We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research &amp; Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

<ol>
	<li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+assembly+of+basement+membranes.">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li><li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks.">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li><li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes.">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li><li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+the+structure,+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane.">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li><li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-induced+morphological,+biomechanical,+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes.">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18.">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li><li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line:+BPH-1.">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li><li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+(PC-3).">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival.">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li><li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models.">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li><li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations.">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li><li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK.">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li><li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces.">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis.">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly.">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147.">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic.">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li><li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer.">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li><li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression.">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology.">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li><li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benign+prostatic+hyperplasia:+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions.">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול עבור הדור של acini הבלוטות 3D מ MECs ג&#39;ל טהור RBM 6 שונתה במחקר קודם על ידי תוספת של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל סוג אני קולגן מטריקס RBM. התוספת של קולגן הביאה מודולוס האלסטיות של הג&#39;ל RBM גובר מצד 175 ± 37 כדי 1589 ± 380 פסקל. 9.1 פי גידול זה נוקש מווסת את הצמיחה, הישרדות, ההגירה והבחנה של MECs 21. פרוטוקול שונה שוב על ידי לרבות הורה חורג טיפול עם D - (-) - ריבוז לקדם crosslinking אנזימטית של קולגן מסוג I כי נוספו הג&#39;ל RBM. הגידול 15 פי כתוצאה נוקשות נמצא לשתף פעולה עם השינוי בשעור של MECs לקדם התנהגות פולשנית שלהם 22. הגישה ניסיון מהסוג מוסיף לי קולגן כדי ג&#39;ל RBM מקלה על האינטראקציה הישירה של MECs עם סיבי קולגן, אשר מתרחש רק ברקמות אנושיות לאחר המכשול הפיזי בין stromaאפיתל שמספקת BM עוברת שפלה פרוטאוליטים. על ידי יצירת acini הבלוטות 3D מ פץ ג&#39;ל RBM טהור טרום שטופלו GLA, הפרוטוקול הנוכחי פותח את הדרך ללמוד כיצד קשיחות בע&quot;מ כשלעצמו יכול לעורר התנהגות פולשנית שלהם (איור 3). רמות קשיחות בע&quot;מ המושרה בפרוטוקול זה יש רלוונטי פיסיולוגי. דגירה עם 50 מ&quot;מ GLA עבור 6 שעות ו -14 שעות בהתאמה הגדילה את moduli אלסטי של הג&#39;ל RBM טהור 175 ± 90 ו 322 ± 160 לעומת 122 ± 55 פסקל ג&#39;ל RBM שטופלו PBS (טבלה 1). 