אנו מודים לד&quot;ר אנט שלאגטר לבדיקה של כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי CP120017 מענק מטעם למניעת סרטן מכון המחקר של טקסס (PI: GJL).

<ol>
	<li>Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+deamination+is+a+major+cause+of+baseline+noise+in+next-generation+sequencing.">Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing.</a> Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).</li><li>Choudhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+integrated+clinical+workflow+for+targeted+next-generation+sequencing+of+low-quality+tumor+DNA+using+a+51-gene+enrichment+panel.">Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel.</a> BMC Med Genomics. 7, 62 (2014).</li><li>Sah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+DNA+quantification+guides+accurate+next-generation+sequencing+mutation+detection+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tumor+biopsies.">Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies.</a> Genome Med. 5 (8), 77 (2013).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+gene+mutations+in+clinical+formalin-fixed,+paraffin-embedded+colorectal+tumor+specimens+using+targeted+next-generation+sequencing.">Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing.</a> Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).</li><li>Latham, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tumor+biopsies:+navigating+the+perils+of+old+and+new+technology+to+advance+cancer+diagnosis.">Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).</li><li>Crawford, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+business+of+genomic+testing:+a+survey+of+early+adopters.">The business of genomic testing: a survey of early adopters.</a> Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).</li><li>Smith, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+technology+platform+for+the+rapid+analysis+of+clinically+actionable+genetic+alterations+and+validation+for+BRAF+p.V600E+detection+in+1549+cytologic+and+histologic+specimens.">A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens.</a> Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).</li><li>Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tumor+sequencing+on+the+use+of+anticancer+drugs.">Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+validation+of+a+next-generation+sequencing+screen+for+mutational+hotspots+in+46+cancer-related+genes.">Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes.</a> J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+highly+multiplexed+PCR+with+semiconductor-based+sequencing+for+rapid+cancer+genotyping.">Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping.</a> J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).</li><li>McCall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+multiplex+PCR-based+next-generation+sequencing+have+unique+signatures.">False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures.</a> J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).</li><li>Schleifman, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+MUT-MAP,+a+high-sensitivity+high-throughput+microfluidics+chip-based+mutation+analysis+panel.">Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel.</a> PLoS One. 9 (3), e90761 (2014).</li><li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing.">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 7, 23 (2014).</li><li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+measurement+of+hotspot+mutations+in+tumor+DNA+in+blood+using+error-suppressed+multiplexed+deep+sequencing.">Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing.</a> Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).</li><li>Hagemann, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+next-generation+sequencing+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer.">Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer.</a> Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).</li><li>Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+somatic+genetic+alterations+in+tumor+specimens+by+exon+capture+and+massively+parallel+sequencing.">Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing.</a> J Vis Exp. (80), e50710 (2013).</li><li>Simen, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+next-generation-sequencing+cancer+panel+for+use+in+the+clinical+laboratory.">Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory.</a> Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).</li></ol>

JH, AH, RZ, BCH, ואת GJL הם עובדים ויש להם בעלות המניות Asuragen, Inc. RZ, BCH, ואת GJL הם-ממציאים שיתוף על בקשת פטנט לשיפור גרסה מתקשר שימוש במידע מספר עותק amplifiable נקבע עבור כל דגימה.

טכנולוגיות NGS הגדירו מחדש ציפיות לחקור את הפרופילים המולקולריים של ביופסיות גידול במסגרות קליניות 9. מספר לוחות NGS ממוקד פותחו טכנולוגיות מחקר, בדיקות שפותחה במעבדה, ומוצרים זמינים מסחרית ופאנלים מנהג להערכת סוגים שונים של דגימות קליניות 3,5,10-15. מדיווחי מחקרים רבים הוכיחו את הערך של NGS ככלי קליני רגיש וספציפי לצורך זיהוי של שינויים גנומיים 3,10-12,14. עם זאת מחקרים הוכיחו גם את הסיכון של חפצים אשר יכול לגרום לתוצאות חיוביות שגויות ביופסיות החולים בסרטן קשות כגון FFPE דגימות 2-5,12,14. בנוסף, פרסומים אחרונים הדגישו שיעורי כישלון גבוהים עבור NGS באמצעות אונקולוגיה דגימות 16 ושיחות חיוביות שגויים עם לוחות מסחריים ממוקדים NGS כי הן מחמירות על ידי השימוש DNA נמוכה קלט 12. כתוצאה מכך, כמה laboraטורים או שינית או הוספת בדיקות נוספות ויתרות לטכנולוגיות NGS ממוקדות זמינות מסחרי כדי לשפר את ביצועים, לעתים קרובות כדי להבטיח דיוק או לאשר את הממצאים מן bioinformatic מנתח 5,10,11. פנל 21-הגן (האיור 2) פותח כתוכן ממוקד עבור מערכת NGS מקיפה לחקור מבוסס-ראיות, מוטציות תביעה בסוגי דגימה מאתגרות כגון FFPE וביופסיות גידול FNA. זרימת העבודה יש מספר היתרונות: 1) עקבי על ידי מתן כיסוי amplicon אחיד (איורים 3 ו -4, טבלה 3); 2) וקלות לשימוש על ידי מתן טרום ניסח, ערכות מגיב אופטימיזציה, ולפשט את דרישות ביואינפורמטיקה; 3) יעיל על ידי ייעול העבודה והפחתת מספר צעדי pipetting לעומת שיטות NGS המסחרי אחרות; דיוק ו -4) על ידי שילוב של assay QC DNA להערכת amplifiמספר עותק דנ&quot;א מסוגל שמנווט תבנית מקובל למנוע תנודות סטוכסטיים זיהוי גרסה 4. השילוב של נתוני QC מראש אנליטי עם ניתוח ביואינפורמטיקה מאפשר לתשומות נמוכות של דנ&quot;א FFPE. זו הושגה על ידי אימון אלגוריתם עץ החלטות באמצעות עותקים פונקציונליים שונים של קלט DNA על פני 400 דגימות FFPE באמצעים עצמאיים של אמת, ושילוב אלגוריתם זה לתוך תוכנת bioinformatic. כתוצאה מכך, הקלט המומלץ של 400 עותקים amplifiable, בדרך כלל שווים ערך ל ~ 5-20 ng של DNA FFPE, משווה לטובה לשיטות אחרות 10-12, כולל העשרת הכלאה המבוססת שבו ~ 250 ng של DNA FFPE מומלץ 17,18 . למרות הטכניקה מתוארת לשימוש בפלטפורמת MiSeq, זה יכול להיות שונה באמצעות פריימרים PCR תג עם מתאמים ספציפי מכשיר, שנועד לאפשר ניתוח רצף בפלטפורמות NGS אחרים. מספר צעדים חיוניים כדי להבטיח הצלחהשל ההליך. את assay QC מראש אנליטיים מקובע את מספר עותק amplifiable של עיכוב תפקודי DNA ודוחות. עם זאת, אם פחות מ -400 עותקי DNA amplifiable משמשים צעד עשרה PCR, קיים סיכון מוגבר שיחת false-negative ממדגמים עם מוטציות נמוך שפע (איור 6). בנוסף, יש להקפיד במהלך טיהור ספרייה כדי למנוע יתר ייבוש של החרוזים המגנטיים במהלך שלבי כביסה או elution. יתר על כן, כימות ספרייה מוצלחות תלויות מאוד על הדילול המדויק של ה- DNA ספרייה. לקבלת התוצאה הטובה ביותר, את ההבדל של qPCR תוצאות עבור הספריה מדגם (FAM CQ) לעומת התקן LQ (CQ VIC) צריך להיות ≤3.3 Cq. אם ההבדל הוא גדול מ 3.3 CQ, מחדש דילול בדיקת הדגימה מומלץ. למרות קורלציה מצוינת נצפתה בין שיטת qPCR התחרותית זה וערכות מסחריות המציעות כימות מוחלטות באמצעות עקומת סטנדרט, בקיזוז קלט הספרייה לתוך ביחס צעד הגברה המשובטים לשיטות אחרות עשוי להיות נחוץ כדי להשיג צפיפות זריעה אופטימלית. כמה דגימות סרטן במיוחד הם מאתגרים שממפה בגלל מעכבים כי נמשכים לאחר בידוד DNA. כדי לזהות דגימות אלה לפני הכנת ספרייה, assay QC qPCR גם מזהה עיכוב הגברה ידי הכללת תבנית אקסוגניים המשמשת הוא בקרה פנימית לבין זקיף עבור עיכוב תפקודי. דוגמה מוצגת באיור 3 שבו דגימת DNA מלנומה לא עברה את עיכוב QC מטרי לפני רצף ולאחר מכן הצליחו ליצור ספריה שיכול להיות רצף. הכישלון היה צפוי תוצאה של זיהום מלנין, מעכב PCR ידוע, נשא משלב בידוד DNA FFPE. דוגמאות המזוהות על ידי assay QC להיות בסיכון לכישלון הגברה ניתן להציל באמצעות t צעד לנקות נוסףo להסיר מעכבים פוטנציאליים. פנל 21-הגן הממוקד מתמקד בנקודות חמות גן מבוסס ראיות מספק מערכת שלמה עם ריאגנטים ובקרות אופטימיזציה עבור DNA QC, תוכנת NGS וביואינפורמטיקה כי הוא הודיע ​​על ידי מראש אנליטיים תוצאות כימות DNA &quot;פונקציונליות&quot;. השיטה במדויק מזהה מוטציות בסיס-החלפת indels מ- DNA נמוך קלט, ומספקת דוגמא מערכת NGS עם האפשרות להרחיב את תכני פנל, כדי לזהות גרסות נוספות כגון CNVs ולהיות מותאמים רצף RNA ממוקד.

רפואת Precision מסתמכת על אינדיבידואליזציה של אפשרויות אבחון וטיפול בחולים. ההבטחה של טיפולים מותאמים היא תוצאה ישירה של הבנה משופרת של מסלולי מחלה שיכולה ליידע את ההצמדה של אבחון מולקולרי חקר טיפולים. לדוגמא, שימוש טיפולים מולקולריים במיקוד עלה מ -11% ל -46% מ 2003 עד 2013 1, ותרופות נגד סרטן כגון vemurafenib ו crizotinib הם פינו FDA עם בדיקות אבחון לוויה. עם יכולתה במדויק לשחזר מטרות רצף נמוך שפע פני קבוצות מדגם מרובבות מאוד, רצף של הדור הבא (NGS) התפתח שיטת הבחירה להערכת סטיות גנטיות הקשורות בסרטן וזיהוי מטרות מולקולריות לרפואת דיוק. ביופסיות הגידולים המוצקות השכיחות ביותר לבדיקה מולקולרית כוללות פורמלין-קבוע, פרפין מוטבע (FFPE) ושאיפה בסדר מחט (FNA) SPECIMens. דגימות אלה טומנת בחובה-כמות נמוכה ו / או חומצות גרעין באיכות נמוכה המאתגרות NGS מדויק שומות 2-5. NGS שיטות המסחרי נוכחיות לניתוח הדגימות אלה מבוססות על טלאים של חומרים כימיים שונים, פרוטוקולים, וכלי אינפורמטיקה המייצגים מטרות נעות של שיפורים מתמשכים. לדוגמא, שינויים כימיים assay ו / או תוכנה התרחשו כל 1-2 חודשים עבור ערכות NGS הנפוצה בשימוש הממוקד ביותר 6. חוסר יציבות זו משקפת חוסר קוהרנטיות בבניית ואימות מערכת NGS מאוחדת לסוגי דגימה מאתגרים, במיוחד עבור בדיקות סרטן, ומניח ניטל מיותר על מעבדות לפתח פרוטוקולים מלוכדים שאינם מותאמים ממדגם ל-תוצאות. ואכן, בסקר שנערך לאחרונה של משתמשי NGS הדגיש את הקשיים של אלה &quot;המשתנים במהירות&quot; טכנולוגיות, יחד עם הדרישות שנקבע, תוכן רפואי בת תביעה, מומחיות ביואינפורמטיקה מושרשת, solidifiאד הליך משולב שניתן ליישם במהירות, זרימות עבודה יעילה ופרוטוקולים פשוטים המאפשרים ההכשרה תוך כדי עבודת 7. במאמר זה, מערכת כוללת NGS ממוקד מתוארת כי כתובות פערים אלה. המתודולוגיה הציג משלב את כל הצעדים פרוצדורליים לקוחות pre-אנליטי פוסט-אנליטיות הוא ספסלים רטובים ויבשים כדי לשפר את הדיוק, רגישות, והאמינות של כימות יעד וזיהוי עבור NGS של לוקוסי גן קליני רלוונטיים הסרטן. גישה זו מתחילה עם הכימות של &quot;הפונקציונלי&quot; DNA 4 להעריך איכות DNA, להדריך קלט לתוך צעד עשרה PCR, וגם להישמר מפני שיחות חיוביות שגויות שיכול להתעורר מהחקירה של עותקי תבנית נמוכים מאוד. זמנית חד צינור PCR אז מעשירה עבור 46 לוקוסים ב 21 גנים סרטניים באמצעות רק 400 עותקים DNA amplifiable, ואחריו ההתאגדות של רצפים ספציפיים פלטפורמה usin NGSמכשירי רצף משותף שולחן עבודה גרם. ספריות הם מטוהרים באמצעות הליך חרוז מגנטי פשוט לכמת עם assay qPCR רומן, כיול חינם. סוויטה ביואינפורמטיקה עצמאית, הודיעה על ידי תוצאות QC DNA במדגם כדי לשפר את ביצועי קריאה, מספקת ניתוח הרצף הבא NGS. אנו מציגים נתונים באמצעות גישת מערכות זה ממוקד NGS לחשוף מוטציות בסיס החלפה, כניסה / מחיקות (indels), ולהעתיק מספר הגירסות (CNVs) בביופסיה נמוכה באיכות נמוכה כמות גידול כגון FFPE ודוגמאות FNA, וברחו שולט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="493">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">2x Quantidex Master Mix</td>
			<td style="width:79px;">Asuragen</td>
			<td style="width:112px;">145345</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant Primer Probe Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inhibition Primer Probe Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROX</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diluent</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Standard (50)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Standard (10)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Standard (2)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Standard (0.4)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Amplification Master Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pan Cancer Primer Panel</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pan Cancer FFPE Control</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pan Cancer Multi-Variant Control</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Library Pure Prep Beads</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wash Buffer</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Elution Buffer</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X LQ Master Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LQ Diluent</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LQ Positive Control</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LQ Standard</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LQ Primer / Probe Mix (ILMN)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LQ ROX</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48)</td>
			<td rowspan="2">Asuragen</td>
			<td rowspan="2">150004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">AIL001 - AIL048 (48)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48)</td>
			<td rowspan="2">Asuragen</td>
			<td rowspan="2">150005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">AIL049 - AIL096(48)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Index Master Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Read 1 Sequencing Primers</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>150001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Index Read Sequencing Primers</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>150002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Read 2 Sequencing Primers</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>150003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sequencing Diluent</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Illumina MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-103-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PhiX Control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic Stand-96 (Or equivalent device)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM10027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quantidex Reporter Software</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integration of wet and dry bench processes optimizes targeted next-generation sequencing of low-quality and low-quantity tumor biopsies

כל רצף של הדור הבא (NGS) הנהלים כוללים מבחנים בצעו ליד שולחן המעבדה ( &quot;ספסל רטוב&quot;) ונתונים ניתוחיים שנעשה בעזרת צינורות ביואינפורמטיקה ( &quot;ספסל יבש&quot;). שני האלמנטים החיוניים כדי להפיק תוצאות מדויקות ואמינות, אשר הן קריטיות במיוחד למעבדות קליניות. טכנולוגיות ממוקדות NGS מצאו לטובה ויותר ביישומי אונקולוגיה שיאפשר לך לעמוד ביעדי רפואת דיוק מראש, עדיין השיטות לעתים קרובות כרוכות מנותק ומשתנים זרימות עבודת ספסל רטובות ויבשות וערכות מגיבות לא מתואמות. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים שיטה רצף מאתגר דגימות סרטן עם פאנל 21-גן כדוגמה של מערכת NGS ממוקד מקיף. המערכת משלבת כימות DNA פונקציונלית הסמכה, העשרה חד צינור מרובב PCR, וטיהור ספרייה ונורמליזציה באמצעות מאומת אנליטית, חומרים נגד מקור יחיד עם חבילה ביואינפורמטיקה עצמאית.כתוצאה מכך, חלופה מדויקת שיחות באיכות נמוכה פורמלין-קבוע נמוכה כמות, פרפין מוטבע (FFPE) ושאיפה-מחט דקה (FNA) ביופסיות גידול יכולות להיות מושגת. השיטה יכולה שגרתי להעריך גרסאות סרטן הקשורים מתוך קלט של 400 עותקים DNA amplifiable, והוא מודולרי בעיצוב כדי להכיל תוכן גן חדש. שני סוגים שונים של בקרות אנליטית מוגדרות לספק אבטחת איכות לסייע בהגנת שיחת דיוק עם דגימות קליניות רלוונטיות. צעד PCR גמיש &quot;תג&quot; מטביע מתאמים וקודי מדד ספציפי פלטפורמה כדי לאפשר barcoding מדגם ותאימות עם מכשירי NGS המעבדתיים משותפים. חשוב לציין, הפרוטוקול הוא יעילים יכול לייצר 24 ספריות רצף מוכן ביום אחד. לבסוף, הגישה מקשרת תהליכי ספסל רטובים ויבשים על ידי שילוב תוצאות בקרת איכות מדגם מראש אנליטיים ישירות לתוך הגרסה קורא אלגוריתמים כדי לשפר את דיוק זיהוי מוטציה ולבדל שווא שלילי indetermשיחות inate. שיטת NGS ממוקד זה משתמשת להתקדמויות wetware ותוכנה להשיג מעמיק גבוה, רצף מרובב וניתוח רגישות של דגימות סרטן הטרוגנית עבור יישומים אבחוניים.

סך של 90 דגימות (74 ייחודיים) המייצג בקרות חיוביות ושליליות, שורות תאים שאפיינו בעבר, וביופסיות גידול FFPE קליניות שיורית הוערך עבור DNA amplifiable, קלטת לתוך העשרה זמנית PCR, מתויג עם מתאמי רצף, המינימרקטים, ונתח יחיד מכשיר המעבדתיים NGS לרוץ (איור 2) שהניב 19.1 M קורא עובר סינון. איגום מדגם equimolar הביא רצף עומק גבוה (3,692x כניסות) וכיסוי אחיד (97.8% של amplicons מכוסה בתוך פי 5 של העומק לקריאה החציוני). חריגים מורכבים ללא תבנית שולטת, DNA אונליין תא אחד עם הגברת מספר עותק גדולה, ו- DNA אחד FFPE כי סומן בשל עיכוב PCR ידי assay QC מראש אנליטי (איור 3). אחידות כיסוי פני 46 amplicons נשמרה באמצעות שלושה מפעילים שונים (איור 4 א), וכן עבור דגימות DNA FFPE באיכות נמוכה שונות ( <stרונג&gt; איור 4B). פקד ה- DNA הגידול FFPE, ניסח מתערובת של דגימות קליניות שיורית להשיג V600E BRAF 5% (לכמת ידי אגל דיגיטלי PCR), דווח כי המוטציה BRAF היעד ב שכיחותם של 3.9, 5.3, ו -6.5% על ידי שלושה מפעילים באמצעות הזנה של 400 עותקים amplifiable (ובכך 20 רק עותקים מוטציה) (איור 4 ב ו &quot;FFPE3&quot; של השולחן הבלעה). יתר על כן, תערובת של 12 תבניות סינטטיות DNA, שכל אחד מהם מייצגת מוטציה &quot;נהג&quot; ידועת בסיס החלפה, חשפה את המוטציות הצפויות בטווח המיועד של 9 - 17% תדירות אלל ממוצע (טבלה 2). דילול של שורת תאי דגימות FFPE DNA עם רחבות מספר עותק הפגין במינון תלות עבור משתני EGFR ו KRAS, בהתאמה (איור 5). חשוב לציין, קלט DNA FFPE יצומצמו כמה כמו 50 עותקים amplifiable או 1.2 ng של DNA בתפזורת תוך שמירה על זיהוי של מוטציות ידועות ללא חיוביות שגויותשיחות (איור 6). תשומות DNA שוכנו על פני טווח של פי 100 עד לפחות 50,000 עותקים amplifiable (לוח 3). בניסויים זה וצדדים קשורים, וריאנט שיחות 22 FFPE ו -20 דגימות FNA דווחו הסכם עם שיטות עצמאיות עם כיסוי מוטציה משותף (לוח 4). הרגישות וערך מנבא חיובי עבור assay נקבע מניתוח 97 דגימות, כולל FFPE, FNA, טרי קפוא, ותא אונליין DNA, וכן סך של 195 תוצאות רצף. התוצאות הראו 365 שיחות גרסה חיוביות אמיתיות, 4 שיחות שליליות כוזבות, ו 1 שיחה חיובית כוזבת עם רגישות של 98.9% (95% CI: 97.1-99.7%) ו ערך מנבא חיובי (PPV) של 99.7% (95% CI : 98.2-99.99%). ניתוח של indels בוצעו שתי גרסאות EGFR משותף (p.E746_A750delELREA ו p.V769_D770insASV) ב 33 מדגם-ריצות, מפגין רגישות 93.9% (95% CI: 78.4-98.9%) וכן PPV של 100% (95% CI: 86.3-100%) עם גרסאות זוהה על פני טווח של 2.4-84.8%. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig1.jpg" /> איור 1: דוגמה Curves DNA כימות כיול שעוברים Fail QC קריטריונים (א) עקומת סטנדרט חולף.. (ב) עקום סטנדרט כושל. במקרה זה, הכישלון נגרם על ידי pipetting הכפול של תקן ה- DNA הקלט הנמוך ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig2.jpg" /> איור 2: מבט כולל של מערכת מקיפה ממוקד NGS עבור יישומים אונקולוגיה המשלב טרום אנליטיתאל, אנליטית, ופוסט-אנליטי זרימות עבודה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig3.jpg" /> איור 3: סיקור קראו ואחידות עבור NGS הממוקדת של גנים סרטניים בדנ&quot;א FFPE באיכות נמוכה בהשוואה ל- DNA ובקרות הסלולרית אונליין Intact סך של 90 דגימות שכלל FFPE הקליני שיורית (בחוגים סגורים), תא אונליין (עיגולים פתוחים. ), ו- DNA תבנית סינתטי (בתוספת סימנים) עובדו באמצעות יחיד צינור, 21-גן זמנית PCR העשרה. כל ספריית amplicon תויגה עם רצפי מתאם עבור מכשיר NGS, המינימרקטים עם קוד כפול מדד מובהק, מטוהרים, לכמת, מנורמל לריכוז של 2.5 ננומטר. ספריית DNA הייתה רצף ונותחה על ידי התוכנה ביואינפורמטיקה הלוויה. דווי לדוגמאations כלל סדרת דילול של DNA מד&quot;א- MB-468 התאים אונליין ועליו הגברת מספר עותק EGFR גדול (למעלה, מלבנים פתוחים בתוך המעגל המקווקו) שעיוותו אחידות כיסוי מדגם FFPE אחד מלנומה כי הצליחו ליצור מספר ניכר של קורא בשל כדי שריד של מעכבי ה- PCR מתוך מיצוי DNA. הכישלון מדגם מלנומה (למטה, מנוקד מעגל) נחזה על ידי assay DNA QC qPCR מראש אנליטי. NTC, ללא תבנית מלאה (סימני x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig4.jpg" /> איור 4: Amplicon-ידי-amplicon קראו כיסוי, אחידות וזיהוי Variant בדנ&quot;א גידול הקליני FFPE שיורית. (א) קראו כיסוי בכל הלוקוסים המועשרים דגימת DNA FFPE נציג נמדדועל פני שלושה מפעילים שונים. מפעיל 1, OP1 (סורגים כחולים); מפעיל 2, Op2 (פסים ירוקים); מפעיל 3, Op3 (פסים שחורים). (ב) סיקור אחיד ושיחות גרסה הוערכו באמצעות שלוש דגימות גידולי FFPE, כולל תערובת מלאה (FFPE3, פסים אפורים וטקסט) המורכבים c.1799T BRAF 5% ידועים&gt; מוטציה. FFPE1 (מוטות וטקסט כחולים), FFPE2 (ברי טקסט כתומים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig5.jpg" /> איור 5:. איתור התלוי במינון של וריאנטים המספר העתיקו את שורת תאי FFPE DNA מד&quot;א- MB-468 התאים אונליין DNA עם הגברת מספר עותק EGFR היטב מאופיינת דולל בהדרגת רקע של תאים הלא-מוטצית הפניה DNA -line כדי להמחיש את הירידה שינוי מספר עותק בתורפונקציה של דילול. האחוז של כל דגימת DNA התא אונליין מוצג עם קו ברור (0, 12.5, 25, 50, ו 100%). דילול של מדגם גידול FFPE שחלות עם הגברת KRAS ידועה גילה פרופיל דומה באמצעות אותה הסדרה טיטרציה אבל עם משכפל הדנ&quot;א 100% FFPE עבור שני הקווים העליונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig6.jpg" /> איור 6: מדויק מוטציה איתור וכימות 50 עותקים Amplifiable FFPE DNA, או 1.2 ng DNA גורפת מספר עותק amplifiable של סרטן המעי הגס FFPE DNA נקבע על ידי assay QC מבוססי qPCR, ומדולל מן 400 עד 25 עותקים בתור. לפני רצף קלט לתוך העשרה זמנית PCR. הצינור ביואינפורמטיקה כראוי בשם שתיהן וריאן הידועTS עד 50 עותקים, או שווה הערך של ~ 10 תבניות מוטציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם חומר / חומר </td><td> חֶברָה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> מערבבים 2x Quantidex מאסטר </td><td> Asuragen </td><td> 145,345 </td></tr><tr><td> קוואנט פריימר Probe Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145,336 </td></tr><tr><td> עיכוב פריימר Probe Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145,344 </td></tr><tr><td> רוקס </td><td> Asuragen </td><td> 145,346 </td></tr><tr><td> diluent </td><td> Asuragen </td><td> 145,339 </td></tr><tr><td> תקן ה- DNA (50) </td><td> Asuragen </td><td> 145,340 </td></tr><tr><td> תקן ה- DNA (10) </td><td> Asuragen </td><td> 145,341</td></tr><tr><td> DNA תקן (2) </td><td> Asuragen </td><td> 145,342 </td></tr><tr><td> תקן ה- DNA (0.4) </td><td> Asuragen </td><td> 145,343 </td></tr><tr><td> מיקס מאסטר הגברת 2x </td><td> Asuragen </td><td> 145,348 </td></tr><tr><td> לוח פאן פריימר הסרטן </td><td> Asuragen </td><td> 145,347 </td></tr><tr><td> בקרה פאן סרטן FFPE </td><td> Asuragen </td><td> 145,349 </td></tr><tr><td> בקרה רב-Variant סרטן פאן </td><td> Asuragen </td><td> 145,350 </td></tr><tr><td> חרוזי הכנה טהורים ספרייה </td><td> Asuragen </td><td> 145,351 </td></tr><tr><td> מאגר Wash </td><td> Asuragen </td><td> 145,352 </td></tr><tr><td> הצפת elution </td><td> Asuragen </td><td> 145,353 </td></tr><tr><td> מערבבים 2x LQ מאסטר </td><td> Asuragen </td><td> 145,358 </td></tr><tr><td> LQ הממס </td><td> Asuragen </td><td> 145,354 </td></tr><tr><td> LQ חיובילִשְׁלוֹט </td><td> Asuragen </td><td> 145,355 </td></tr><tr><td> תקן LQ </td><td> Asuragen </td><td> 145,356 </td></tr><tr><td> LQ פריימר / Probe Mix (ILMN) </td><td> Asuragen </td><td> 145,357 </td></tr><tr><td> LQ רוקס </td><td> Asuragen </td><td> 145,359 </td></tr><tr><td> קודי אינדקס (ILMN) - קבוצה א &#39; </td><td rowspan="2"> Asuragen </td><td rowspan="2"> 150,004 </td></tr><tr><td> AIL001 - AIL048 (48) </td></tr><tr><td> קודי אינדקס (ILMN) - קבוצה ב &#39; </td><td rowspan="2"> Asuragen </td><td rowspan="2"> 150,005 </td></tr><tr><td> AIL049 - AIL096 (48) </td></tr><tr><td> מערבבים 2x אינדקס מאסטר </td><td> Asuragen </td><td> 145,361 </td></tr><tr><td> קרא 1 Primers רצף </td><td> Asuragen </td><td> 150,001 </td></tr><tr><td> Primers רצף קרא אינדקס </td><td> Asuragen </td><td> 150,002 </td></tr><tr><td> קרא 2 Primers רצף </td><td> Asuragen </td><td> 150,003 </td&gt; </tr><tr><td> רצף ממס </td><td> Asuragen </td><td> 145,365 </td></tr><tr><td> Illumina MiSeq </td><td> Illumina </td><td></td></tr><tr><td> v3 קיט מגיב MiSeq (600-מחזור) </td><td> Illumina </td><td> MS-102-3003 </td></tr><tr><td> v2 ערכת ננו מגיב MiSeq (300-מחזור) </td><td> Illumina </td><td> MS-103-1001 </td></tr><tr><td> PhiX בקרה v3 </td><td> Illumina </td><td> FC-110-3001 </td></tr><tr><td> Stand-96 המגנטי (או מכשיר מקביל) </td><td> Ambion </td><td> AM10027 </td></tr><tr><td> תוכנת Reporter Quantidex </td><td> Asuragen </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1:. ריאגנטים ערכות עם השימוש הראשון של רוקס, לאחסן את הבקבוקון ב 2-8 מעלות צלזיוס. אל תקפיאו. התוכנה ניתן להוריד בכתובת www.asuragen.com. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Gפנטן </td><td> גרסת COSMIC </td><td> חומצת אמינו COSMIC </td><td> Variant% </td></tr><tr><td> NRAS </td><td> c.182A&gt; G </td><td> p.Q61R </td><td> 13.3 </td></tr><tr><td> NRAS </td><td> c.35G&gt; </td><td> p.G12D </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> HRAS </td><td> c.182A&gt; G </td><td> p.Q61R </td><td> 17.8 </td></tr><tr><td> HRAS </td><td> c.35G&gt; </td><td> p.G12D </td><td> 9.2 </td></tr><tr><td> KRAS </td><td> c.182A&gt; G </td><td> p.Q61R </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td> KRAS </td><td> c.35G&gt; </td><td> p.G12D </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> PIK3CA </td><td> c.1633G&gt; </td><td> p.E545K </td><td> 9.3 </td></tr><tr><td> PIK3CA </td><td> c.3140A&gt; G </td><td> p.H1047R </td><td> 9.1 </td></tr><tr><td> קִיט </td><td> c.2447A&gt; T </td><td> p.D816V </td><td> 14.6 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> EGFR </td><td> c.2369C&gt; T </td><td> p.T790M </td><td> 11.3 </td></tr><tr><td> EGFR </td><td> c.2573T&gt; G </td><td> p.L858R </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; </td><td> p.V600E </td><td> 17.3 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: פקד סינטטי משולב מורכב 12 &quot;נהג&quot; וריאנטים גנטיים לסרטן כי הם לכמת ב 9-17% שפע תערובת של 12 תבניות סינטטיות שונות פעמים תקועות נושאת 12 מוטציות נפרדות הוערכה הבאה רצף.. כל הגרסאות נקראו באופן תקין וללא תוצאות חיוביות שגויות. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מזהה לדוגמא </td><td nowrap="nowrap"> פוּנקצִיוֹנָלִי CPS </td><td> גֵן </td><td> גרסת COSMIC </td><td> חומצת אמינו COSMIC </td><td&gt; Variant% </td><td> עומק לקריאת חציון </td><td> % בתוך 5x של חציון </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 400 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; </td><td> p.V600E </td><td> 99.5 </td><td> 3289 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 10,000 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; </td><td> p.V600E </td><td> 99.7 </td><td> 4040 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 25,000 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; </td><td> p.V600E </td><td> 99.4 </td><td> 3687 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 50,000 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; </td><td> p.V600E </td><td> 99.7 </td><td> 4611 </td><td> 93% </td></tr></tbody></table> טבלה 3: סיקור Calling Variant נשמרים במשך&gt; פי 100 טווח מחירי תשומה DNA. </sטרונג&gt; DNA Amplifiable משורת תאים BCPAP היה קלט לתוך העשרה זמנית PCR ב 400 50,000 עותקים להפיק ולרצף. עומק קרא, אחידות כיסוי, זיהוי המוטציה, ודיוק מוטציה השתמרו על פני טווח קלט. <img alt="טבלה 4" src="/files/ftp_upload/53836/53836table4.jpg" /> לוח 4: Variant שיחות ב -22 FFPE ו -20 FNA ביופסיות גידול מסכים עם תוצאות עצמאי מוטציה מבחני סט של 22 FFPE הגידול DNA עם מעמד מוטציה נקבע בעבר על ידי מבחני NGS ממוקד מאונך היה קלט ב 400 עד 2,928 עותקים amplifiable לתוך העשרה PCR. צעד להפיק ולרצף באמצעות לוח סרטן 21-גן פאן. בנוסף, קבוצה של 20 דגימות DNA FNA מאופיינת בעבר באמצעות assay מוטצית מערך חרוז נוזל 8 היו PCR מוגבר באמצעות 156 ל 36,080 עותקי קלט amplifiable להפיק ולרצף. כל השיחות החופפות בין פנל NGS סרטן פאן ואת refereNCE שיטות היו בהסכמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836table4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies at JoVE.com

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

integration-wet-dry-bench-processes-optimizes-targeted-next

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Views.  Asuragen, Inc.. An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures. 

Video: Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into a &#8216;recipient&#8217; block and then used for a variety of biomarker applications. The construction of conventional TMAs is labor intensive, imprecise, and time-consuming. Here, a protocol using next-generation Tissue Microarrays (ngTMA) is outlined. ngTMA is based on TMA planning and design, digital pathology, and automated tissue microarraying. The protocol is illustrated using an example of 134 metastatic colorectal cancer patients. Histological, statistical and logistical aspects are considered, such as the tissue type, specific histological regions, and cell types for inclusion in the TMA, the number of tissue spots, sample size, statistical analysis, and number of TMA copies. Histological slides for each patient are scanned and uploaded onto a web-based digital platform. There, they are viewed and annotated (marked) using a 0.6-2.0 mm diameter tool, multiple times using various colors to distinguish tissue areas. Donor blocks and 12 &#8216;recipient&#8217; blocks are loaded into the instrument. Digital slides are retrieved and matched to donor block images. Repeated arraying of annotated regions is automatically performed resulting in an ngTMA. In this example, six ngTMAs are planned containing six different tissue types/histological zones. Two copies of the ngTMAs are desired. Three to four slides for each patient are scanned; 3 scan runs are necessary and performed overnight. All slides are annotated; different colors are used to represent the different tissues/zones, namely tumor center, invasion front, tumor/stroma, lymph node metastases, liver metastases, and normal tissue. 17 annotations/case are made; time for annotation is 2-3 min/case. 12 ngTMAs are produced containing 4,556 spots. Arraying time is 15-20 hr. Due to its precision, flexibility and speed, ngTMA is a powerful tool to further improve the quality of TMAs used in clinical and translational research.

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

The protocol aims at optimizing the construction and quality of tissue microarrays for biomarker research. It includes aspects of planning and design, digital pathology, virtual slide annotation, and automated tissue arraying.

פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

רצף עמוק משוחד של RNA וירוסי ממדגמים קליניים

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations is essential, as resistance detected in vitro can often be correlated with clinical failure. We examined the feasibility of using whole genome sequencing (WGS) for genome-wide analysis of antifungal drug resistance in C. glabrata. The aim was torecognize enablers and barriers in the implementation WGS and measure its effectiveness. This paper outlines the key quality control checkpoints and essential components of WGS methodology to investigate genetic markers associated with reduced susceptibility to antifungal agents. It also estimates the accuracy of data analysis and turn-around-time of testing.
Phenotypic susceptibility of 12 clinical, and one ATCC strain of C. glabrata was determined through antifungal susceptibility testing. These included three isolate pairs, from three patients, that developed rise in drug minimum inhibitory concentrations. In two pairs, the second isolate of each pair developed resistance to echinocandins. The second isolate of the third pair developed resistance to 5-flucytosine. The remaining comprised of susceptible and azole resistant isolates. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes linked to echinocandin, azole and 5-flucytosine resistance were confirmed in resistant isolates through WGS using the next generation sequencing.&#160;Non-synonymous SNPs in antifungal resistance genes such as FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 and FCY2 were identified. Overall, an average of 98% of the WGS reads of C. glabrata isolates mapped to the reference genome with about 75-fold read depth coverage. The turnaround time and cost were comparable to Sanger sequencing.
In conclusion, WGS of C. glabrata was feasible in revealing clinically significant gene mutations involved in resistance to different antifungal drug classes without the need for multiple PCR/DNA sequencing reactions. This represents a positive step towards establishing WGS capability in the clinical laboratory for simultaneous detection of antifungal resistance conferring substitutions.

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

This study implemented whole genome sequencing for analysis of mutations in genes conferring antifungal drug resistance in Candida glabrata. C. glabrata isolates resistant to echinocandins, azoles and 5-flucytosine, were sequenced to illustrate the methodology. Susceptibility profiles of the isolates correlated with presence or absence of specific mutation patterns in genes.

הגנום כולו רצף של קנדידה glabrata עבור זיהוי של סמנים של פטריות תרופתיים

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

Manufacture of a Multi-Purpose Low-Cost Animal Bench-Model for Teaching Tracheostomy

Tracheostomy is one of the most frequent procedures, performed through various techniques in the intensive care unit and emergency situations. Despite this, there is a lack of training on this procedure that affects its outcome, which is also dependent on operator's dexterity. Here, we take the specific training and simulation into consideration. This article aims to describe every step of the manufacture of a new multi-purpose low-cost animal bench-model, with the support of video and images, and to obtain an opinion about the quality of this model by administering a questionnaire to professionals with experience in the procedures. 
Ten experts in the technique were enrolled. The model scored an average of 3.45/5 for its anatomical realism; 4.75/5 for its usefulness as a training tool for simulation courses and assessments. The time necessary to build the model was 15 minutes, and the cost amounted to 10&#8364;. The animal bench-model was considered a very useful simulator for tracheostomy training and assessments. Therefore, it could be used as a tool for medical courses and residencies.

This article illustrates every step of the manufacture of a new multi-purpose low-cost animal bench-model for subglottic airway access management. All the procedures are shown in the video. The model's realism and its suitability for training the given clinical maneuvers were assessed by independent senior otolaryngologists and anesthesiologists.

ייצור מדגם רב תכליתי של בעלי חיים בעלות נמוכה להוראה בקנה מאוזן

Tracheostomy is one of the most frequent procedures, performed through various techniques in the intensive care unit and emergency situations. Despite ...