פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

בידוד או העשרה של אזורים קטנים מפוזרים בעלי עניין מ- FFPE, או חומר קפוא טרי, ניתן להשיג עם דיסקציה אוטומטית במהירות וביעילות רבה יותר מאשר בשיטות מסורתיות. מיצוי של חומר גנומי מ-FFPE, או רקמות קפואות טריות, הוא דרישה למעבדות מחקר קליניות ותרגומיות רבות. דיסקציה אוטומטית ממלאת פער משמעותי בין כריתת מאקרו למיקרו דיסקציה של לכידת לייזר.

כדי להתחיל, הוסף את הערות השקופיות הסרוקות עבור אזורי הגידול המעניינים, באמצעות פלטפורמת צפייה המסופקת על ידי הספק, או צופה בקוד פתוח. מקם את שקופית רקמת הדגימה הלא מוכתמת על הבמה במיקום השקופית הראשונה עד הרביעית בעת שימוש בהפניה לשקופית דיגיטלית. צור משימת כרסום באמצעות תוכנת ניתוח הרקמות האוטומטית על-ידי פתיחת רשימת משימות, ולאחר מכן בחר צור עבודה חדשה והזן את מזהה המקרה ואת השם כדי להזין את שם המשרה.

עבור אל עובי ובחר עובי מקטע באמצעות הכרטיסיה חץ למעלה או למטה. לאחר מכן, עבור אל הכנת רקמות, ובחר Paraffinized, או Deparaffinized. בחר תמונת הפניה "מתוך הקובץ, ויבא תמונה.

לאחר מכן, בחר את הקובץ לייבוא מהתפריט הנפתח כהפניה הדיגיטלית. סרוק את השלב על-ידי בחירה בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי ללכוד כל שקופית רקמת דגימה במיקום הראשון עד הרביעי. עבור ההפניה על הבמה, גרור את התיבה כדי ליצור אזור מלבני מעל הרקמה, ובחר את הבועה העגולה מתחת לאזור המלבני כדי לצלם את תמונת הפניה לבמה.

העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך. עבור תמונת ההפניה הדיגיטלית, הוסיפו את שכבת-העל של התמונה באזור המלבני שנבחר.

לאחר מכן, שנה את גודל ההפניה הדיגיטלית ויישר אותה בצורה גסה, כמובן, זום, כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לגודל ולמיקום מעל רקמת הדגימה. העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך.

בחר בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי לעבור לשלב הכוונון העדין. בחר את מיקום השלב הראשון ואת סמל הכלי 'שינוי צורה' בסרגל הכלים הימני, כדי לבצע התאמות יישור וזום עדינות של ההפניה כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לכיסוי השקופית לדוגמה. השתמש בהפניה לפס הזזה לדוגמה בתחתית המסך, תוך מעבר בין ההפניה לתמונות לדוגמה.

בנוסף, תכונת ההגדלה וההגדלה כדי להתאים ולהשיג את היישור של כל מיקום שקופית. לאחר השגת שכבת-העל האופטימלית לדוגמה, צייר את הכינויים של נתיב הטחינה על החלק הצבעוני של תמונת הייחוס במסכה על-ידי בחירת סמל הכלי בורר הצבעים בסרגל הכלים הימני. צייר את נתיבי הטחינה לשקופיות לדוגמה על-ידי בחירה בלחצן קבל ביאורים בפינה השמאלית התחתונה של המסך.

ללכוד ולאסוף את אזור העניין המבואר עם ארבעה טיפים כרסומים או פחות כאשר מחושב נתיב הטחינה. השימוש בקצה הטחינה בפינה השמאלית העליונה מחושב על סמך השטח המכוסה, וגודל הקצה שנבחר. ניתן לשנות את גודל הקצה תחת חץ קצה הטחינה, והשימוש בקצה יחושב מחדש.

כאשר נתיב הטחינה נבחר במיקום השקופית הראשון, הוא יועתק למיקומי השקופיות הנותרים. בחר בלחצן "שלב ההתקנה" בפינה הימנית התחתונה של המסך לטעינה מהירה של קצות הטחינה מצינורות האיסוף בייעודם הנכון על הבמה. מלאו את המאגר בשלושה מיליליטרים של מאגר דיסקציה מתאים לסוג הרקמה, ולמיצוי חומצות גרעין במורד הזרם.

לאחר מכן, בחר בלחצן Dissect" בפינה השמאלית התחתונה של המסך. לאחר הנתיחה האוטומטית, הסר את צינורות האיסוף ואת שקופיות הדגימה המנותקות מהבמה. מקם את צינורות האיסוף במדף הצינורות, ואת המגלשות במדף השקופיות.

הפורמלין המוכתם של H&E, הפרפין הקבוע משובץ, ומקטעי כבד עכבר קפואים טריים המכילים סרטן מעי גס גרורתי ב-xenografts נסרקו על גבי מצלמת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20, ושימשו כשקופיות הייחוס. שקופיות הייחוס המוכתמות של H&E הוסתרו והוסוו באופן דיגיטלי לאזורי הגידול לצורך כריתה ומיצוי חומצות גרעין. שקופיות הדגימה שלאחר הניתוח הוכתמו ב-H&E כדי לאשר את אזורי הנתיחה בשקופיות של 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר.

מדדים שנתפסו הדגימו את ההצלחה של הנתיחה האוטומטית ומיצוי חומצות גרעין. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי השגת שכבת-על מדויקת יחסית של ביאור על השקופיות הלא מוכתמות חשובה לבידוד תחומי העניין.