1.7 ל 3.2 לקפל זו העלייה נוקשה RBM משכפלת את גידול 2.5- ל -3.4 פי נוקשות שנצפו ממאיר לעומת ערמונית נורמלית או BPH רקמות 23-26. כפי שצוין בפרסום אחרון 13 השינויים המורפולוגיים מושרה על ידי ההצטברות של AGE וקשיחות RBM ב acini PEC ניתן לכמת עבור שינוי משמעותי סטטיסטית מן arounded לצורתו מצולעים, ירד לומינל / אזור acinar הכולל, ותאי בולטות נודדות מן acina לעידן עשירי RBM (איור 3). Immunoblotting יכול לשמש גם כדי להעריך סמנים של EMT (הפסד למשל של E-cadherin 13) ואת התנהגות התכווצות (שרשרת-2 אור שרירן פוספורילציה למשל, pMLC2 13) ב פץ הגדלים רגילה לעומת RBM נוקשה (איור 3). הערכה נוספת באמצעות מכתים immunofluorescent ו מיקרוסקופיה confocal ניתן ליישם כדי להמחיש את BM (למשל laminin, קולגן IV וגיל הצטברות 13), קוטביות הפסגה אל הבסיס הסלולרית (למשל לוקליזציה הפסגה של EEA1: אנטיגן endosomal מוקדם 1; ו GM130: 130 ציס-Golgi kDa סמן 13) ודפוסי הסלולר של מולקולות הדבקה (לוקליזציה E-cadherin למשל לצמתים תאים תאים 13) (איור 3). <img aLT = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54,230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3:. סקירה של הפרוטוקולים השונים שהוצגו כאן התרשים מתאר כיצד להכין להקשיח את הקרום במרתף מחדש (RBM) עם glycolaldehyde (תגובת מייארד), איך זרע תאים אל RBM הנוקשה, כיצד לנתח את RBM הנוקשה ( היקף תגובת Maillard) ונהלים, שניתן להשתמש בם כדי לנתח את השינויים התאיים ומולקולריים המושרים על ידי RBM AGE-עשיר. גיל, endproducts גליקציה המתקדם; BM, קרום במרתף; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole; EEA1, אנטיגן endosomal מוקדם 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GLA, glycolaldehyde; GEE, אתיל אסתר גליצין; GM130, 130 kDa סמן ציס-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), שרירן שרשרת-2 אור פוספורילציה באתרים תראונין 18 סרין 19; RBM, קרום במרתף מחדש; SDS-PAGE, ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן. לקבלת RWPE1 acini בר סולם = 10 מיקרומטר; עבור תאים סרטניים PC3סולם spheroids בר = 100 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> שלבים לפתרון הבעיה יהיה צורך אם D - (-) - ריבוז נבחר כסוכן crosslinking עבור RBM. במהלך פיתוח פרוטוקול נמצא כי טיפול עם 1 M D - (-) - ריבוז במשך 72 שעות, כפי שתואר לעיל עבור ג&#39;לים RBM / קולגן 22, מביא את התייבשות ההצטמקות של ג&#39;לים RBM. ההערכה של ריכוזים נמוכים של D - (-) - ריבוז ושעות טיפול קצרות עשויה לעזור להתגבר על מגבלה זו. מגבלה פוטנציאלית יישומים עתידיים של הפרוטוקול יכולה להיות נתקלה בם רמות גבוהות של נוקשות RBM הן רצויות. אם פעמי דגירה ארוכות ריכוזים גבוהים יותר של GLA משמשים כדי לגרום לרמות גבוהות של נוקשות ג&#39;ל RBM זה יהיה צורך<html> להעריך אם יש תנאי טיפול אלה השפעה על הישרדות ובחלוקה של תאים, כפי שתואר לעיל 13. כמו כן יש לציין כי הדגירה של תאים RWPE-1 עם סרום גורם מעבר EMT דמוי פנוטיפי וחשיפה בסרום או חומרים המכילים בסרום יש להימנע. לדוגמא, אם ניסויים כרוכים transfection של קצר מפריעי RNA (siRNA) oligonucleotides, ההליך צריך להיות מותאם באמצעות תאי RWPE-1 גדלו ב KSFM, מבלי לכבות את תאי תקשורת transfection בסרום נמוך. חסרון זה עלול לסכן את רמת גן ההשתקה מושג כאשר באמצעות siRNA חולף גישות במודל. עבור מטרות חלבון מסוימות זה יהיה מומלץ להעסיק וקטורי shRNA מושרים עבור להשתקת גנים מתכוננת ואת הירידה ברמות חלבון. עיבודים המשלבים crosslinking האנזימטית ידי תא סטרומה או מונואמין lysyl הקשורים תאים סרטניים (לקס) 17 יכול גם להיות משולב בתוך דגמים עתידיים. jove_content &quot;&gt; פרוטוקול זה יקל על המחקר העתידי של מנגנונים פרו-פולשני מופעלים על ידי נוקשות תלויות גיל בע&quot;מ ב פץ (RWPE-1, BPH-1) והערכת המטרות אנטי-גרורתית PTCs פולשנית (PC3). בהתחשב בכך BPH נחשב הפרעה מטבולית 27, פרוטוקול זה גם סולל את הדרך לקראת ההבנה המשופרת שלנו על הקשר בין הפרעות מטבוליות וסיכון לסרטן הערמונית גדל. בהתחשב בכך נוקשות בע&quot;מ המושרה על ידי חשיפתה גילים יכולות להיות הטריגר הפולשנות בסרטן אחר סוגים, זה יהיה עניין להשתמש בפרוטוקול להקים מודלים דומים המשלבים תאים נורמלים אפיתל ותאי גידול מאיברים אחרים (למשל שד, מעי גס, שחלות, לבלב). צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול, יחד עם התזמונים שלהם, מסוכם באיור 4. במהלך השלב הראשוני זה הכרחי כדי לשמור על פתרון המניות של RBM על 4 מעלות צלזיוס בזמן שהוא מפשיר למנוע pol שלהymerization. טיפים פיפטה לא צריך להיות ממוקם לתוך התמיסה RM המניה עד שהם כבר מקורר עד 4 ° C. עבור השלב הבא חשוב גם כדי להבטיח את השקופיות הקאמריות יש equilibrated עד 4 מעלות צלזיוס לפני שהם מכוסים פתרון RBM. ברגע הטמפרטורה של פתרון RBM היא עלתה מעל 4 מעלות צלזיוס הוא יעבור פילמור בלתי הפיך כדי ליצור ג&#39;ל. זה חיוני כי RBM אינה מופרע בשלב פילמור כדי להבטיח שהיא יוצרת משטח ישר מתאים תרבית תאים וניתוח מיקרוסקופי. משך הדגירה עם GLA עם או בלי מעכבי התגובה Maillard (cyanoborohydride נתרן amingoguanidine) יקבע איך נוקשה הג&#39;ל RBM הופך. מומלץ להשתמש דגירת hr 6 עם GLA