Name: intra-tracheal administration of haemophilus influenzae in mouse models to study airway inflammation
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation at JoVE.com

We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) של מכון המחקר ביילור. 1. Culturing ללא typeable אינפלואנזה המופילוס (NTHi) ואת הכנת הבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט NTHi על צלחת אגר שוקולד ולשמור הצלחת הפוכה CO 2 באינקובטור humidified לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. למחרת, התרבות החיידקים במרק עירוי הלב והמוח. לאחר מכן, להוסיף 1 מ&quot;ל של מרק לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, לבטל את supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ&quot;ל של PBS 1x סטרילי. חזור על פעולה זו פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של פתרון מחדש מושעה לתוך 900 μl של 1x PBS ולמדוד את ספיגת התרבות המדוללת ב 600 ננומטר אורך גל ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכדאיות ואת המושבה היחידה להרכיבs (CFUs) של הבידוד על ידי culturing דילולים 1:10 סדרתי על צלחות אגר שוקולד דוגרים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על הכדאיות CFUs נקבע מהשלב הקודם, להתאים את הבידוד לריכוז סופי של 20 x 10 6 CFU / ml. </li></ol> 2. Intra-קנה הנשימה (זה) החדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את העכבר intraperitoneally (IP) עם 0.1 מ&quot;ל / 10 g משקל הגוף של עכבר עם פתרון 150 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין + 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​xylazine. ההליך צריך להיעשות בשכונה עם מקור אור כדי לשמור על חומו של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את החלל interdigital של העכבר על מנת לוודא כי העכבר הוא מורדם כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על גבו. לגלח את האזור הגחון של הצוואר ולחטא עם chlorhexidine ואלכוהול אתיל 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור של חלק הגחון העליון של הצוואר באמצעות מלקחיים שיניים חולדה. לעשות חתך קטן (0.5-1.0 ס&quot;מ) מעל התימוס באמצעות אזמללנתח את השריר בזהירות כדי לחשוף את קנה הנשימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט 27 G, להזריק לאט 0.05 מ&quot;ל אוויר, ואחריו 0.05 מ&quot;ל NTHi המתקבל בסעיף 1 או מלוחים כביקורת, ואחריו עוד אוויר 0.05 מ&quot;ל. שמור חיה אנכי כ 1 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת החתך עם דבק כירורגי. שמור את העכבר רוחבי שכיבה וחמה למשך כ -10 דקות. </li></ol> 3. אוסף BALF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על ידי hr 24 נקע בצוואר הרחם לאחר ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן של העכבר במספריים אנטומיים וחותכים האאורטה הגחון לדמם. לחשוף את החלק הגחוני של הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה לצנרר אותו עם קטטר 20 מד. להחדיר 0.8 מ&quot;ל של חיץ BALF (PBS 1x, 0.1% דקסטרוז, 10 הפרין U / ml) לאסוף את שטיפה ידי שאיפה עדינה. חזור על הליך זה שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של תאים ב 100 μl של השעיה BALF באמצעות hemocytoמטר בהגדלה 10X עם מכתים כחול Trypan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שקופיות עבור מכתים Giemsa שונה. μl Aliquot 100 של BALF לתוך הבארות המתאימות של cytospin ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות. לייבש את השקופיות עבור 10 דקות ו להכתים את התאים באמצעות צביעה גימזה מעודכנת על פי הפרוטוקולים של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש התאים הנותרים לניתוח שלאחר מכן, כגון התא מופעל בתפרחת מיון (FACS), מיקרוסקופיה confocal, ביטוי גנים ומערב כתם 11-13. </li></ol> 4. הכנת Histopathology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח histopathology, להדביק עכברים עם NTHi כמתואר בשלב 2.4. לאחר 24 שעות של זיהום, להקריב את בעלי החיים באמצעות פריקת צוואר רחם. גזור לפתוח את חלל בית החזה במספריים אנטומיים לחשוף את הריאות ואת קנה הנשימה כפי שהוזכר קודם לכן. לאחר מכן, הכנס את הקטטר 20 מד לתוך קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הריאות עם 2 פתרון agarose חם% מוכנים בפורמלין 4%. פעם הריאות מנופחות לחלוטין, במקום קרח על גבי הריאות כדי לחזק פתרון agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להסיר בזהירות את התקע החזה והכניס אותו בתמיסה 50 מ&quot;ל של פורמלין 4% ב 1x PBS עד שהוא יעובד עבור hematoxylin ו eosin (H &amp; E) סעיפים. </li></ol> 5. FACS מכתים תאים בתוך BALF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 1 x 10 5 תאים מן הנוזל BALF בצלחת כייל מיקרו 96-גם V-התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 300 μl של 1X PBS ו ספין קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התאים עם פתרון כתם תא 100 μl 1x PBS (1: 1,000 דילול) לשמור בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 300 μl של PBS 1x קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים ב 100 μl של חיץ לשטוף FACS [חיץ לשטוף (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, אזיד הנתרן 0.1%] המכיל 1: 100 Fc-בלוק בדילול במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה ב 4000 XG 3 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם עם 100 קוקטייל משטח מכתים μl (1: 100 דילול) במאגר לשטוף FACS למשך 30 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שלוש פעמים עם 300 μl של חיץ לשטוף FACS ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים ב 100 μl של paraformaldehyde 4% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים שטפו תאים עם 300 μl 1x PBS ב 400 XG 3 דקות ב 4 ° C מחדש להשעות ב 300 μl של חיץ לשטוף FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך פקדים מכתימים יחיד צבע באמצעות זרימת cytometry חרוזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של חרוזים לתוך צלחת מיקרוליטר V-התחתון 96-היטב ולשטוף עם 200 μl 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של נוגדן מכתים 100 μl 1x PBS וחרוזים לדגור על טמפ &#39;החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעמיים עם 300 μl 1x PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שולטת חד מוכתמים ותאים ידי cytometry זרימת 14. </li></ol> המגון 6. של רקמת הריאה כדי לבודד RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדבקה, לאסוף חתיכה קטנה של הריאות (20-40 מ&quot;ג) ולשמור אותו RNA ייצוב מגיב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את רקמות הריאה ב PBS 1x קר להיפטר של מגיב ייצוב RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת לתוך המאגר תמוגה המכיל צינור 1.5 מ&quot;ל צנטריפוגה (חיץ תמוגה 1 מ&quot;ל + 10 μl β-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצי הרקמה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מחודדים homogenize באמצעות עלי גלול מנוע אלחוטי עבור 20-40 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על lysate על קרח למשך 5 דקות ולהמשיך עם צעד 7.1. </li></ol> בידוד RNA 7. מן הריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב 18,000 XG במשך 3 דקות. הסר את supernatant ידי pipetting ובזהירות להעביר אותו צינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח של אתנול 70% על lysate. מערבבים מיד על ידי pipetting ולחכות 2-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עד 700 μl של lysate לעמודה ספין להציבבצינור אוסף 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 9,600 XG במשך 15 שניות וזורקים את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 μl לשטוף חיץ צנטריפוגות קפדני 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl DNase אני ישירות הממברנה טור ספין ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 חיץ לשטוף מחמירים μl לעמודה ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ ספין על 9,600 XG למשך 2 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור ספין צינור צנטריפוגות הקולקציה החדשה 2 מ&quot;ל ב 9,600 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 30-50 מים RNase ללא μl ישירות לעמודת ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG דקות 1. RNA החנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RNA-seq ניתוח 14. </li></ol>

