This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. הכנת Supernatant להיבדק עבור פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל של C mitomycin ידי המסת את הכמות המתאימה לתוך 0.1 סטרילי חיץ M MgSO 4 (חיץ למשל 1 מ&quot;ג mitomycin C / 2 מ&quot;ל). חנות המניה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל מוגן האור (C mitomycin רגיש לאור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של פ syringae לתוך 3 מיליליטר של B הבינוני של המלך (KB) מרק 14. דגירה במשך הלילה עם רועד (200 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר (21-25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לדלל את התרבות מרק 1/100 לתוך 3 מ&quot;ל של מרק KB טריים. דגירה של 3-4 שעות עם רעד בטמפרטורת החדר. להוסיף C mitomycin (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, הריכוז הסופי). דגירה התרבות במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר. הערה: mitomycin C גורמת הפסקות DNA גדילים כפולות, ובכך ממגרת את תגובת ה- SOS של התא, המוביל ליצירה של שני בקטריופאג ו bacteriocins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1-2 מ&quot;ל mitomycin C המושרה תרבויות על ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 5 דקות ב microcentrifuge הספסל העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לעקר supernatants תרבות או על ידי העברת supernatant דרך פילטר גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר או על ידי טיפול supernatant עם כלורופורם (100 כלורופורם μl לכל 1 מ&quot;ל supernatant). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות כלורופורם, המערבולת התערובת במשך 15 שניות ולתת דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות. הערה: כלורופורם ביעילות הורג תאים על ידי solubilizing הקרומים שלהם. היתרון של שימוש כלורופורם על עיקור מסנן הוא שזה זול יותר וקל יותר לגמלן אם עיבוד רב (&gt; 20) דגימות בכל פעם. תיתכן אפשרות כי פעילות הרג נתונה אבודה לאחר טיפול כלורופורם כתוצאת מחיצות לשלב האורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השלב העליון, מימי באמצעות pipet 1 מיליליטר ל 1.5 או 2.0 מיליליטר טרי, סטריליצינור microfuge. היזהר שלא להעביר כל שכבת כלורופורם הנמוכה (עדיף להסיר פחות של השלב המימי כדי למנוע מעל carry). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה supernatant הועבר ופתחה במנדף לאפשר כלורופורם שיורית להתאדות (כמה שעות). supernatants חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. ההפרדה וריכוז של תרכובות חיידקים משקל מולקולרי גבוה ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי supernatant סטרילי, להוסיף NaCl ו PEG 8000 עד 1 מ &#39;ו -10% ריכוזיים סופי, בהתאמה. שוב ושוב להפוך את המדגם עד שני NaCl ו PEG מתמוססים לחלוטין. דגירה דגימות באמבט קרח למשך שעה 1 או לילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C.. גלולה צריכה טופס בתחתית הצינור צנטריפוגות. למזוג supernatant ו resuspend גלולה בנפח הרצוי (כגון 1/10 או 1/100 של vol supernatant המקוריume) של חיץ (10 מ&quot;מ טריס, 10 מ&quot;מ MgSO 4, pH 7.0) על ידי pipetting חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PEG שיורי על ידי שתי עקירות רציפות עם נפח שווה של כלורופורם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב כלורופורם עם הגלולה ו המערבולת המושעית למשך 10 עד 15 שניות, ואז צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות. מעביר את השלב העליון, מימית לצינור microfuge טרי. חזור על החילוץ הזה עד אין ממשק לבן בין השלב המימי ואורגני גלוי (בדרך כלל 2 עקירות סכות הכל). אפשר כלורופורם שיורית להתאדות מן supernatants חילוץ במנדף. </li></ol></li></ol> 3. הכנת השכבה ובדיקת Supernatants עבור פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של זן פ syringae להיבדק עבור רגישות לתוך 3 מ&quot;ל של KB, דגירה במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, חזרה לדלל את התרבות 1/100 לתוך KB הטרי. דגירה 3-4 שעות עם רועד ב חדר טמפרטורותמִחָדָשׁ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אגר מים מעוקרים ידי מעוקר% השעית 0.35-0.7 (w / v) אגר במי ultrapure. הערה: מלאי של אגר מים רכים יכולים להיות נמס במיקרוגל ולעשות בהם שימוש חוזר שוב ושוב, כיסוי טרי לא צריך להיות מוכן עבור כל ניסוי. אם אגר מים לשימוש חוזר, זה קריטי כדי לוודא שהוא נמס לגמרי בא במיקרוגל. אם לא, את שכבת-העל יצטרך מרקם מחוספס על ולהתגבש שיגרום פרשנות קשה. במקרה זה, להמיס את אגר במשך כמה דקות יותר במיקרוגל מאשר לעשות בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על אגר רך המותך באמבט מי C ° 60 לפני השימוש. שימוש pipet סרולוגיות סטרילי, העברת 3 מ&quot;ל של אגר רך לצינור תרבות סטרילי. החזר את צינור התרבות באמבט מים כדי לשמור אותן במצב מותך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפוך את הכיסוי, ראשון לאפשר אגר מותך להתקרר (זה צריך להרגיש חמים אך לא חם למגע), אך אינו מאפשר לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף סטרילי, לחסן 100 μl שלתרבות הזן הבוחן לתוך אגר ו המערבולת הרכות לערבב. סובב תרבות ביד במשך 10-15 שניות, ואז לשפוך על גבי (אגר KB) אגר תחתון. הטה את הצלחת לכל הכיוונים כדי להבטיח את אגרתי הרך באופן ברור מכסה את אגר התחתון. הערה: אגר התחתונה יכול להיות כל הקרושה (1.5% אגר) בינוני שבו זן הבדיקה גדל במרץ. עבור צלחת בקוטר סטנדרטי 100 מ&quot;מ פטרי, השתמש ~ 20 מ&quot;ל נמס בינוני. אגר התחתונה אפשר להכין כמה שבועות לפני הזמן (אם שמרו על 4 מעלות צלזיוס ללא ייבוש) או ניתן להכין באותו יום. אם מוכן באותו היום כמו ביצוע הכיסוי, עדיף לעשות זאת לפני שלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת ולאפשר לו 20-30 דקות כדי לחזק. היזהר שלא להפריע את הצלחת תוך לחיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקרושה, במקום 2-5 μl של supernatant (שנוצר בסעיפים 1 ו -2 לעיל) על השכבה. אפשר הצלחות כדי לדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר. להתבונן תוצאות שיא למחרת בבוקר. הערה:עשוי להיות שימושי כדי לבצע ספוט מתוך דילול סדרתי של supernatant. זה יאפשר לחוקרים להבחין בין בקטריופאג ואת פעילות הסליקה bacteriocin. במקרה זה, מומלץ לבצע 1: 5 או 1:10 דילולים. </li></ol>

<ol>
	<li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics.">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li><li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth's+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges.">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li><li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas.">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li><li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicin+Biology.">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li><li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+Microbial+Invasions:+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare.">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li><li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins.">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li><li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas.">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li><li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins.">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li><li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae.">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li><li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage.">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li><li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diversity+of+Bacteriocins+in+Gram-Positive+Bacteria+.">The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria .</a> Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

טכניקת הכיסוי הרך אגר המתוארת כאן יושמה נרחבת במשך עשרות שנים רבות על ידי חוקרים מעוניינים ופאג&#39;ים או bacteriocins. היתרונות העיקריים של גישה זו הם כי הוא פשוט, זול יחסית קל לפרש. על ידי שילוב של כיסוי רך אגר עם ממטרים PEG ו דילול סדרתי, סוכני מיקרוביאלית ניתן לחלק גבוה לעומת סוכנים משקל מולקולרי נמוך, בשכפול הדנ&quot;א לעומת סוכנים שאינם בשכפול הדנ&quot;א (כלומר בקטריופאג לעומת tailocin, בהתאמה). לבסוף, שילוב של מניפולציה גנטית ממוקדת (מחיקות שלמות) של bacteriocin המשוערת או לוקוסי prophage יכול לקבוע את זהותה בתקיפות של תרכובת נתונה אנטגוניסטית. השתמשנו לאחרונה בשיטה זו כדי לתאר בקטריופאג הנגזרות חדש bacteriocin הרווחת בקרב Pseudomonas syringae זנים 9. תקשורת הצמיחה ותנאים מצוינים עבודה בפרוטוקול זה גם עבור Pseudomonas סאיםringae ו יספיק סביר עבור חיידקים גראם-שלילי אחרים הגדלים במרץ בתנאים אלה. עם זאת, חוקרים בשיטה זו ירצו לייעל את העיתוי, בינוני התרבות, שיטת אינדוקציה, וטמפרטורת דגירה של המערכת שלהם. הפרמטרים הקריטיים כוללים גרימת התרבות לייצר תוך בשלב צמיחת הלוגריתמים, כמו גם זריעת הכיסוי רך אגר עם תרבות בשלב לוגריתמים מספיק כדי להבטיח חלוקת חיידקים אחידה, אבל לא התרבות יתר, אשר מטשטשת אזורי סליקה פוטנציאליים. ישנם bacteriocins רב שאינם מושרים במסגרת תגובת ה- SOS, אלא הם המושרה באמצעות מערכות חישה קוורום מבוסס פפטיד (במיוחד bacteriocins גראם חיובי 15), ובכך, חוקר אולי כדאי להקרין כמה שיטות אינדוקציה שונות (כגון שינוי תוכן תזונתי של גרימה בינונית, או המאפשרים דגירה ממושכת של זן הייצור). בעת שימושבטכניקה זו, הכיסוי רך אגר חייב להיות נמס ביסודיות ומתוחזק על 55-60 מעלות צלזיוס לפני התוספת של זן הזריעה. היו לנו כמה בניסויים שבם-אגר הרך לא הותך ביסודיות (אם כי מבחינה ויזואלית זה נראה) וגרם שכבה עם מראה מגורען. תוצאות מ שכבה מגורענת עדיין יכולות להיות וניתנות לפרשנות בדרך כלל, עם זאת, זה תלוי את הכח של העיכוב (עיכוב החלש יהיה קשה יותר כדי לצפות). השתנו סופי, בלבול שיש להביא בחשבון בעת ​​השימוש בטכניקה זו היא שהטמפרטורה של אגר המותך מותרת מספיק זמן להתקרר לפני חיסון עם זן הזריעה, כדי למנוע הרג את מתח הזריעה. כדי למנוע בעיה זו, אנו להבטיח את אגר רך חם, אבל לא חם, לגעת. ברוח דברים אלה, יש לנו גם ציינו כי אם אנחנו נותנים זמן מספיק בשביל תרבות זריעה להסתגל אגרתי המותך, לפני מזיגת הכיסוי, אנחנו מחלצים גרמו חיידקי עניים בדרך כללrowth, מה שהופך פרשנות של עיכוב ספציפי קשה או בלתי אפשרי לפרש. זו הסיבה שאנו מאפשרים 10-15 שניות נוספות של דגירה בין vortexing ושופך השכבה. Trade-off בין השמירה על אגר במצב מותך לחלוטין (חם עדיף) אך לא חשף את מתח הזריעה (חם הוא לא טוב יותר) הוא אחת כי סביר להניח שאתה צריך להיקבע על ידי חוקר באמצעות ניסוי וטעייה. אם צעד ממטרי PEG משמש, זה יהיה מועיל לכלול שליטה שלילית שבו מדיום מרק סטרילית מעובד זהה supernatant התרבות. פעולה זו תבטיח כי הרג הפעילות אינה תוצאה של PEG שיורית או כלורופורם בתוך supernatant המדגם. כפי שניהם ופאג&#39;ים ו bacteriocins נוטים להיות מאוד ספציפי, אין זה נדיר להיתקל אין פעילות הרג לכאורה עם שילוב של זנים נתונים. זה יכול לנבוע ממגוון מחדש זן ספציפימנגנוני sistance, אחד להיות כי המתח הבוחן או חסר או יש גרסה לא מוכרת של הקולטן דרושי מיקוד ידי bacteriocin או bacteriophage נתונים. שיטה חלופית, שיטת הקרנת bacteriocin תוארה על ידי קאוואי et al. , אבל סובל חסרונות ולא אומצה 16 נרחב. באופן ספציפי, טכניקה זו מחייבת התבוננות דגימות מרק במרווחי זמן שיכול להיות מעיק, ואינה מאפשרת לאפליה בין פעילויות הרג בקטריופאג נגזרות bacteriocin הנגזרת. המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא כי הוא אינו מתאים גם עבור אורגניזמים שאינם גדלים וחסון (ובכך יחסרו אזורי סליקה להבחין בקלות) או כי prophages הנמל או bacteriocins שלא מיוצרים וחסונה בתנאי מעבדה. לאימוצו של הטכניקה הזו כדי לזהות bacteriocins מיוצר דגימות סביבתיות הן ירחיב את תוכנית השירותבטכניקה זו ולהקל להבין טוב יותר את התפקיד של bacteriocins בתוך סביבה טבעית.

לאחרונה, חלה התעניינות משמעותית להעמקת ההבנה שלנו של אקולוגיה של חיידקים (בעיקר microbiomes של סביבות שונות), כמו גם תרכובות אנטיבקטריאלי חדשות להשתמש במאבק פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה 1,2. נושא מקשר בין האינטרסים אלה הוא הבנת אינטראקציות אנטגוניסטית בין זני חיידקים בסביבתם הטבעית. ישנן דרכים רבות בהן חיידקים להרגיז המתחרים 3. Bacteriocins, קבוצה מגוונת של תרכובות חלבוניים, אנטיבקטריאלי, נחקרו ארוכות על תפקידם בתיווך אנטגוניזם interbacterial, עם שני המינים הנחקרים ביותר להיות Pseudomonas aeruginosa 4,5 ו Escherichia coli 6, פתוגנים אנושיים חשובים. בנוסף bacteriocins, המושרה prophages יכול גם פועלים כסוכני anticompetitor, המאפשר זן לפלוש לתוך נישה כי כבר יישבו 7. Pseudomonas syringae הוא פתוגן צמח ידוע לייצר מערך סוכני מיקרוביאלית, כולל bacteriocins חלבון היחיד 8, נגזרות זנב בקטריופאג bacteriocins 9 (המכונה tailocins), כמו גם מטבוליטים משניים שאינם חלבוניים 10. לאחרונה חלה התעניינות בהבנה כיצד antimicrobials אלה משפיע על האקולוגיה של האורגניזם הזה, כמו גם איך הם יכולים להיות רתומים לשלוט צמח מחלה 11. שיטת שימוש נרחבת ללימוד הוא bacteriocins ו בקטריופאג היא טכניקת הכיסוי הרכה-אגר. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Gratia בשנת 1936 על מנת לסייע בתהליך ספירת 12,13 bacteriophage. כאן אנו מתארים את יישום שיטת הכיסוי הרך-אגר, בשילוב עם מניפולציה גנטית ממוקדת פוליאתילן גליקול (PEG) ממטרים, שחר להבחנה בתוך שלושה סוכנים מיקרוביאלית שונים (א בקטריופאג, bact משקל מולקולרי גבוהeriocin, וכן bacteriocin משקל מולקולרי נמוך) המיוצר על ידי זן חיידקים אחד. היתרון של גישה זו הוא כי זה יחסית פשוט וזול, וזו הסיבה, למרות היותו זה בהחלט &quot;לואו-טק&quot;, הוא עדיין שימוש נרחב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:140px;">sc-3514</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34854</td>
			<td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacteriological grade agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-274</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

הטכניקה כיסוי רך אגר פותחה במקור לפני למעלה מ -70 שנה ויש בו נעשה שימוש נרחב מספר תחומי מחקר מיקרוביולוגי, כולל עבודה עם ופאג&#39;ים ו bacteriocins, סוכנים אנטיבקטריאלי חלבוניים. גישה זו היא זולה יחסית, עם דרישות משאבים מינימאליות. טכניקה זו מורכב תצפית supernatant מן זן תורם (מחסה פוטנציאל תרכובת רעילה (ים)) על גבי כיסוי אגר רך הקרושה כי הוא זרע עם זן מבחן בקטריאלי (שעשוי להיות רגיש אל התרכובת הרעילה (ים)). ניצלנו בטכניקה זו כדי להקרין ספריה של Pseudomonas syringae זנים להרג intraspecific. על ידי שילוב גישה זו עם צעד ממטר ומחיקות גן ממוקדות, תרכובות רעילות מרובות המיוצרות על ידי הזן הזהה יכולות להיות מובחנות. שני הסוכנים אנטגוניסטית התאוששו בדרך כלל באמצעות טכניקה זו הם ופאג&#39;ים ו bacteriocins. סוכנים שני אלה יכולים להיות מובחנים באמצעותשתי בדיקות נוספות פשוט. ביצוע דילול סדר על supernatant המכיל בקטריופאג יגרום הפלאק בודד אהיה פחות במספרים עם דילול גדול יותר, ואילו דילול סדרה של supernatant המכיל bacteriocin יגרום אזור קרחת הופך אחיד יותר עכור עם דילול גדול יותר. בנוסף, בקטריופאג יפיק אזור סליקה כאשר הבחין על שכבה אגרה רכה טריה זורעת עם הזן הזהה, ואילו bacteriocin לא יצר אזור סליקה כאשר הועבר מדשאה אגרה רכה טריה, בשל הדילול של bacteriocin.

השילוב של הכיסוי אגר הרך ממטרי PEG יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין סוכני מיקרוביאלית שונים המיוצרים על ידי אותו הזן. איור 1 מציג שני זנים של פ syringae (A ו- B) כי מעוכבים על ידי זן שלישי מאותו המין. שני הזנים, לעומת זאת, מעוכבים על ידי bacteriocins השונה. אזור סליקת זן מפגין קצה חד, ואילו אזור סליקת B מתח הוא גדול, והוא מציג גבול הלא חדה. מניפולציות גנטיות בתוך הזן לייצר באופן ספציפי להשבית גם את tailocin (tailocin לקוי) או משקל מולקולרי נמוך bacteriocin (bacteriocin לקוי) לאשר כי זני A ו- B רגישים bacteriocins הברור. איור 2 מראה כי הרג בתיווך בקטריופאג ניתן להבחין בין antimicrobials הלא בשכפול הדנ&quot;א האחר על ידי השוואת סדרת דילול. מכיוון שגם bacteriocins וprophage יכול להיגרם על ידי טיפול C mitomycin, פעילותם של שני חומרים אלה יכולים להידמות הדוק זה לזה (במיוחד אם הפאג מופעל בשפע). במקרה של סליקה בתיווך בקטריופאג, דילול של supernatant יפתור לתוך הפלאק בודד (אזורי סליקה) בעוד סליקת bacteriocin בתיווך לא תפתור לתוך הפלאק כזה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> איור 1: הבחנה פנוטיפי של סוכני מיקרוביאלית מרובים המיוצרים על ידי הזן הזהה. זן הוא רגיש bacteriocin משקל מולקולרי גבוה (tailocin) אך לא משקל מולקולרי נמוך אלטרנטיבה bacteriocin, כפי שמעידים חוסר סליקת זן tailocin הלקוי, אך לא זן bacteriocin הלקוי. לעומת זאת, זן B הוא חסר רגישות tailocin, אבל הוא רגיש bacteriocin המשקל המולקולרי הנמוך. Tailocin הוא efficiently התאושש הבאים ממטרים PEG, בעוד bacteriocins משקל מולקולרי נמוך אינם. WT = סוג בר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> איור 2: הבחנה בין אי-בשכפול הדנ&quot;א antimicrobials ופאג&#39;ים. (א) דילול של כייל גבוה של תוצאות ופאג&#39;ים פלאק הבודד שהופכים פחות רב (למעלה כייל גבוה, בתחתית כייל נמוכה). (ב) דילול של תוצאות bacteriocins בסליקה פחות אחיד כי אינו פותר לתוך הפלאק בודד. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds at JoVE.com

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K Views.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Video: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

השימוש חסרי חוליות גלריה מלאבלה כמודל זיהום לחקור את מתחם שחפת של פטרת

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...