אם תנאים חצי נוקשים נדרשים, דגירת 14 שעות אם נדרשים תנאים נוקשים (טבלה 1). פעמי דגירה חלופיות או ריכוזים של GLA יכולות לשמש אם רמות שונותשל קשיחות הם רצויים. בניתוח rheological במקרה זה של הג&#39;לים RBM צריך להיות משולב כצעד הכרחי. בעקבות הצעד של מרווה התגובה Maillard ידי הדגירה עם GEE ואת השלבים כביסה הבאים עם PBS, ג&#39;לים RBM ניתן להשתמש מיד או לאחסן 4 ° C עד 48 שעות לפני השימוש בהם עבור תרבית תאים. לאחר בתרביות תאים מוגדרות חשוב לשנות את מדיום התרבות (כולל כל טיפולים) כל ימים. מומלץ לשמור על תרביות תאי 3D עבור 3-12 ימים בהתאם לפרמטרים תחת חקירה. לקבלת 3D PEC acini מומלץ לנתח התרבויות לאחר 6 ימים, לניתוח 3D PTC spheroids מומלצת לאחר 3 ימים של תרבות בערכאה הראשונה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> איור 4:. סקירה פשוטה של הפרוטוקול עם שלבי תזמונים קריטיים הצביע על פלהבתרשים w מתאר כיצד להכין להקשיח את הקרום במרתף מחדש (RBM) עם glycolaldehyde (תגובת מייארד) בצעדי תזמונים קריטיים מצוינים. נקודות כאשר הפרוטוקול ניתן לעצור, וג&#39;ל RBM מאוחסן, מסומנים גם. RBM, קרום במרתף מחדש; GLA, glycolaldehyde; GEE, אתיל אסתר גליצין; ON, לילה; PBS, פוספט שנאגר מלוח; RT, בטמפרטורת החדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3. 
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9. 
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:628px;">I - Material for monolayer culture</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:401px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPH-1</td>
			<td>CaP Cell Line Database</td>
			<td>PCaCL-132</td>
			<td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete keratinocyte serum-free media&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005-075</td>
			<td>Do not warm at 37 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>First Link UK Ltd</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC3&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td>warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RWPE-1&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">II - Material for 3D culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>396494</td>
			<td>Irritating to eyes, respiratory system and skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides, 8-well&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td>
			<td>TKT-210-816M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract&#160;</td>
			<td>AMS Biotechnology</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td>Store Basement membrane (BM) at -80 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanogen bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C91492</td>
			<td>Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50060</td>
			<td>Irritating to eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycolaldehyde dimer (GLA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cyanoborohydride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71435</td>
			<td>Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter 0.22 microns</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>BC680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">III - Material to quantify Maillard reaction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>light sensitive and store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cloning cylinders</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td>
			<td>TransGenic Inc</td>
			<td>KH012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1041</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-laminin A/C pAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-7292</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis cassette Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IV - Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ARG2 controlled strain rotational rheometer</td>
			<td>T.A. Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert S100 (20x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">V - Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J 1.47v</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress</td>
			<td>Molecular Divices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases

כאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את המיקרו-סביבה biophysical הקשורים עובי מוגבר ונוקשות של קרום במרתף (BM) במהלך פתולוגיות הקשורות לגיל והפרעות מטבוליות (סרטן למשל, סוכרת, מחלות כלי הדם, רטינופתיה, נפרופתיה ונוירופתיה) . הנחת היסוד של המודל היא crosslinking אנזימטית של מחדש BM (RBM) מטריקס על ידי טיפול עם glycolaldehyde (GLA) לקדם endproduct גליקציה מתקדמים (AGE) דור דרך התגובה Maillard. דוגמאות של טכניקות מעבדה שניתן להשתמש בהם כדי לאשר דור גיל, crosslinking אנזימטית והגדילה נוקשות GLA מטופלים RBM מתוארים. אלה כוללים הכנת יליד RBM (שטופל פוספט שנאגר מלוח, PBS) RBM הנוקשה (שטופל GLA) לקביעה: תוכן AGE שלה על ידי ניתוח photometric מיקרוסקופיה immunofluorescent, crosslinking אנזימטית על ידי polyacrylamide סולפט dodecyl נתרןג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד SDS) וכן במיקרוסקופ confocal, ו rheometry באמצעות קשיחות מוגברת שלה. ההליך המתואר כאן ניתן להשתמש כדי להגדיל את הקשיחות (moduli אלסטי, E) של RBM עד 3.2 פי, עולה בקנה אחד עם מדידות שנעשו בריא לעומת רקמת ערמונית אדם חולה. כדי לשחזר את המיקרו-סביבת biophysical הקשורים להזדקנות וערמונית חולה בלוטת שלושה סוגי תאי ערמונית הוכנסו על RBM יליד והנוקשה RBM: RWPE-1, תאי אפיתל ערמונית (פץ) נגזר בלוטת ערמונית נורמלית; BPH-1, פץ נגזר בלוטת הערמונית מושפעים היפרפלזיה שפירה של הערמונית (BPH); ו PC3, תאים גרורתי נגזרים סרטן עצמות משני שמקורם בסרטן הערמונית. פרמטרים מרובים ניתן למדוד, כולל הגודל, הצורה והמאפיינים פולשנית של acini 3D הבלוטות נוצר על ידי RWPE-1 ו BPH-1 בנוגע ליישום מקורי בניגוד RBM נוקשה, ואורך התא הממוצע, מהירות הנדידה והתמדה של תנועת התא של 3D spherOIDs נוצר על ידי תאי PC3 באותם תנאים. Cell מסלולי איתות ואת לוקליזציה subcellular של חלבונים ניתן להעריך גם.

3D הערמונית acini בתרבית על Stiff RBM לאחר 6 ימים בתרבות, פץ נגזר רקמות ערמונית נורמליות (RWPE-1) (איור 1 א) ורקמות BPH (BPH-1) (איור 1 ב) טופס acini על ילידים (PBS מטופלים) RBM כי מאורגנים spheroids האחיד של אפיתל תאים. Acini אלה יש גם את המאפיינים של פץ מאורגן עם קוטביות הפסגה אל הבסיס וכן לומינל גלוי שטח 13,20. Acini נוצר על ידי פץ נגזר רקמות ערמונית נורמליות (RWPE-1) (איור 1 א) ורקמות BPH (BPH-1) (איור 1B) על התקשחה (AGE העשירי) RBM (שטופלה GLA) יש ארכיטקטורה שבשה (הסטה מ spheroidal כדי מצולעים בכושר ותאי בולטות / נודדות מן acini לעידן עשירי RBM) (איור 1 א). אלה<html> acini מאופיינים גם על ידי פץ מאורגן מאוד כי איבדו קוטביות הפסגה אל הבסיס שלהם עם רווח לומינל קטן או אפסי 13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> איור 1:. הערמונית אפיתל תאים שגודלו כמו 3D הבלוטות acini על ממברנה מרתף מחדש Native ונוקשה (RBM) (א) תמונות Brightfield של RWPE-1 תאים שגודלו במשך 12 שעות עד 6 ימים על ג&#39;ל RBM שטופלו PBS (מקורי) או 50 מ&quot;מ glycolaldehyde במשך 14 שעות (AGE עשירים; נוקשה); בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) BPH-1 תאים, גדל כמתואר פאנל; ברי סולם = 50 מיקרומטר; נתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> טבלה 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; טבלה 1:. מאפייני הערמונית אפיתל RWPE-1 acini גדל על שפת אם, חצי נוקשה ו ממברנה מרתף מחדש קשה (RBM) RWPE-1 acini גדלו על RBM טרום שטופלו PBS במשך 14 שעות (מקורי), glycolaldehyde (GLA במשך 6 שעות (חצי נוקשה) או GLA) במשך 14 שעות (נוקשה). לקבלת הצורה acinar, אחוז (%) ± סטיית תקן (SD) של עגול, חצי מצולעים מצולעים acini חושבו מתוך 5 ניסויים בלתי תלויים (50 acini לכמת לכל מצב). גודל acinar יחסית חושבה (יליד RBM = 100%) מן 3 ניסויים בלתי תלויים. לקבלת הפולשנות,% ± acini SD עם תאים בולטים אחד או יותר חושבו מתוך 3 ניסויים בלתי תלויים. שינוי פולד מחושב על ידי חלוקת שווי הממוצע שהושג בתנאים חצי נוקשים או נוקשים ידי הערך המקביל תנאי ילידים. ערכי P מחושבים באמצעות מבחן t (α = 0.05). ontent &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; נוקשות RBM תלויות גיל גדל מקדמת נדידת תאים סרטניים בערמונית PC3 תאי PC3 גדלו על ילידי RBM להעביר על ידי קשר תאי תאים רציף, בעוד שתאי PC3 גדלו על גיל עשירי (נוקשה) RBM מהלך עצמאי מכל (איור 2 א) אחרים. לאחר 72 שעות בתאי PC3 תרבות מהוות מוקדים (spheroids) על ילידים (PBS מטופלים) RBM, ואילו תאי PC3 על RBM הנוקשה (AGE העשירי) לא מן spheroids ולהעביר באופן עצמאי (תרשים 2B). תאי PC3 על RBM הנוקשה (AGE העשירי) הם מוארכים יותר מאשר תאי PC3 גדל על RBM ילידים (איור 2 ג). תאי PC3 על RBM נוקשה להעביר מהר יותר מתאים PC3 גדל על RBM הילידים (2D איור). תאי PC3 על RBM נוקשה להציג ירידה התמדה בהשוואה לתאים PC3 גדל על RBM הילידים (איור 2E). <img aLT = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54,230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2:. נדידת תאים סרטניים הערמונית על ממברנה מרתף מחדש Native ונוקשה (RBM) (א) תמונות Brightfield של תאי PC3 גדל על ג&#39;לים RBM שטופלו PBS (מקורי) או 50 מ&quot;מ glycolaldehyde במשך 14 שעות (AGE-עשיר, נוקשה) . תאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ brightfield (אובייקטיבי 10X) ושיעור רכישת 1 התמונה לכל שעה במשך 12 שעות ואחריו תא מעקב ליצור מסלולים. מהתמונות המוצגות מתאימות נקודות הזמן לאחר 0, 3, 6, 9 ו -12 שעות. מסלולים של תאים בודדים מוצגים עבור נקודת 12 שעות הזמן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) בתאים PC3 בתרבית על RBM יליד או נוקשה במשך 72 שעות, צילמו כמתואר בלוח (א). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. פרטים מראים אזור נבחר בהגדלת 2X. (ג) ממוצע ± סטיית תקן אורך תא (מיקרומטר); הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM נוקשה (p = 1.2 x 10 -23). ( <strאונג&gt; D) ממוצע ± סטיית תקן מהירות (מיקרומטר / hr) שנמדדות מסלולי התא; הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM הנוקשה (p = 0.004). (E) ממוצע ± סטיית תקן התמדה של תנועת התא (יחס D / T, כאשר D = המרחק מתחילתו ועד סופו של מסלול התא, T = האורך הכולל של מסלול התא); הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM הנוקשה (p = 0.0007). עבור לוחות לספירה&gt; 10 תאים נותחו, נתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

נסביר פרוטוקול למידול במיקרו-סביבה של biophysical שבו crosslinking וקשיחות מוגברת של קרום במרתף (BM) הנגרמת על ידי endproducts גליקציה מתקדמים (גילאי) יש רלוונטיות פתולוגי.

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

how-to-study-basement-membrane-stiffness-as-biophysical-trigger

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K Views.  Universidad de la República (UDELAR).  נסביר פרוטוקול למידול במיקרו-סביבה של biophysical שבו crosslinking וקשיחות מוגברת של קרום במרתף (BM) הנגרמת על ידי endproducts גליקציה מתקדמים (גילאי) יש רלוונטיות פתולוגי. 

Video: How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have emerged in conjunction with the state-of-the-art positron emission tomography with 18F-fluorodeoxyglucose ([18F]-FDG PET). 13C magnetic resonance spectroscopic imaging (13CMRSI) is a minimally invasive imaging method that enables the monitoring of metabolism in vivo and in real time. As with any other method based on 13C nuclear magnetic resonance (NMR), it faces the challenge of low thermal polarization and a subsequent low signal-to-noise ratio due to the relatively low gyromagnetic ratio of 13C and its low natural abundance in biological samples. By overcoming these limitations, dynamic nuclear polarization (DNP) with subsequent sample dissolution has recently enabled commonly used NMR and magnetic resonance imaging (MRI) systems to measure, study, and image key metabolic pathways in various biological systems. A particularly interesting and promising molecule used in 13CMRSI is [1-13C]pyruvate, which, in the last ten years, has been widely used for in vitro, preclinical, and, more recently, clinical studies to investigate the cellular energy metabolism in cancer and other diseases. In this article, we outline the technique of dissolution DNP using a 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer and demonstrate its usage in in vitro studies. A similar protocol for hyperpolarization may be applied for the most part in in vivo studies as well. To do so, we used lactate dehydrogenase (LDH) and catalyzed the metabolic reaction of [1-13C]pyruvate to [1-13C]lactate in a prostate carcinoma cell line, PC3, in vitro using 13CMRSI.

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Hyperpolarized<sup&gt; 13</sup&gt; ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית מטבולית C והדמיה

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of nuclear apoptotic characteristics, including chromatin condensation and DNA breakage. Once the MMP collapses, cell apoptosis will initiate irreversibly. A series of lipophilic cationic dyes can pass through the cell membrane and aggregate inside the matrix of mitochondrion, and serve as fluorescence marker to evaluate MMP change. As one of the six members of the Cl- intracellular channel (CLIC) family, CLIC4 participates in the cell apoptotic process mainly through the mitochondrial pathway. Here we describe a detailed protocol to measure MMP via monitoring the fluorescence fluctuation of Rhodamine 123 (Rh123), through which we study apoptosis induced by CLIC4 knockdown. We discuss the advantages and limitations of the application of confocal laser scanning and normal fluorescence microscope in detail, and also compare it with other methods.

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Here we present a detailed protocol for the application of rhodamine 123 to identify the mitochondrial membrane potential (MMP) and study CLIC4 knockdown-induced HN4 cell apoptosis in vitro. Under common fluorescence microscope and confocal laser scanning fluorescence microscope, the real-time change of the MMP was recorded.

זיהוי של המיטוכונדריה פוטנציאל ממברנה לימודים CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס במבחנה

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell proliferation and increased nutrient absorption, are critical in recovery, yet poorly understood. Understanding the molecular mechanism behind the adaptive responses is crucial to facilitate the identification of nutrients or drugs to enhance adaptation. Different approaches and models have been described throughout the literature, but a detailed descriptive way to essentially perform the procedures is needed to obtain reproducible data. Here, we describe a method to estimate important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis in mice. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker, as well as using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints. Some of the critical steps within the described method are the removal and weighing of the small intestine and the rather complex software system suggested for the measurement of this technique. These methods have the advantages that they are not time-consuming, and that they are cost-effective and easy to carry out and measure.

Here, we present a protocol to establish important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker and using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints.

חשוב נקודות קצה וסמנים ההתרבות כדי להעריך פגיעה במעיים קטנים והסתגלות באמצעות מודל העכבר של Mucositis הנגרמת כימותרפיה

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate organoids are androgen responsive, three-dimensional (3D) cultures grown in a defined medium that resembles the prostatic epithelium. Prostate organoids can be established from wild-type and genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer. Importantly, patient derived organoids closely resemble tumors in genetics and in vivo tumor biology. Moreover, organoids can be genetically manipulated using CRISPR/Cas9 and shRNA systems. These controlled genetics make the organoid culture attractive as a platform for rapidly testing the effects of genotypes and mutational profiles on pharmacological responses. However, experimental protocols must be specifically adapted to the 3D nature of organoid cultures to obtain reproducible results. Described here are detailed protocols for performing seeding assays to determine organoid formation capacity. Subsequently, this report shows how to perform drug treatments and analyze pharmacological response via viability measurements, protein isolation, and RNA isolation. Finally, the protocol describes how to prepare organoids for xenografting and subsequent in vivo growth assays using subcutaneous grafting. These protocols yield highly reproducible data and are widely applicable to 3D culture systems.

Presented here is a protocol to study pharmacological responses in prostate epithelial organoids. Organoids closely resemble in vivo biology and recapitulate patient genetics, making them attractive model systems. Prostate organoids can be established from wildtype prostates, genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer.

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST