אנו מודים לחברי מעבדת הצלב עבור ייעוץ ודיון שימושי. עבודה זו נתמכה על ידי PHS 5RO1-GM078153 ועל ידי פרס עמית ג&#39;וניור מן סימונס קרן למיכל Breker.

1. mutagenesis UV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן יצווה של 100 - 200 צלחות אגרו מלבני עם טריס-תצטט-פוספט (TAP) 9,10 בינונית. כן צלחות אלה כמה ימים קדימה ולשמור אותם על הספסל להתייבש כדי להבטיח קליטה מהירה של התאים המושעים בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chlamydomonas תרבות תאים עד 0.2 - 0.5 צפיפות אופטית (OD 750; ~ 2 ימים) ב 100 מ&quot;ל של TAP נוזל תחת אור, של 25 מעלות צלזיוס ו רועד ב 100 סל&quot;ד. הערה: mutagenesis UV מתבצע באופן עצמאי בשני רקע גנטי: Mat- hygro r (מקנה עמידות hygromycin B) ו Mat + Paro r (מקנה עמידות Paromomycin). בחירה אנטיביוטיה היא שרירותית, בתנאים שיש שני סוגי הזדווגות התנגדויות תרופה משלימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מדגם של כל התרבויות תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי התאים הם קיימא, בריאה (שחייה ללא פגע), וללא זיהום. הערה: תרבויות מגודל &quot;התרסקות&quot; ולאבד את יכולת הקיום, כפי שהן מופיעות &quot;רוחות רפאים&quot; במיקרוסקופ בניגוד שלב. אין להשאיר תרבויות שייקר הולך פעם שהם מגיעים לרוויה. תופעת &quot;רפאים&quot; ניתן לזהות בקלות בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבות 0.003 OD 750. לעטוף את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי להבטיח צפיפות הומוגנית, כמו המתח הוא ניע ושוחה כיוונית בתגובה לאור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הצפיפות של ההשעיה המבוססת על מנת UV המתוכננת, כך והיוו הרג תא, 200 - 600 מושבות ניצול תהווינה על הצלחות (איור 1). ראה טבלה מס &#39;1 עבור מידע על זמני חשיפה UV. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף קלטת קטן-צינור שמתאים מנפק נוזל ולבצע סדרה של שוטף עבור עיקור, על פי הוראות היצרן, על מנת למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מנפק נוזל 8 x 12, לוותר 4 x 96 טיפות של 2 μl כל לצלחות מלבניות (איור 1 </strong&gt;). הקש במתינות על שולי הצלחת להבטיח את התמזגות של כל טיפות לתוך שכבה דקה של נוזל ומיד לכיסוי הלוחות כדי למנוע חשיפה לאור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח אפילו מאוד פיזור תא בודד, להשתמש בצלחות יבש, כאמור לעיל, ומהר לכיסוי הלוחות כדי למנוע את התאים משחייה בתגובה לאור. שמור על רמת צלחות המכוסות בחושך עד שכל הנוזל נספג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות תחת מנורת UV קוטל חידקים (30 ואט צינור UV קוטל חידקים) לפרקי זמן לקבוע באופן אמפירי לתת תשואה אופטימלית של מוטציות ts- בקרב הניצולים. הנה, השתמש פעמים של 0.5 - 1.5 דקות במרחק של 40 - 50 ס&quot;מ כדי לגרום 90 - 99.9% הריגה. ניצולים מכילים 100 - 1,000 מוטציות נקודתיות נגרמות UV, מתוכם כ -10% רצפי קידוד שינוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח עצמה המקסימלית של קרינת UV ללא חזרה בשל DNA אור תלוי לתקן 11,12, לעבוד בחושך בשלב זה ומייד לארוז אתצלחות בקופסה כהה לאחר ההקרנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צלחות בחושך עבור 8 - 24 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות באינקובטור ג &#39;21 ° עם תאורה ליצור מושבות. היווצרות מושבה לוקחת ~ 10 ימים. הקפד לעטוף את הצלחות עם שקיות ניילון ולהוסיף נייר סופג בתוך למחוק את עיבוי נוזל. אידוי מחזורי התעבות אחר יכולים לספק נתיבי סרט נוזלים מזהם להיכנס הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחות הערימות הרלוונטיות כמקורות לקטיף מושבה רובוטית (איור 2). פיק מושבות עבור 384 מערכים על צלחות מלבניות, ולגדל אותם ב 21 מעלות צלזיוס עם תאורה (~ 1 בשבוע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמצת את 384 מערכים לתוך 1,536-מערכים (4: 1) באמצעות רובוט ציפוי-העתק (איור 3), ולאפשר צלחות לגדול במשך ~ 3 ימים בחממה ג &#39;21 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את 1,536-מערכים לשתי צלחות כל ומקום אחד בחממה 21 ° C (מתירניטמפרטורה) והשני בתוך 33 ° C חממה (טמפרטורה כובלת). בעקבות 24 שעות, לשכפל הצלחות ב -33 ° C עד סט חדש של צלחות מראש התחמם, ומניחים אותם בחממה C 33 °. הערה: סיבת ציפוי משני זו היא כי TS מוטציות קטלניות יכולות במקרים מסוימים לצבור ביומסה משמעותי, גם אם התאים נעצרים במחזור התא הראשון לאחר הציפוי. העתק משני מבטל איתותים ואת המגדיל מאוד רגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם את הצלחות עם מצלמה דיגיטלית הבאה 3 ימים של צמיחה ב 33 מעלות צלזיוס, 5 ימים של צמיחה ב 21 ° C. החזק את הצלחות בתוך מסגרת קבועה. השתמש אינדיקטורים יישור &quot;רשת-צלחת&quot; מסומנת עם תשעה אשר צולמו יחד עם צלחות התרבות (איור 4). צילום צלחות תרבות כמו לסירוגין לזווג 21 ° C ו- 33 ° C (21/33) תמונות. הערה: פעמי דגירה שונות משמשות כדי להשוות צמיחה מאז סוג הבר גדל באופן משמעותימהר על 33 ° C מאשר ב 21 מעלות צלזיוס. </li></ol> זיהוי 2. מועמדים Mutant ts: מסך ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את תמונות צלחת 21/33 זיווג עם תוכנת ניתוח תמונה מותאמת אישית Matlab לחסל את הרקע ואת לפלח את התמונות לתוך מערך 1,536. התכנית תקבע את ביומסה זוהתה (עוצמת פיקסל הכל) בכל עמדה (איור 5). הערה: התוכנה (מסופקת SI יחד עם הוראות) תשתמש התמונה לרשת צלחת כדי לקבוע את מיקומם של תאים (רשומות בודד) בתוך מערך 1,536 על יישור הגדלת