<ol>
	<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+physiological+roles+of+inflammation.">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li><li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+asthma+and+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).</li><li>Sethi, S., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+the+pathogenesis+and+course+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lung+Immune+Response+to+Nontypeable+Haemophilus+influenzae+(Lung+Immunity+to+NTHi).">The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi).</a> J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).</li><li>Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+microbiology+and+cellularity+in+children+with+newly+diagnosed+non-CF+bronchiectasis.">Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis.</a> Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).</li><li>King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiologic+follow-up+study+in+adult+bronchiectasis.">Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis.</a> Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).</li><li>Shuto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NF-kappa+B+by+nontypeable+Hemophilus+influenzae+is+mediated+by+toll-like+receptor+2-TAK1-dependent+NIK-IKK+alpha+/beta-I+kappa+B+alpha+and+MKK3/6-p38+MAP+kinase+signaling+pathways+in+epithelial+cells.">Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).</li><li>Moghaddam, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+lysate+induces+aspects+of+the+chronic+obstructive+pulmonary+disease+phenotype.">Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).</li><li>Rajagopalan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+exposure+to+bacterial+superantigens+induces+airway+inflammation+in+HLA+class+II+transgenic+mice.">Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice.</a> Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).</li><li>Ganesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase/LPS-exposed+mice+exhibit+impaired+innate+immune+responses+to+bacterial+challenge:+role+of+scavenger+receptor+A.">Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A.</a> Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).</li><li>Hogner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-expressed+IFN-beta+contributes+to+apoptotic+alveolar+epithelial+cell+injury+in+severe+influenza+virus+pneumonia.">Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia.</a> PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).</li><li>Karisola, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+Natural+Killer+T+Cells+Play+a+Role+in+Chemotaxis,+Complement+Activation+and+Mucus+Production+in+a+Mouse+Model+of+Airway+Hyperreactivity+and+Inflammation.">Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation.</a> PloS one. 10, e0129446 (2015).</li><li>Theivanthiran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+ubiquitin+ligase+Itch+inhibits+p38alpha+signaling+and+skin+inflammation+through+the+ubiquitylation+of+Tab1.">The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1.</a> Sci Signal. 8, 22 (2015).</li><li>Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+role+of+the+ubiquitin+ligase+Itch+in+immune+regulation.">Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation.</a> Immunol Cell Biol. , (2015).</li><li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בזאת, אנו מתארים הליך ייחודי פולשנית לחסן הריאות של עכברים עם פתוגן ריאות חיידקית. אנו מראים כי הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את הפונקציה של גנים שונים באמצעות עכברים כי חסרים גנים של מסלולי איתות דלקתיים. הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את התגובות הדלקתיות לזיהומי ריאות...

דלקת היא מנגנון חיסון יסוד של הגנה מפני גורמים מזהמים. זה מקדם מיגור פתוגן ותיקון של רקמות אשר ניזוקו. זה גם מקל על שחזור למצב נורמלי בריא 1. עם זאת, דלקת dysregulated מובילה לעיתים קרובות מחלות דלקתיות כרוניות 2. דלקת דרכי הנשימה היא טריגר ראשוני למחלות ריאה שונים כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה פיברוזיס ריאתי 3. אינפלואנזה המופילוס הלא typeable (unencapsulated) (NTHi) קשורה למחלות ריאה דלקתיות העליון כרונית והתחתון 4,5. זהו המין השולט שבודד את דרכי הנשימה התחתונה של ילדים ומבוגרים עם 4,6,7 מחלת ריאות חסימתית כרונית. התגובה הדלקתית לאחר ההדבקה NTHi מתאפיין הגברת הביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת (כגון TNF ו- IL-1β), וזה מתווכת בmitogen y פרוטאין קינאז מופעל (MAPK) גורם-κB גרעיני (NF-κB) באמצעות קולטנים דמוי האגרה (TLRs) 8. מודלי Mouse הם כלים שימושיים מאוד לניתוח הפתולוגיה הבסיסית של מחלה דלקתית ריאות בגלל הזמינות של קווי גן מחסר שונים. כמה שיטות שימשו לחסן חיידקים חיים / נחלש ומוצרים חיידקים, כולל החדרה אפי ו 9,10 משאיפת תרסיס. הנה, אנחנו מדגימים החדרת תוך-קנה נשימה. למרות בשימוש לעתים רחוקות, גישה זו היא יותר יעילה מאוד לשחזור בגלל המשלוח הישיר של הבידוד אל דרך הנשימה התחתונה.

<table><tbody><tr><td>Chocolate agar plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Deft quick solution</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needle 20/26G&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>(REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml syringe</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Catheter 20GA</td><td>BD</td><td>REF 381433</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, straight, 10 cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps, serrated, 10cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600095</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml polystyrene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&amp;nbsp; kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestile motor (Tissue homoginizer)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 well microtiter plates V bottom</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Working dilution 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Working dilution 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubes polystyrene round bottom tube</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-tracheal administration of haemophilus influenzae in mouse models to study airway inflammation

כאן אנו מתארים הליך מפורט ביעילות ישירות לספק אינפלואנזה המופילוס לתוך שטחי הנשימה התחתונות של עכברים. אנו מדגימים את הליך הכנת H. בידוד אינפלואנזה, החדרת תוך-קנה נשימה של H. אינפלואנזה לתוך הריאות, אוסף של נוזל שטיפת broncho-מכתשים (BALF), ניתוח של תאים חיסוניים BALF, ובידוד RNA עבור ניתוח ביטוי גני הפרש. הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את תגובת הריאות דלקתית לכל חיידקים, וירוסים או פטריות. החדרה קנה נשימה ישירה היא המועדפת בעיקר על נהלי משאיפת אפים או תרסיס כי זה יותר יעיל מספק את בידוד החיידקים לתוך דרך הנשימה התחתונה עם עמימות פחות.

החדרת Intra-קנה נשימה הביאה מספר גדל במידה ניכרת של לויקוציטים ב BALF (איור 1 א &#39;, פנל משמאל) מ התקנה עם מי מלח. ניתוח ספירת ההפרש של לויקוציטים הראה חדיר נויטרופילים עלו בבירור (איור 1, פנל מימין). הניתוח FACS של התאים BALF עוד חיזק את מספר גד?...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation at JoVE.com

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

10.1K Views.  Baylor Research Institute. We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models. 

Video: Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

פולשנית Intratracheal אינטובציה ללמוד פתולוגיה והפיזיולוגיה של עכבר ריאות

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Medicine

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

מנהל Intra-קנה נשימה של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video