This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

<ol>
	<li>Anand, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+activity+of+marine+bacteria+associated+with+sponges+from+the+waters+off+the+coast+of+South+East+India.">Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India.</a> Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).</li><li>Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+of+gram-positive+bacteria.">Bacteriocins of gram-positive bacteria.</a> Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li><li>Riley, M. A., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecological+role+of+bacteriocins+in+bacterial+competition.">The ecological role of bacteriocins in bacterial competition.</a> Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).</li><li>Tenover, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antimicrobial+resistance+in+bacteria.">Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria.</a> Am J Med. 119, S3-S10 (2006).</li><li>Farris, M. H., Steinberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitrecin+A,+an+endolysin-like+bacteriolytic+enzyme+from+a+newly+isolated+soil+streptomycete.">Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete.</a> Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).</li><li>Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysostaphin+Endopeptidase+Resistance+Gene+(epr)+Specifies+Modification+of+Peptidoglycan+Cross+Bridges+in+Staphylococcus+simulans+and+Staphylococcus+aureus.">The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).</li><li>Srivastava, K. K., Siddique, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+composition+of+peptidoglycan+of+Listeria+monocytogenes.">Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes.</a> Infect Immun. 7, 700-703 (1973).</li><li>Heilmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+peptidoglycan+of+the+cell+walls+of+Pseudomonas+aeruginosa.">On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa.</a> Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).</li><li>Schumann, P., Rainey, F., Oren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Taxonomy of Prokaryotes. 38, (2011).</li><li>Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metachromatic+agar-diffusion+methods+for+detecting+staphylococcal+nuclease+activity.">Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity.</a> Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).</li><li>Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dye+release+assay+for+determination+of+lysostaphin+activity.">A dye release assay for determination of lysostaphin activity.</a> Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).</li><li>Osserman, E. F., Lawlor, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+urinary+lysozyme+(muramidase)+in+monocytic+and+monomyelocytic+leukemia.">Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia.</a> J Exp Med. 124, 921-952 (1966).</li><li>Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+quantitation+of+antigens+by+single+radial+immunodiffusion.">Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion.</a> Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).</li><li>Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+lysozyme+using+Micrococcus+luteus+labeled+with+a+blue+dye,+Remazol+brilliant+blue+R,+as+a+substrate.">Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate.</a> Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).</li><li>Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymogram+with+Remazol+brilliant+blue-labeled+Micrococcus+lysodeikticus+cells+for+the+detection+of+lysozymes:+example+of+a+new+lysozyme+activity+in+Formosan+termite+defense+secretions.">Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions.</a> Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).</li><li>Pettersson, B., Eriksson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+spectrophotometric+assay+of+endoglycanase+activities+using+dyed,+amorphous+polysaccharides.">A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides.</a> Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).</li><li>Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloidal+chitin+stained+with+Remazol+Brilliant+Blue+R,+a+useful+substrate+to+select+chitinolytic+microorganisms+and+to+evaluate+chitinases.">Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases.</a> J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. חברת MITRE היא חברה שלא למטרות רווח פועלת מרכזי מחקר ופיתוח מספר במימון פדרלי (FFRDCs).

את assay דיפוזיה microslide ואת assay-שחרור לצבוע לספק יתרונות לגילוי ואפיון antimicrobials חלבון מזוהה קודם לכן. שיטות מהירות ורגישות אלה מאפשרות הקרנת תפוקה גבוהה של ספריות מקור אורגניזם לזיהוי אנזימים של עניין לפני השקעת משאבים במחקר גדול. כמו אנזימים היעד פרופיל גבוה מזוהים, וריאציות של מבחני זיהוי שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את האנזים במהירות או כדי לקבוע מאפיינים ביוכימיים של האנזים. לדוגמא, במהלך תכנית טיהור חלבונים רבה שלבים, assay דיפוזיה microslide יכול לזהות במהירות שברים המכילים את אנזים עניין. בנוסף, אופטימה תגובה עבור האנזים יכולה להיקבע על ידי שינוי מאגרי התגובה וטמפרטורות דגירה ב assay צבען השחרור. טווח המסה האנזים הדרוש לגילוי ב assay דיפוזיה microslide היא פונקציה של characteri אנזיםstics. מגבלות איתור של assay בדרך כלל דורשים את השימוש כמויות גדולות יותר של האנזים מאשר assay צבען שחרור. במחקר זה, השוואה של מגבלות זיהוי של assay דיפוזיה microslide (איור 1) אל assay-השחרור לצבוע (איור 4) מאוירת כי assay דיפוזיה microslide הוא טכניקה רגישה פחות assay צבען השחרור. כאשר ריכוז אנזים הוא לא חשש, assay microslide מאפשר סינון ראשוני מהיר של ספריות לייצור antimicrobials חלבון נגד מצעי יעד עם דרישות עבודה וציוד נמוכות. למרות הדורשים יותר מאמץ וציוד, assay-השחרור לצבוע רגיש יותר לשחזור, מניב תוצאות כמותיות המאפשרות השוואה בין מבחנים-שחרור לצבוע של אנזימים זהים או שונים עבור מצע נתון. שתי השיטות מבוצעות בקלות ברוב מעבדות מיקרוביולוגית ללא צורך במכשור מיוחד מאוד. בשנות ה representaמבחנים מופרזים, האנזים השליט, α-chymotrypsin, זוהה על סכומים נמוכים כמו 100 ננוגרם (איור 5) באמצעות assay צבען השחרור, בעוד הכמות המינימאלית זוהתה assay דיפוזיה microslide הייתה 1 מיקרוגרם (מידע לא מוצג). מתן שירות כמו assay זיהוי איכותי אנזימים מיקרוביאלית, מספר וריאציות של assay דיפוזיה דווח 11,13. לאחר בדיקת מבחנים אלה, assay דיפוזיה microslide פותח עבור הרגישות הגבוהה יחסית שלה כמסך ראשוני שלה להקל שמירת תגובה. שונה מן העבודה של Lachica et al. 11, שבו שכבות agarose שמשו כדי לזהות את הייצור של nucleases ידי זנים של Staphylococcus aureus, assay דיפוזיה microslide פועל באופן דומה לשיטת immunodiffusion רדיאלי 14 כמו החלבון מפזר מהבאר אל agarose המכיל את המצע. Immunodiffu רדיאלישיטת שיאון עוצרת את הרחבת האזור של immunoprecipitation כאשר המערכת מגיעה לשיווי משקל היווצרות מורכב בין אנטיגן לשדר הנוגדנים בתוך agarose. לעומת זאת, המצע של assay דיפוזיה microslide בתחילה הוא מתעכל על ידי מיקרוביאלית החלבון לשדר באזור מתקדם בקצב מזורז לתמס סביב הבאר. הקוטר גדל וההולך של האזור ממשיך עד האנזים מאבד פעילות או המצע הוא מותש. שיעור הייצור של האזור לתמס הוא התחיל להאיץ את הטוהר, ולכן הפעילות הספציפית, של האנזים או הריכוז של האנזים הוסיף לעליות היטב. לקבלת כמותית להערכת הפעילות האנזימטית של antimicrobials חלבון נגד הרג חום B. subtilis, assay-שחרור לצבוע נבחר. מבחני Colorimetric באמצעות צבע R כחול מבריק Remazol (RBB) -labeled מצעים לאפשר הערכה צדדית ורגישה של פעילויותיו חלבון מיקרוביאליתty. הידרוליזה אנזימתי של תוצאות מצע שכותרתו RBB בשחרור מוצרים כחולים מסיסים שניתן למדוד בקלות על ידי ספקטרופוטומטר ב 595 ננומטר. כמה וריאציות של assay צבען שחרור RBB, פותח על מנת לאפיין אנזימים מיקרוביאלית חלבון אחרים, להראות את הגמישות של assay זה עבור יישום עם מצעים אחרים. לדוגמה, בקביעת ההשפעות של lysostaphin פעילות bacteriolytic, ג&#39;ואו, et al., דיווחו על assay צבען שחרור באמצעות תאים staphylococcal צבוע RBB ו פפטידוגליקן staphylococcal כמו מצעים 12. בשנת שינוי של היישום של assay צבען שחרור RBB זה, מצע luteus Micrococcus RBB שכותרתו הוצע לשימוש כאמצעי מהיר ורגיש לאבחן מסך למחלות כגון זיהום חיידקים ואת הנוכחות של קרצינומה ממארת, אשר יכול להיות מתואמים ברמות הביטוי ליזוזים אדם בדם סרום 15. בנוסף, מצעי תא חיידק שכותרתו RBB ישסימפוני שמש שיטת zymogram לצורך זיהוי של ליזוזים 16. אנו מדגימים את גבול גילוי וריד, נוחות, ואת השחזור של assay צבען השחרור, המאפשר הקרנת ספרייה מהירה לייצור אנזים. שינויים של assay לאפשר מבחני אפיון ביוכימי כמותית במורד הזרם, כולל השפעות בגין טמפרטורה, pH, ומליחות וכן את ההשפעות של אנזימים מפרקי חלבונים אחרים על פעילות חלבונים מיקרוביאלית 6. בנוסף, assay צבען שחרור כמותי שניתן להשתמש בהם כדי להשוות את פעילות האנזימים מרובים עבור מצע נתון. את assay צבען שחרור RBB דיווחה השירות עבור אנזימים עם פעילות נגד סוכרים בנוסף לאפיון וזיהוי של סוכני מיקרוביאלית חלבון. Pettersson ו אריקסון דיווחה על assay לאיתור פעילות endoglycanase באמצעות חרוזים פוליסכריד אמורפי, RBB צבוע של תאית, xylan, mannan, וצ&#39;יטב 17. בשנת רחבה של ממצאים אלה, שיטה רגישה לגילוי של אנזימי chitinase המיוצרים על ידי Bacillus thuringiensis Bt-107 פותח באמצעות כיטין קולואידים שכותרתו עם RBB 18. ממחקרים אלה ואחרים, מקורות זמינים מסחרית של מצעים צבוע RBB צמחו לשימוש זיהוי של פעילות glycolytic, כולל אלה נגד קרטין, amylopectin, amylose, גליקוגן, laminarin, ד-xylan, גלוקן אזו-שעורה, ועמילן. במחקר זה, אנו מדגימים את השירות של assay-שחרור לצבוע במתכונת microplate, צמצום נפח המצע שכותרתו RBB ואנזים הנדרש כדי להפיק את התוצאה colorimetric. כפי שמודגם באיור 4 ואיור 5, assay צבען שחרור microplate מספק גבול הגילוי נמוך assay דיפוזיה microslide לגילוי הפעילות האנזימטית. לגבי שימוש מהיר, שימור העבודה, וקלות הפרשנות, המיקרופוןassay דיפוזיה roslide מספק שירות מסכי תפוקה גבוהה ראשוניים עבור הנוכחות של פעילות מיקרוביאלית כמו גם האינדיקציה של נוכחות חלבון מיקרוביאלית בצעדי טיהור ובידוד חלבון במורד זרם. השילוב של מבחני שני אלה משלימים זה את זה את הסינון הראשוני ואפיון האולטימטיבי של antimicrobials חלבון הרומן

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and &#945;-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>3078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP162-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-chymotrypsin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215227205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 168</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>23857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cork borer</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>H-9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McFarland equivalence standard (2.0)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R20412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microslides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-38-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25959B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptidoglycan of Bacillus subtilis 168</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69554-10MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (1&#215;)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remazol brilliant blue R dye (RBB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica subsp. enterica</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S227-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film</td>
			<td>Diversified Biotechnology</td>