צלחת בשימוש ולחשב עוצמת פיקסל הכל בכל תא . ערכים אלה עבור כל מוטציה אז מושווים נגד פרמטרים מתכווננים לקבוע צמיחה הנדרשת ב 21 מעלות ביחס C אל ts + סטנדרטי מידת רגישות טמפרטורה, מוגדר כך: S (Mut 33) / S (33 WT) / S (Mut 21) / S (WT 21), כאשר ס &#39;היא אות (פיקסלדריכות לאחר חיסור רקע), Mut היא מוטצית פרט, &quot;WT&quot; הוא מושבה שנבחרה באקראים שאינם רגישה לטמפרטורה (זן mutagenized שיש ts + פנוטיפ). צמיחה ב 21 ° C מוגדר S (Mut 21) / S (WT 21). במסך הראשון, להחיל קריטריוני הבחירה רגוע (המאפשר צמיחה נמוכה יחסית, ועומדת על 21 מעלות צלזיוס ותואר נמוך יחסית של רגישות לטמפרטורה) כדי לשמור על שיעור נמוך שלילי כוזב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את רשימת המושבות שנבחרו שנוצרו על ידי התוכנה כקובץ הוראה עבור-המושבה אחת לקטוף רובוטיקה (בדרך כלל למערך 384). הכן את צלחות המקור ושפת היעד בהתאם להוראות רובוטיקה לבחור מושבות למערך (איור 6). הערה: מוסקים קונבנציונליים מחייבות קובץ הוראות בפורמט מסוים, כגון CSV, TXT, או xls. כל המוסקים יהיו את היכולת להיות מונחת קובץ; בפורמטים שונים ידרשו עריכה קלה של קוד MATLAB (קוד מקור סופק). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צלחות היעד בחממת C 21 מעלות במשך ~ 5 ימים לגדול צלחת מניות. </li></ol> 3. זיהוי מוטאנטים ts: מסך שני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.1 לבדיקה חוזרת מושבות תלושות. בדרך כלל 30 - 50% של מושבות יהיו בדוקים שוב כמו lethals ts הברור, תשואה של 2% - 5% ts lethals ביחס מושבות ראשוניות לשרוד mutagenesis UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.2 עבור לקטוף את lethals ts פעמים הוקרן, אך עם קובץ הוראות שונה שנועד מושבות מערך לגושים של 100 מושבות על צלחות מלבניות בכל בצפיפות 384. זהו לבדיקה מיקרוסקופית נוחה בשלב הבא. פורמט קובץ הוראות מצוין בזמן ריצה על ידי קוד MATLAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לכלול מספר מושבות WT כביקורת ומניחי הצלחות ב 21 מעלות צלזיוס במשך ~ 5 ימים. </li></ol> 4. קביעת הפנוטיפ ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל הצלחות 100-בלוק ערוכים בשלב 3.2 ולמקם אותם incu ג &#39;21 °בטור עבור ~ 2 ימים כדי להשיג מושבות גדל טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את העותק החדש של צלחות 100-הגוש (4.1) כדי שלושה עותקים. מניח עותק אחד בחממת ג &#39;21 ° ואחד בחממת C 33 ° כקבוצת ביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את העותק השלישי ( &#39;סינון צלחות &quot;) או בהתקנה רובוטית, ספוט המושבות עם סיכות ארוכות נגעו במים מעוקרים. הערה: תאי Chlamydomonas המוצמדים אגר נוטים רובוט לנחות תחילה ככתם די צפוף של תאים, עם כמה תאים בודדים לעיון מיקרוסקופי. כדי לייעל את המושבות לבדיקה מיקרוסקופית, במקום תאים הועברו בתחילה עם טיפת המים (נפח המים המועברים על ידי סיכות רובוטית הארוכות הוא ~ 100 NL). התוצאה היא פיזור של התאים ברדיוס קטן (~ 1 מ&quot;מ) על מרכז המצמיד הראשוני, עם תאים בודדים רבים מבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח photomicrographs של אזור של כל נקודה ונקודה של צלחות הקרנה בזמן 0 (ועדיין יחיד, תא מחולק) (איור 7) ולמקם צלחות ב 33 מעלות צלזיוס במשך הדגירה. לקבוע מיקום תמונה על ידי השליטה בשלב הידנית של מיקרוסקופ לנתיחת הטטרדה שונה להגדיר לתת ועוצר את מרווח מרכז אל מרכז 4.5 מ&quot;מ של מערך 384-צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות ההקרנה מן החממה C 33 ° ולקחת photomicrographs, כמו בשלב 4.4, בנקודות שונות בזמן (10 שעות, 20 שעות, 48 שעות). ודא הבמה, בעל הצלחת, ואת הבקר בשלב מכויל בדיוק כדי לקבל תמונות של אותם תאים בכל נקודת זמן. בצע רכישת photomicrograph מהירה (~ 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש העותק השני בחממה C 33 ° לאמת את הפנוטיפ ts וכדי לוודא כי תנודות הטמפרטורה במהלך רכישת התמונה אין השפעה גדולה על ts הפנוטיפ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונות מיקרוסקופיות ולבחור עבור מוטציות בהתבסס על הקריטריונים הרצויים (איור 8). ספוט את הערכה שנבחרת הסופית בצלחת אגרה-ערוכה 96. ודא כי כלצלחת מכילה מוטציות מאותו סוג ההזדווגות העמידה לתרופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל צלחת, לשלב את שתי העמודות האחרונות (מוטצית שאילתא) חיובית ושלילית (WT) שליטה עבור assay השלמה. </li></ol></li></ol> 5. השלמה והצמדה בדיקה של ניו מוטאנטים כדי &quot;מתניידים&quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כמויות גדולות של מושבות הערוכות עד בינוני הגמטות אינדוקצית חנקן ללא 10 ב 96 גם microplates (צפיפות של כל מושבה צריכה להיות סביב 0.2 OD). דגירת הצלחות תחת אור (13 - 20 ואט נורה כספי) עבור ~ 5 שעות כדי לאפשר gametogenesis. הערה: שלב זה יכול להתנהל גם עם התקנה רובוטית משכפלת או ידני באמצעות מכשיר ציפוי פשוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות שאילתות עם סוגי ההזדווגות מול מחסה קלטות התנגדות האלטרנטיבה לתוך צינורות עם מדיום חנקן ללא הגמטות אינדוקצית 10 עבור gametogenesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את דגימות צלחת היעד זיווג mixtנפח יור של 20 μl (איור 9). בעקבות ~ 10 דקות מתחת לפנס, במקום 5 μl מכל טוב פעמיים: פעם אחת על צלחת TAP לבדיקה הצמדה ופעם מהחבית + 5 מיקרומטר Paro + 9 מיקרומטר hygro לבדיקה השלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחות ההצמדה בחממת ג &#39;21 ° הלילה, ולאחר מכן לעטוף אותם בנייר כסף. שמור אותם בחושך במשך 5 ימים כדי לאפשר היווצרות zygospore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחות השלמות בדיקות עבור ~ 10 ימים לאור ב 21 מעלות צלזיוס. הערה: סכומי התרופה מכוילים לאפשר הישרדות של diploids הטרוזיגוטיים כפליים, אבל הם עדיין מספיק כדי לחסל את haploids ההזדווגות. סכומים אלו כוילו עבור ואינטגרציות קלטת התנגדות סטנדרטיות המשמשות בפרויקט הספציפי הזה; עם אינטגרציה אישית חדשה, יש recalibrated מינונים. רוב ביומסה מאומתת להיות diploids ידי cytometry זרימה (איור 9), אם כי ברמה משתנה של haploids (כנראה המיוזה וצמיחה של עמיד כפלייםsegregants) בדרך כלל הוא ציין גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל הצלחות-בדיקות השלמות לשני עותקים לזיהוי פנוטיפ ts-. מניחים עותק אחד בכל 21 ° C והעתק אחד ב 33 מעלות צלזיוס במשך ~ 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות מבחן עבור הפנוטיפ ts-, כמפורט בסעיף 2.1 (איור 5). המושבות שאינם משלימים עם השאילתה צפויות לייצג אללים של אותו גן כמו השאילתה (diploids הטרו-אללים עבור מוטציות באותו גן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקה הצמדה, לאחר שלב 5.4, להעביר את הצלחות בחזרה אור לאפשר המיוזה ו תולדה של segregants הפלואידים עבור ~ 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל צלחות בדיקות הצמדת TAP + 10 מיקרומטר Paro ו -10 מיקרומטר hygro לבחור עבור progenies הכפול עמיד (צפוי להיות 25% של הצאצאים הפלואידים, מאז הקלטות אינן צמודות) ו לדגור על 21 מעלות צלזיוס למשך שבוע. הערה: להגדיל את מינון התרופה עבור haploids כפליים עמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות מבחן עבור הפנוטיפ ts-, כפי שאניn לשלב 2.1. הערה: פנוטיפ ts- צפוי (וצופה) עבור מוטציות בקבוצה השלמה הזהה השאילתה. בנוסף, פנוטיפ ts- ב assay ההצמדה עבור מוטציה המשלימה את השאילתה, יכול לשקף הצמדה הדוקה בין השאילתה ואת המוטציה החדשה. מוטאנטים המשלימים שאילתות הנבדקות הם גנים חדשים סבירים אשר יכנסו הצינור לזיהוי bioinformatic של הנגע סיבתי, ובסופו של דבר לניתוח פנוטיפי נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microbial+avenue+to+cell+cycle+control+in+the+plant+superkingdom.">A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom.</a> Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).</li><li>Cross, F. R., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+cell+cycle.">The Chlamydomonas cell cycle.</a> Plant J. 82, 370-392 (2015).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Indexed,+Mapped+Mutant+Library+Enables+Reverse+Genetics+Studies+of+Biological+Processes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 28, 367-387 (2016).</li><li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-Dependent+Kinase+Regulation+of+Diurnal+Transcription+in+Chlamydomonas.">Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas.</a> Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).</li><li>Simchen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+mutants.">Cell cycle mutants.</a> Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).</li><li>Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+the+cell-division+cycle+in+yeast.">Genetic control of the cell-division cycle in yeast.</a> I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants.">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li><li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell. 30, 248-258 (2008).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Dutcher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+and+tetrad+analysis+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).</li><li>Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+in+plants+under+ultraviolet+and+ionizing+radiations.">DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations.</a> Sci World J. 2015, 250158 (2015).</li><li>Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+mechanisms+of+DNA+repair+by+photolyase.">Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).</li><li>Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+and+plant+development.+Annual+Plant+Reviews,+Volume+32.">Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32.</a> Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).</li><li>Zachariae, W., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+end+is+destruction:+cell+division+and+the+anaphase-promoting+complex.">Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex.</a> Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).</li><li>Merchant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+genome+reveals+the+evolution+of+key+animal+and+plant+functions.">The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions.</a> Science. 318, 245-250 (2007).</li><li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).</li><li>Mnaimneh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles.">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li><li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile.">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים משמעותיים.

הצינור המתואר כאן לבידוד תשואה גבוהה של מוטציות קטלניות ts מבטיח כי ככל הנראה כל המסלולים הסלולר חיוניים של הגנום Chlamydomonas מיוצגים. שני השלבים הקריטיים ביותר עבור גבייה יעילה של גני מחזור התא פוטנציאליים לשם מניעת חוזרות &quot;נוסע המתמיד&quot; אללים הם: 1) ההגדרה קוהרנטית של מאפייני פנוטיפ מעצר מחזורי תא שלמים 2) assay השלמה במקביל נגד שכבר זיהה שאילתא גנים כדי להגדיל את האוסף עם אלה שזה עתה מבודד. כאשר מסונכרן על ידי מחזורי אור כהה, Chlamydomonas גדל photosynthetically בשעות היום ועלייה גודל התא&gt; 10x ללא כל חלוקה DNA שכפול או תא 13. כ חופף עם תחילת הלילה, תאים ואז עוברים מחזורים רבים של לסירוגין שכפול הדנ&quot;א, מיטוזה, ואת חלוקת תא (איור 8). שכם תקין זהדואר מספק הבחנה טבעית בין הגנים הדרושים בעיקר עבור צמיחת תאי יושרת גנים הדרושים במיוחד עבור מחזור חלוקת תא. מצאנו כי 10-hr ונקודות הזמן של 20 שעות הם מאוד אינפורמטיבי עבור פנוטיפי מחוספס ראשוני לחתוך 1. השיעורים הרחבים של מוטציות קטלניות ts שנכיר כיום, בהתבסס על התמונות האלה (ראו SI ב Tulin וקרוס, 2014) 1, הם: Notch, פופקורן, עגול, קטן, בינוני, תמוגה מוקדם, מחזור מרובה (איור 8 ). שלוש הקטגוריות הרלוונטיות ביותר אנו מתמקדים הם Notch, פופקורן, ועגול. פנוטיפים &quot;Notch&quot; ו- &quot;פופקורן&quot; הוצגו בעבר להיות מאפיין של התא ביותר במחזור ספציפי הנגעים (למשל, קינאז cyclin התלוי mitotic, מכונות שכפול הדנ&quot;א, topoisomerase II) 1. הופעתו של אחד (Notch) או מרובה (פופקורן) מטוסים לכאורה של חלוקת תא מתחלה אבל לא מוצלחת היא morphol נוחמחוון ogical חניכת מחזור התא. מוטציות אלה מפגינים בדרך כלל מעט או ללא פגמי צמיחה, עם גידול בנפח תא דומה WT ב סימן 10 שעות. פנוטיפים Notch ופופקורן ניכרים ב -10 שעות ו מפותחים לגמרי (קשור לעתים קרובות עם תמוגה תא) ב -20 שעות. &quot;עגולים&quot; תאים לגדול בדומה WT אבל עם ייצור הרבה מופחת של מטוסי חטיבה מתחלים לכאורה, ובכך מניב גדול, עגול תאים נעצרו. מוטציות קודמות בקטגוריה זו נפלו למרכיבים של קידום anaphase המורכב 14 או הגנים הדרושים לתפקוד microtubule (קו-פקטורים מתקפל-טובולין, מורכבי טבעת טובולין גמא) 1. לפעמים מאוחר יותר, תאים אלה לעתים קרובות מפגינים תמוגה תא מובהק. &quot;קטן&quot; ו &quot;בינוניים&quot; תאים לגדול או negligibly (קטן) או משמעותי פחות מ WT (בינוני). רבי המוטציות אלה שזוהו עד כה יש נגעים בגנים אשר הסברים מציעים תפקידי cellula הבסיסיתהליכי גדילה r (תרגום או biogenesis ממברנה). האפליה המיקרוסקופית העיקרית בין בינוני ועגול נשענת על כמות צמיחה ב 10 שעות (עגול: כמו WT; בינוני: מופחת). מאחר הקטגוריות הקטנות והבינוניות הן גדולות למדי וכנראה משקפות נגעים ב מגוון גדול של מסלולים סלולריים, אנחנו לא מנסים להרוות בקטגוריות אלה; עם זאת, אנחנו רוצים מולקולריים לזהות נציגי המעמד להבין פנוטיפים של אובדן במסלולים מגוונים. שתי קטגוריות נחקרה הם: 1) בתחילת שנות ה-lysing מוטציות שמאבדים שלמות (הפסד של צבע ירוק, אובדן refractility) על-פי ציון 10-hr, עם מעט עדויות של צמיחת תאים לפני ו -2) המחזורים מרובים. תאים מתרבים בדומה WT ב -10 ו -20 שעות, אם כי הם מפגינים חוסר יכולת להשלים לבצע ריבוי לטווח ארוך. אנחנו בעיקר הם מאפיינים &quot;חריץ&quot;, &quot;פופקורן&quot;, ו &quot;עגול&quot; לכלול תאים עגולים קטנים ובינוניים, כמו גםכמו מוטציות דולפות כי חלוקות תא שלמות כמה. זהו בעיקר על מנת להבטיח כי תכונות בסיסיות של הסלולר, כגון צמיחת שלמות הממברנה, הם פונקציונליות ולהעשיר את ההסתברות עבור גנים הקשורים חלוקים. גישה זו נמצאת להיות יעיל באופן אמפירי; עם זאת, ייתכן שגן מחזור התא הוא pleiotropic ויש לו תפקידים נוספים קודם לכן ב- G1, לפני החלוקה בפועל. במקרים כאלה, אשר אנו מצפים להיות נדירים, הם החמיצו. באופן כללי יותר, אנו שואפים מעצר הומוגנית, אשר בהסתברות גבוהה הוא עקב מוטציה סיבתי אחד כי הוא חלבון מתפקד לחלוטין. עם זאת, מאותה הסיבה כמו שתוארו לעיל, ייתכנו נקודות מעצר כמה ולכן, גמישות מסוימת רצויה בבחירת מועמדים. על מנת להעשיר את האוסף עם גנים שזוהו זה עתה, המועמדים שנבחרו assayed עבור השלמה. אנו דורשים ts- בבקרה חיובית (שאילתה מול מוטציה שאילתה) ו- TS + בבקרה שלילית (query נגד WT). מוטציות חדשות באותה קבוצת ההשלמה כמו השאילתה הן ts-. חברות באותה הקבוצה שלמה כמעט תמיד משקפות נגע מולקולרי באותו הגן (זה היה המקרה עבור כל גן כזה בדקנו). לכן, עבור &quot;מתניידים,&quot; אמת מידה זו היא פסילה לאפיון נוסף. מוטאנטים שלא היו באותו קבוצות שלמות כמו השאילתות הנבדקות מועמדי גנים חדשים ומאופיינים עוד יותר על ידי ביואינפורמטיקה כלים ניסיוניים. מאוד התאוששות משתנה של ts- אללים לקבוצות השלמות שונות היא תופעה כי ידועה היא, ההשתנות גדולה במידה ניכרת מאשר רעש פואסון, בשל ההשתנות הפנימית הגדולה של ניוון כדי ts- בין גנים שונים. גורם יכול לכלול הבדלי thermolability מהותיים; בגדלי חלבון שונים; הנוכחות של חלבון כמו מונומר לעומת כמו גדול, התייצב מורכב; ו חמים מוטגנים. זה כמעט nuisa טהורNCE. עם זאת, תוצאה חיובית וכתוצאה מכך אחד היא כי הרשימה &quot;הנוסע המתמיד&quot; אינה ארוכה (עם רק כמה מטרות הכובשות ביותר של הרשימה), ולכן הבדיקות השלמות עתירת העבודה אינה משימה עצומה עד לשלבים המאוחרים של הפרויקט. כגישה משלימה, ביצענו assay הצמדה. ב assay זה, progenies כפול עמיד נבחרים וכפופים לבחינת הפנוטיפ ts-. פנוטיפ ts- צפוי (וצפה) עבור מוטציות באותה קבוצת ההשלמה כמו השאילתה או מוטציות קשורות קשר הדוק. עבור כל הגנים שנבדקו, פרי בטן WT צפוי להופיע (TS + פנוטיפ) ב סבירות מסוימת תלויה המרחק הגנטי. אנו מעריכים כי ישנם כ -100 zygospores לכל הזדווגות במקומות אלה. בהנחת 100% יעילים meiotic, זה יביא כ -100 צאצאי פעמים עמידים לתרופות מן הקלטות העמידות לתרופות הצמודות (25% של צאצאי meiotic, ארבעה לכל המיוזה, בשל Mירושת endelian). זה יהיה גם במקרה של מוטציות ts-, שבו 25% של progenies יהיו כפולה-מוטציה, ו -25% יהיו WT אם מוטציות השאילתה ולבדוק אינן צמודות. לכן, מתוך הצאצאים פעמים עמידות לתרופות, 25% יהיו WT (סביב 25 תאים). זהו המקרה עבור מוטציות לא צמודות לחלוטין; עם זאת, הצמדה מתונה (בתוך ~ 20 סנטימטרים, כ -2 מגה, או 2% מהגנום 115) יפחית במידה רבה או במידה לחסל את אות TS +. במקרה של הצמדה של המוטציה נבדקה לקסטה האנטיביוטיה, TS + haploids כי הם פעמים עמידות לתרופות הן נוכח כמויות נמוכות מאוד. זה בא לידי ככישלון לכאורה להשתלב מחדש עם כל המוטציות הנבדקות, למרות משלים כל המוטציות נבדקות, תוצאה סוטה כי הוא בקלות ציין; במקרים כאלה, backcrossing יפתור את הבעיה. הן ידעו קודם מניתוח רצף, אנו מצפים גני מחזור תא Chlamydomonas להיות סביב 500 גנים 2, אם כי מוst, אבל כנראה לא כולם, הם חיוניים. אנחנו יהיו להעריך את צורך סיבובי mutagenesis נוספים כמו מוטציות יותר נאספות ורמת העולה רוויה. הליך זה נועד ייחודי לחקר תהליכים ביולוגיים חיוניים ואת הגנים והחלבונים לבצען. מתודולוגיות אחרות כדי לייצר הפרעות בגנים חיוניים קיימות (למשל, שינוי של אללים mutagenized באקראי 16, אללים עבדו תנאים 17, או אללים hypomorphic 18). עם זאת, כולם דורשים הומולוגי, אשר נדחקו בתוקף וגטטיבי Chlamydomonas. התקבצו, חזור palindromic קצר interspaced בקביעות (CRISPR) / מערכת Cas9 הוקם ככלי רב עוצמה עבור שינוי גנטי 19; עם זאת, היא עדיין לעבוד ביעילות Chlamydomonas 20. אנושות, כל השיטות האלה דורשים ידע מוקדם של היעד. זוהי מגבלה חמורהאם רוצים לקבל את האפשרות ללמוד משהו חדש! הגישה שלנו תניב מוטציות זיהוי גנים חיוניים, עצמאיים של כל ידע מוקדם. לכן, ברמה הנוכחית של הטכנולוגיה, בידוד של מוטציות אקראיות ts ואחריו זיהוי גנים על ידי רצף עמוק עשוי להיות שיטה יעילה ביותר של צובר כניסה מהירה לתוך ביולוגיה של התא של חיידקים בתוך superkingdom צמח. זיהוי של מוטציות סיבתי (מקרב ~ 100 מקודדי רצף-שינוי מוטציות בכל שיבוט) הוא מעבר להיקף של מאמר זה. רצף עמוק של ברכות segregant bulked 1 הוא יעיל אך עתיר עבודה. אסטרטגית ברכת קומבינטורית לקביעה כל המוטציות מספר רב של זנים, לאחר רצף מספר קטן של ברכות, הוא מאוד עלות ועבודה אפקטיבית. אסטרטגיה חדשה עבור סידור segregant קומבינטורית bulked הוא בפיתוח, אשר יאפשר זיהוי של מוטציות סיבתי בעשרות מוטציות simultaneously בריצת רצף יחיד (בהכנה). שיפורים אלה חשובים מאוד על מנת לאפשר את הצעד זיהוי גנים קריטי לשמור על הקצב עם הצטברות מהירה מאוד של מוטציות כי מתאפשרת על ידי בהתאם לנוהל המתואר.

אפיון פנוטיפי של אוספי מוטציה שיטתיים של אורגניזמים מודל הוא גישה מוכחת לנתח מורכבות הסלולר. Reinhardtii Chlamydomonas אצות הירוק unicellular הפלואידים יש קבוצת גן דמוי צמח, אבל זה התפצל מצמחי קרקע לפני כפילויות הגנום מרובות במפעל קרקע השושלת 2. באופן עקרוני, חוסר שכפול גנטי וכן מחזור החיים הפלואידים בעיקר מקלה מאוד הפסד של פונקציה גישות גנטיות. עם זאת, הפרעה במיקוד של גנים של עניין היא כמעט בלתי אפשרית בשל חוסר האינטגרציה גנומי הומולוגית יעילה. ספריית שיבוש insertional אקראית נמצאת בבנייה, בשילוב עם זיהוי המקום שבש, עד כה מניב סט ערוך של 1,935 שיבושים ממופים המייצגים 1,562 גנים 3. עם זאת, גישה זו (צפויה בכלל לייצר מוטציות null) אינה חל על גנים חיוניים. טמפרטורה רגישה (TS) מוטציות ניתן recovereד בגנים חיוניים, ושיטות האחרונות לאפשר זיהוי יעיל של הגן הנבדק ואת הנגע סיבתי. ניתוח פנוטיפי בטמפרטורה גבוהה ולאחר מכן מספק מידע מיידי על הפונקציה של הגן הנבדק. דיווחנו על בידוד ואפיון של מוטציות קטלניות ts ב ~ 70 גנים חיוניים Chlamydomonas, המתמקדת בעיקר על גנים המעורבים התקדמות מחזור התא ולשלוט 1,4. מסכי קטלני Ts להיות עמוד התווך של ניתוח גנטי מיקרואורגניזמים במשך עשרות שנים 5,6. באופן עקרוני, תכונה רצויה היא להתקרב &quot;רוויה&quot;, כלומר כל הגנים המסוגלים מוטציה כדי TS קטלנית מזוהים לפחות מוטציה אחת, המאפשרים ניתוח מלא. עם זאת, בפועל, מספר גורמים להגביל את הגישה לרוויה. ראשית, בעוד שכמעט כל הגנים יכולים להיות מוטציה לאובדן פעילות בטמפרטורה גבוהה, את היעילות של התאוששות של מוטציות כאלה משתנית לאורך לפחותסדר גודל 7,8. לכן, מסך אקראי מתחיל להרים להיטים חוזרים ונשנים &quot;מתניידים&quot; הרבה לפני שמתקרבת רוויה. שנית, בעוד מוטציות TS בדרך כלל לגרום לירידה בתפקוד, יכולים להיות שהם לא nulls נכון בטמפרטורה מגבילה (ולהפך, הם לעתים קרובות לא מתפקדים במלואה בטמפרטורה מתירני). בעיה זו ניתן לטפל במידה מסוימת על ידי השוואת אללים מרובים; אם הם כולם חולקים פנוטיפ משותף, זה יותר עשוי לשקף את התוצאה של איון פשוט של הגן. אללים מרובים הם גם מאוד מועילים עבור זיהוי מולקולרי סופי של נגע סיבתי 1. עם זאת, הבעיה &quot;הנוסע המתמיד&quot; כלומר אללים מרובים בגנים פגעו רק לעתים נדירות יכולים להיות קשים להתאושש. מסיבות אלה, שפתחנו צינור משופר לבודד phenotypically לאפיין מוטנטים ts. אספנו יותר מ -3,000 ts מוטציות עד כה, אניncluding כ -200 מוטציות מחזור חדשות תא המועמד. ניתוח מולקולרי פנוטיפי של האוסף הזה, שכבר כולל מוטציות סבירות ביותר או כל מסלולי התא חיוני, אמור לספק תובנה השערות חדשות בביולוגיה של תא צמח. חשוב לציין, צינור זה יכול להיות מיושם על כל מיקרואורגניזם שגדל על אגרת לבנות קולקציות ts מוטציה ביעילות. הערה על ציוד: שני רובוטים חשובים מאוד עבור יעילות בהליך זה (בורר מושבה בורר שילוב העתק plater / דובדבן). קוטפים בדרך כלל יש סיכות מתכת. מושבות הרים מוחזקות אוויר בפינים אלה במשך תקופה מסוימת (שניות עד דקות, בהתאם לדגם). Chlamydomonas מת כ -20 שניות על סיכת מתכת באוויר. זה מגביל בחירת מודל עבור האורגניזם. בענייני דיוק. בורר המושבה שלנו הוא די מדויק; עם זאת, זה קצת אלים בפעולה שלו ויש לו כמה אפשרות צולבות זיהום מבוסס הספרים. הוא לא נעשה שימוש גבוהאה מצפיפות 384 (4.5 מ&quot;מ ריווח מרכז-מרכז); בצפיפות זה, את הדיוק מקובל לחלוטין. ציפוי ההעתק / דובדבן הרובוט לקטוף (המצורף שונה המשמשים ליישומים אלה) הוא הרבה יותר איטי ב במסיק, אבל הוא מדויק מספיק עבור צפיפות 1,536 (6,144 הוא אתגר, אפילו עבור רובוט מדויק מאוד זה; הערכנו צפיפות זה, אך בחר שלא להשתמש בו בגלל הקשיים השונים). הרובוט לא יעבוד גם אם צלחות נטענות באופן לא אחיד, וכו. חשוב ספוט לבדוק כדי להיות בטוח את הדברים הנכונים קורים; כמובן, הרובוט יפעל ללא השגחה בכלל, כל ילך טוב אם כמה הצלחות הראשונות צדקו.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hudson RapidPick colony picker</td><td>Hudson Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiDrop Combi Reagent Dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small tube metal tip cassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Singer RotoR replica-plating robot</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool</td></tr><tr><td>Singer single-colony picking attachment (&amp;lsquo;Stinger&amp;rsquo;)</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput robotically assisted isolation of temperature-sensitive lethal mutants in chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

אנו מציגים צינור מואץ לבידוד מוטציות ts ב Chlamydomonas. תאים הם ויתרו על צלחות אגרו, וזמן קצר לאחר אימות מהירה תחת מיקרוסקופ עבור צפיפות תא בודד, צלחות הם UV מוקרן (איור 1). מושבות מוקרנות אופייניות מזוהות והרים לתבנית ערוכה לאחר 10 ימים של צמיחה בטמפרטורה מתירנית (איור 2). הצלחות כתוצאה במתכונת 384 ימוזגו על 1,536-מערך (איור 3). בצעדיו הראשונים האלה של איסוף מושבות מוקרנות, יש לנו ערוכים ~ 200,000 מושבות עד כה. הצפיפות של ההשעיה מותאמת מבוסס על מנת UV מתוכנן כך, והיווה מוות, 200 - 600 מושבות ניצול תהווינה על הצלחות. שלוש פעמים חשיפה UV (1.5 דק &#39;, 1 דק&#39;, ו -0.5 דקות) שלוש צפיפויות נבדקו בהתאם (טבלה 1). באופן אמפירי, את זמן החשיפה 1.5 דקות הניבו רוב tsמוטציות (~ 50%) -; עם זאת, ללא ספק, 1 דק &#39;הניב רוב מועמדי מחזור התא. לכן, סיבובי mutagenesis UV בעתיד נעשו עם 1 דקות בלבד. נושא חשוב הוא מתיז במהלך קטיף ראשוני ואת הזיהום הצולב (במיוחד פורמטים בצפיפות גבוהה). הדבר עלול לגרום שכפול phenotyping נוספת של אותה מוטציה פעמיים. כדי למזער את ההסתברות לתרחיש כזה, לטפל לאסוף מושבות בגודל האופטימלי, ולוודא כי מושבות סמוכות אינן נקלטות ב assay הראשוני. לאחר מכן, שני מבחני פנוטיפ ts- רציפים (איור 5) בוצעו, ועל כ -3,000 ts- מוטציות בודדו ואופיינו phenotypically ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות (איור 8). בשל ההתמקדות הביולוגית בלימוד מחזור התא של עניין פנוטיפים שעומדים בקריטריונים מסוימים, אנחנו לא מעוניינים באיסוף יותר משני אללים בכל יעד genדואר. לכן, בצענו השלמה ובדיקת הצמדה עם גנים מאופיינים כבר עם יותר משני אללים (שאילתא) נגד מועמדים שנאספו לאחרונה להסיר גנים חוזרים מאוד מהצנרת במורד הזרם (איור 9). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig1.jpg" /> איור 1: אחיד פריסת תאים Unmutagenized ו- UV mutagenesis. (א) 384 x 2 טיפות μl הם ויתרו על צלחת אגר באמצעות מתקן מגיב. (ב) צלחות אקראיות נבדקות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא צפיפות תא בודד והם UV מוקרן עם חשיפה 1-דקה. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54831 / 54831fig2.jpg&quot; /&gt; מושבות איור 2.-mutagenized UV שנבחרו עבור 384 המערכים. (א) תאים בודדים מוקרן UV גדלים במשך ~ 10 ימים לתוך מושבות גלויות. סרגל קנה מידה = 2 ס&quot;מ. (ב) תכנית ניתוח תמונה מזהה מושבות להפרדה על פי פרמטרים מסוימים ומערכים אותם רובוטים לתוך 384 צלחות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig3.jpg" /> איור 3. איחוד אל-מערך 1,536. ארבע צלחות 384 בפורמט מתמזגות אחד 1,536-צלחת; פעם גדל, הם משוכפלים שוב כדי לבדוק את הפנוטיפ ts-. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig4.jpg" /> איור 4. הדמיה עבור כימות. צלחות (א) מתקיימות בתוך מסגרת תחת דוכן צילום מסמכים, כך שכל הצלחות בסדרה מצולמות בהגדלה ומיצוב זהים. (ב) התמונה הראשונה היא של צלחת microtiter 1536-היטב עם נקודות אדומות להציב בפינות אמצע. זה &quot;רשת-צלחת&quot; תמונה מגדירה את המיקום של המערך. (ג) דוגמה של 1,536-מערך אחרי הדגירה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig5.jpg" /> זיהוי איור 5. הפנוטיפ ts- ידי חציניתוח תמונה -automated. תמונות פלייט מנותחות על ידי תוכנה מותאמת אישית MATLAB (מסופקת SI). התמונה מפולחת באופן אוטומטי למערכי תא (96, 384, או 1,536), ואת האות בכל תא היא לכימות. צמיחה ב 21 ° C מסומן בכחול, וצמיחה על 33 ° C מסומן בצהוב. מושבות מפגינות צמיחה גבוהה באופן משמעותי ב -21 מעלות צלזיוס לעומת 33 ° C (טופלה כדי ts +) נבחרו ויסומן ריבועים שחורים עם נקודה ירוקה. אפשרויות אלה ניתן לערוך באופן ידני. בחירות סופיות מועברות קבצים בשימוש על ידי רובוט קטיף המושבה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig6.jpg" /> קטיף איור 6. רובוטית של המועמדים הקטלנים TS-הסיבוב הראשון. הדובדבן-picking רובוט מציית להוראות מקובץ שנוצר כמתואר בשלב 2.1 לאסוף מועמדים מערך חדש. הפנל העליון מראה את הטעינה של סיכה מעוקרת. הפנל התחתון מראה לקטיף המדויק ממושבה מסוימת בצלחת המקור. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig7.jpg" /> הקרנת זמן לשגות איור 7. למיון ראשוני של פנוטיפים קטלני ts. משובטים שעברו שני סבבים של פרוטוקול ההקרנה באיור 5 משוכפלי צלחות בצפיפות תא כזה תאים בודדים ניתן לפתור מיקרוסקופי. מיקרוסקופ לנתיחה הטטרדה שונה משמש לזיהוי תפקידים אשר photomicrographs נלקחים לאחר 0 hr, 10 שעות, ו -20 incubations hr<html> t 33 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig8.jpg" /> איור 8: מוטציות מחזור התא Chlamydomonas שזוהו על ידי זמן לשגות מיקרוסקופ. (א) האיור של מחזור התא הייחודי Chlamydomonas מתאר את שלב G1 הארוך מאופיין בצמיחה הסלולר, ואחריו מחזורי SM ביקוע, אשר בסופו של דבר עם הבקיעה של לתאי בת שזה עתה נולד. (ב) תמונות מיקרוסקופיות להפגין תאי WT במהלך מחזור התא ואת זיהוי של מוטציות מחזור התא טיפוסיות שאינו מצליחות להשלים מיטוזה. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> אף אוזן גרון &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig9.jpg" /> איור 9: השלמה והצמדה מבחן. (א) עמיד לאנטיביוטיקה (למשל, hygro) שאילתא עם מוטציה גנטית חוזר נחצתה בצלחת 96-היטב עם סט של מוטציות של סוג ההזדווגות מול מטפחי קלטת עמידות לאנטיביוטיקה שנייה (למשל, Paro). צלחות שלמות להניב שיעור גבוה של diploids כפי שמוצג על ידי מכתים חומצות גרעין וניתוח cytometry זרימה (פנל שמאלי תחתון א). (ב) תערובת ההזדווגות נבחנת הן שלם ב diploids ועבור הצמדת צאצאי meiotic כפולים עמידים. הביקורת החיובית היא השאילתה עצמה בסוג הזדווגות ההפוך, כצפוי, מראה את הפנוטיפ ts- על 33 ° C, ואילו הביקורת השלילית היא WT ומראה את הפנוטיפ TS +. המושבות הקיפו מראים שלמים עם השאילתה ולכן nאללים ts- EW עבור גן השאילתה. אלו אינם נכללים בדרך כלל אפיון נוסף, שכן רק &quot;מתניידים&quot; נמצא בערכת הבדיקה השלמה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זְמַן </td><td> OD </td><td> מושבות הרים (#) </td><td> פנוטיפ Ts- </td><td> מועמדי מחזור התא </td></tr><tr><td> 1.5 &quot; </td><td> 0.012 </td><td> 6000 (ממוצע = ~ 200) </td><td> 200 (3.3%) </td><td> 7 (3.5%) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 &#39; </td><td rowspan="2"> 0.003 </td><td> 11,000 </td><td rowspan="2"> 131 (1.19%) </td><td rowspan="2"> 15 (11.4%) </td></tr><tr><td> (ממוצע = ~ 360) </td></tr><tr> &lt;td rowspan = &quot;2&quot;&gt; 0.5 &#39; </td><td rowspan="2"> 6E-04 </td><td> 9000 </td><td rowspan="2"> 40 (0.45%) </td><td rowspan="2"> 1 (2.5%) </td></tr><tr><td> (ממוצע = ~ 300) </td></tr></tbody></table> טבלה 1: כיול טיימס הקרנה כדי למקסם את התשואה של מועמדים Mutant מחזור התא. שלוש פעמי הקרנה נבדקו (30 צלחות כל אחת) עם מקביל מכנסי הש&quot;כ כדי להבטיח מספרי מושבה לשרוד (200 - 600).

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

בידוד רובוטית עם תפוקה גבוהה של מוטנטים קטלניים רגישים לטמפרטורה ב- Chlamydomonas reinhardtii | גנטיקה | וִידֵאוֹ

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

high-throughput-robotically-assisted-isolation-temperature-sensitive

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  The Rockefeller University. Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput. 

Video: High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Immunology and Infection

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

שיטת הפקת מולטי-Omics לניתוח מעמיק של תרבויות מסונכרנות של הירוק Alga Chlamydomonas הקשה

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Developmental Biology

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

שילוב גנים יציב בכלורלה וולגריס באמצעות Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit the capacity for gene transfer to a diverse array of species. Numerous microalgae species lack well-established methods for reliably integrating genes of interest into their nuclear genome. To harness the potential benefits of microalgal biotechnology, simple and efficient genome manipulation tools are crucial. Herein, an optimized AMT protocol is presented for the industrial microalgae species Chlorella vulgaris, utilizing the reporter green fluorescent protein (mGFP5) and the antibiotic resistance marker for Hygromycin B. Mutants are selected through plating on Tris-Acetate-Phosphate (TAP) media containing Hygromycin B and cefotaxime. Expression of mGFP5 is quantified via fluorescence after over ten generations of subculturing, indicating the stable transformation of the T-DNA cassette. This protocol allows for the reliable generation of multiple transgenic C. vulgaris colonies in under two weeks, employing the commercially available pCAMBIA1302 plant expression vector.

Author Spotlight: פרוטוקול טרנספורמציה ממוטב עבור Chlorella vulgaris באמצעות Agrobacterium tumefaciens 

This protocol outlines the utilization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) for integrating gene(s) of interest into the nuclear genome of the green microalgae Chlorella vulgaris, leading to the production of stable transformants.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

גישות גנטיות בקדימה

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

שיטת הפקת מולטי-Omics לניתוח מעמיק של תרבויות מסונכרנות של הירוק Alga Chlamydomonas הקשה

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris