הגיל והנטינגטון חסר פעילות זריעה. * השתנה מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53205/53205fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig5.jpg" /> איור 5. יישומים אלטרנטיביים לסריג cytometry זרימת 16. נוירונים יסודיים transduced עם קידוד lentivirus טאו-טאו וCFP-YFP בונה. בהעדר זרעים אקסוגניים אין צבירה לכאורה (), אבל יש בנוכחות של זרעים (B). חיישנים עצביים להגיב מינון dependently לזרעי טאו רקומביננטי, גם בהיעדרו של משלוח בתיווך פוספוליפידים (C). טרום דגירה של רקומביננטי (ד) או דומקורות זרע (E) ological עם הפרין, מעכב ספיגה של זרע טאו תיווך HSPG, מכלה את סריג תגובה של תאי biosensor HEK 293T. מציג הערכה כמותית (ממוצע ± SEM). * השתנה מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53205/53205fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53205/53205table1.jpg" /> שולחן 1: שורות תאים בשימוש עם סריג cytometry זרימה. תאי 293T HEK משמשים לזרימה cytometry התקנה. תאים בודדים חיוביים CFP משמשים לפיצוי (*). תאים בודדים חיוביים YFP משמשים לחסל אות סריג שווא בשל הפעלה ישירה של YFP על ידי 405 עירור ננומטר. תאים כפולים חיוביים CFP / YFP הם סריג תואמים וישמשו כתאי biosensor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53205/53205table1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/53205/53205table2.jpg" /> טבלה 2:. Cytometer זרימת הגדרות לייזר ומסנן <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53205/53205table2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry at JoVE.com

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Video: Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

מיקרוסקופי שדה רחב פלורסנט וזרימת cytometry הדמית פלורסנט בטלפון סלולרי

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

טיסה חרקים באיתור ובסיווג עם חיישנים זולים

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.