			<td>T-TOPS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose solution 
			50 ml PBS 
			0.25 g agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient broth medium 
			4 g nutrient broth 
			500 ml Type I water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 
			1 g NaOH 
			99 ml Type I water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 
			1.25 g RBB 
			98.75 ml 250 mM NaOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

<html> את assay דיפוזיה microslide ואת assay צבען שחרור כמותית הם שיטות יעילות לסינון ומדידת תחקיר ראשוני של antimicrobials החלבון החדש. יש assay כל יתרונות ומגבלות; עם זאת, כאשר היא מבוצעת בשיתוף, הם מאפשרים סינון ראשוני מהיר ואפיון בסיסי של מיקרוביאלית. את assay דיפוזיה microslide מאפשר ביעילות להקרנה מהירה של ספריות מיקרוביאלי, ייצור antimicrobials חלבון. כאשר רמות ריכוז האנזים הן בעלי העניין, רגישות של אילוצי זיהוי עלולה להגביל את assay, הדורשת כמות גדולה יותר של אנזים שיתווסף התגובה היטב מאשר assay צבען השחרור. כמו באיור 1, המאפיינים האיכותיים של assay לאפשר לצופה להשוות כמויות אנזים ביחס נוכחיות בתוך כל טוב. together.within-page = &quot;1&quot;&gt; ב אזור הפיתוח של התפרקות באיור 1A (25 מיקרוגרם של אנזים), את הקצה המוביל של האזור מציג תמוגה עכורה או לא שלמה של המצע, בזמן שהאזור קרוב הבאר מציג תמוגה מצע שלם יותר. תופעה זו, תוצר של הריכוז הפוחת של האנזים לשדר בחוד החנית, מסבכת את המדידה המדויקת של קוטר האזור. ככל B בארות (15 מיקרוגרם), C (10 מיקרוגרם), ד &#39;(5 מיקרוגרם), E (1.0 מיקרוגרם), ו- F (0.1 מיקרוגרם) הם נצפו באיור 1, בקוטר של אזור לתמס המלא מתפוגג להכחדה התאמת לסכום של אנזים המופחת. למצב F (0.1 מיקרוגרם), ריכוז האנזים בתוך agarose נמוכה מהגבול שיאפשר האנזים לשדר להיות דמיינו כפי שהוא נע דרך agarose, hydrolyzing המצע. את assay דיפוזיה microslide היה גם להפעיל באמצעות pepti subtilis Bacillus מטוהריםdoglycan כמו מצע (איור 2). בזמן שהאזור פחות מוגדר מאלה שנצפו עם enterica כל תא סלמונלה בשל הרתיעה של פפטידוגליקן להשעות באופן שווה ב agarose, הידרוליזה של פפטידוגליקן ידי האנזים מיקרוביאלית הידוע ניכרת. את assay צבען שחרורו הוא assay רגיש יותר תכליתי מאשר assay דיפוזיה microslide, המאפשר להגביל את גילוי נמוך וריאציה של גורמים סביבתיים המשפיעים על תגובת האנזים. ב מבחני נציג, הטמפרטורה היתה מגוונת כדי לקבוע את הטמפרטורה האופטימלית עבור האנזים מיקרוביאלית, נחושה בדעתה להיות 35 מעלות צלזיוס PBS (איור 3). אופטימלי זה נראה בבירור את supernatants התגובה כפי כמויות מוגברות של צבע הכחול (איור 3) וכן ייצג ביחידות פעילות הנגזר ממדידות ספיגות ב 595 ננומטר (איור 3 א). הצדדי של assay צבען השחרור מאפשר לחוקר להשתנות לא רק טמפרטורות אלא גם למאגר התגובה ורכיבי חיץ כדי לקבוע תנאי דגירה אופטימליים במהירות עבור אנזים נתון. רמת הפעילות של האנזים מיקרוביאלית הידוע (איור 4) ואת אנזים שליטת chymotrypsin α (איור 5) נמדדה בטמפרטורת הדגירה אופטימלית נקבעה 35 מעלות צלזיוס PBS נגד subtilis Bacillus שכותרתו RBB מצע חום-הרג. השוואת תוצאות איור 4 ואיור 5 עולה כי האנזים מיקרוביאלית הידוע יש כמעט פי שתיים הזיקה B. מצע subtilis. בנוסף, השליטה α-chymotrypsin לא לגמרי לעכל את B.-נהרג חום subtilis מצע בתוך הבאר (מידע לא מוצג). הפעילות של שליטת chymotrypsin α מתחילה צלחתau סביב 0.3 מיקרוגרם לעומת המשך עליית יחידות פעילות בכל כמויות האנזים עבור האנזים מיקרוביאלית הידוע (איור 4 ואיור 5). הדבר עשוי להעיד כי האנזים הידוע יש פעילות מתמשכת יותר או שיש מספר גדול יותר של אתרים מחשוף לרשות האנזים בתוך B. מצע subtilis. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> איור 1:. פעילות האנזים נגד התשתית שלמות התא enterica סלמונלה את assay דיפוזיה microslide שימש איכותית כדי להעריך את פעילותו של חלבון ידוע מיקרוביאלית נגד subsp enterica סלמונלה-נהרג חום enterica (ATCC 10708).. המוני החלבון של מיקרוביאלית הידועה המרחפים פוספט שנאגר מלוח (PBS) כי נוספו בארות בהתאמה שלהשקופיות כלל 25 מיקרוגרם (באר), 15 מיקרוגרם (טוב B), 10 מיקרוגרם (גם C), 5 מיקרוגרם (טוב D), 1 מיקרוגרם (גם E), ו -0.1 מיקרוגרם (טוב F). PBS לבד שמש הבקרות השליליות של המבחנים. האזורים לתמס הם צלמו לאחר דגירת hr 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> איור 2:. פעילות האנזים נגד subtilis Bacillus פפטידוגליקן Cell החומה assay דיפוזיה microslide שימש איכותית להעריך את פעילותו של חלבון ידוע מיקרוביאלית נגד פפטידוגליקן של Bacillus subtilis 168. נתלה ב 20 μl של PBS, 10 מיקרוגרם של מיקרוביאלית הידועה התווסף גם א &#39;של microslides. PBS לבד שמש שלילימלא עבור assay (טוב B). אזור לתמס היה צלם לאחר דגירת 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> איור 3:. טמפרטורת תגובה אופטימלית של חלבון אנטימיקרוביים הרבגוניות של assay-השחרור לצבוע מאפשרת הווריאציה של פרמטרים פיסיקליים וכימיים, כגון טמפרטורות דגירה או מאגר, כדי לקבוע ההשפעות שלהם על פעילות אנזים עניין 6. כפי שמודגם באיור זה, על פעילות מיקרוביאלית החלבון הידועה (1 מיקרוגרם) הוערכה ב PBS נגד RBB שכותרתו שחוט חום subtilis Bacillus תחת מגוון של טמפרטורות דגירה. מוצג כיחידות פעילות (AU) ב (א), ספיגת-b RBBound מוצרים מתפזרים supernatant לאחר הידרוליזה נמדדה ב 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate. בכל מצב טמפרטורה, תגובות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר נובעות דגירה בטמפרטורה השונה. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד טמפרטורת דגירה הם צלמו לפני המדידה ספיגה (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> איור 4:. טווח פעילות של חלבון אנטימיקרוביים טווח הפעילות עבור מיקרוביאלית החלבון הידועה נמדד כיחידות פעילות לאחר incubations הלילה עבור 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ו -1,000 ng , כפי שהיא נמדדת על ידי prot BCAassay עין (א). לתגובות אלו, RBB שכותרתו B. subtilis מצע הרמה הוגדלה לתת צפיפות אופטית של 5.0 ב 595 ננומטר על מנת להבטיח כי התגובה עם הסכום הגבוה ביותר של אנזים (1,000 נ&quot;ג) לא לגמרי hydrolyze כל המצע הזמין בתוך תקופת דגירת תגובה. תגובות שליטות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר הנגרם על ידי הדגירה לבד. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד מסכומי אנזים הם צלמו לפני מדידות ספיגות (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> איור 5:. טווח פעילות עבור α-chymotrypsin טווח הפעילות-chymotrypsin α נמדד כמו Activיחידות ity לאחר incubations לילה עבור 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ו -1,000 ng של האנזים (א). לתגובות אלו, RBB שכותרתו B. subtilis מצע הרמה הוגדלה לתת צפיפות אופטית של 5.0 ב 595 ננומטר על מנת להבטיח כי התגובה עם הסכום הגבוה ביותר של אנזים (1,000 נ&quot;ג) לא לגמרי hydrolyze כל המצע הזמין בתוך תקופת דגירת תגובה. תגובות שליטות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר הנגרם על ידי הדגירה לבד. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד מסכומי אנזים הם צלמו לפני מדידות ספיגות (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

qualitative-quantitative-assays-for-detection-characterization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K Views.  The MITRE Corporation. Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Video: Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...