This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&amp;D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health &amp; Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary's Hospital, The Catholic University of Korea.

פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC16EAME0162) ובצע בהתאם להנחיות NIH. כל הרקמות התקבלו עם הסכמה מדעת בכתב. 1. טוען Gravity צנטריפוגלי ו גלולה תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות קציר ניידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASCs תרבות (P2-P3; לראות רשימה של חומרים) ברמת הגלוקוז הבינוני-הנמוך של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM-LG) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מגיעים 80 מפגש%, לבטל את בינוני לשטוף את התאים עם 5 מ&quot;ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט 1x (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של המכיל 1 PBS mM EDTA דגירה במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על צלחת תרבות בעדינות, להוסיף 4 מ&quot;ל של מדיום חדש, ולהעביר את התאיםצינור חרוטי 15 מ&quot;ל, ו צנטריפוגות התאים ב g 250 × 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינה הכביד צנטריפוגלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה (שלב 1.1.4), להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל של DMEM-LG עם 10% FBS. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעינת CG, להעביר 2.5 × 10 5 תאים לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטים חדשים g 2,400 × במשך 15 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות הגלולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μL של מדיום בידול chondrogenic מוגדר (CDM, גבוהה גלוקוז DMEM בתוספת 1% FBS, 1% Premix + ITS, 100 dexamethasone ננומטר, 1x MEM שאינם חיוניים פתרון חומצה אמינו, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​L-פרולין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין). הוסף 50 מיקרוגרם / מיליליטר של פוספט 2 המוכן טרי L-החומצה אסקורבית בכל החלפה בינונית. כביקורת חיובית, לגרום differentiati chondrogenicעל בתאים uncentrifuged ידי הוספת CDM המכיל 10 ng / mL TGF-β1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צינורות כתרים רופפים המכילים את הכדורים בעמידה לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום פעם ביומיים למשך 3 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Micromass <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר צנטריפוגה (שלב 1.2.2; 2,400 גרם × במשך 15 דקות), לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 μL של CDM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור micromass, למקם את התאים resuspended במרכז באר צלחת 24 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, בזהירות להוסיף 1 מ&quot;ל של CDM אל הבאר, pipetting אל הקיר של הצלחת כדי למנוע שיבוש micromass. כביקורת חיובית, לבצע תרבות micromass עם תאים uncentrifuged ידי הוספת CDM המכיל 10 ng / mL TGF-β1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה micromass על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 2 5% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את ev הבינוניery ימים למשך 3 שבועות. </li></ol></li></ol> 2. תגובת שרשרת הפוך transcriptase-פולימראז (RT-PCR) כדי לאתר upregulation תעתיק של סמנים בידול Chondrogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 14, השתמש פיפטה להעביר את כדורי אליפטית לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולשטוף אותם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את RNA הכולל את הכדורים בשיטת חילוץ פנול, כלורופורם thiocyanate guanidinium 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז cDNA מ 2 מיקרוגרם של רנ&quot;א סך באמצעות transcriptase הפוכה על פי הפרוטוקול של היצרן (לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן לנטרל את האנזים ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע PCR עם פריימרים ספציפיים עבור סמני בידול chondrogenic 10. </li></ol> 3. מכתים לזהות את התבטאות יתר של חלבונים מרקר בידול Chondrogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרפין הטבעת כדורי תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 21,להשתמש פיפטה לקצור את כדורי אליפטית ולשטוף אותם עם PBS 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את כדורי אליפטית על ידי טבילה paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות. זהירות: Paraformaldehyde היא רעילה ביותר. יש להימנע ממגע עם עיניים, עור, או ריריות. מזעור החשיפה ולהימנע משאיפת במהלך ההכנה. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מקבע ולשטוף את כדורי תא עם מים ללא יונים (DW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שכבה אחת של גזה על הקלטת ולהעביר את הכדורים הקבועים בעזרת פיפטה. מכסה את הכדור על ידי קיפול הגזה ולסגור את מכסת הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הכדורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הכדורים ב 70% אתנול (EtOH) במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הכדורים ב 80% EtOH במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הכדורים ב 95% EtOH במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הכדורים ב 100% EtOH במשך 5 דקות ב RT. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את כדורי קסילן 100% במשך 15 דקות ב RT. טווי חזורלִספִירַת הַנוֹצרִים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמע את כדורי תא הקבועים פרפין ב 56 מעלות צלזיוס בתוך תבנית; ניתן להטביע את הכדורים לתוך פרפין באמצעות מערכות עיבוד רקמות מיוחדות אוטומטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 5 חלקים מיקרומטר בעובי מן התא גלולה מוטבע פרפין באמצעות microtome סיבובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Float את הסעיפים 50% EtOH ולאחר מכן להעביר אותם באמבט מים 50 ° C באמצעות שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הסעיפים צף על גבי שקופיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Safranin O ו כתמים כחולים Alcian <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם חלקי פרפין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות קסילן במשך 15 דקות. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות EtOH 100% במשך 5 דקות. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות 90% EtOH למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות EtOH 80% במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות EtOH 70% במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם 1x PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם בסעיפי rehydrated עם 1% Safranin O פתרון ו -3% הכחולים Alcian עבור30 דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את החלקים עם DW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם בסעיפים עם פתרון Hematoxylin / Eosin (counterstain) 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את החלקים עם DW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של המדיום גובר על coverslip לאחר הסרת כל שאריות מים. בזהירות במקום להחליק (תא בצד למטה) על coverslip המכיל את המדיום גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות להתייבש במשך 2-3 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מיקרוסקופ זקוף אוטומטי, 50X ו 200X). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם סעיפים כמפורט בסעיף 3.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את שקופיות חיץ נתרן ציטרט (נתרן ציטרט 10 מ&quot;מימ, 0.05% Tween 20, pH 6.0), ולאחר מכן לשמור אותם בטמפרטורה רותחת משנה עבור 10 דקות באמצעות מיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את השקופיות עבור 20 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף אותם עם מי ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת השקופיות ב 3%H 2 O 2 (ב 1x PBS) במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מי ברז במשך 15 דקות 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את השקופיות עם חסימת חיץ (10% נסיוב עז נורמלי ב PBS) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון החוסם, ולאחר מכן להחיל נוגדן ראשוני מדולל 5% נסיוב עז נורמלי על השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שקופיות הלילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות ב נוגדנים משני מצומדות fluorochrome מדולל 5% נסיוב עז נורמלי במשך שעה 1 ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות עם DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים ב 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של המדיום גובר על coverslip לאחר הסרת כל שאריות מים. בזהירות במקום להחליק (תא בצד למטה) על הרכבה בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות להתייבש במשך 2-3h בחושך ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Rhod: 594 ננומטר, DAPI: 340 ננומטר; 60X והגדלה 200X) 12. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+transforming+growth+factor+beta1+and+dexamethasone+on+the+growth+and+chondrogenic+differentiation+of+adipose-derived+stromal+cells.">Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).</li><li>Erickson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+adipose+tissue-derived+stromal+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo.</a> Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).</li><li>Sah, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+response+of+cartilage+explants+to+dynamic+compression.">Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression.</a> J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).</li><li>Sakao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chondrogenic+phenotype+in+synovium-derived+progenitor+cells+by+intermittent+hydrostatic+pressure.">Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).</li><li>Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenesis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-polyurethane+composites+is+modulated+by+frequency+and+amplitude+of+dynamic+compression+and+shear+stress.">Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress.</a> Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).</li><li>Alves da Silva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor.">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).</li><li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+microstructure+and+gene+expression+of+articular+chondrocytes+cultured+in+a+tube+under+mechanical+stress.">Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress.</a> Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).</li><li>Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+of+human+lung+epithelial+carcinoma+a549+cells+up-regulates+interleukin-1beta+gene+expression.">Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+using+TRIzol+(TRI+reagent).">Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UVB+induces+HIF-1alpha-dependent+TSLP+expression+via+the+JNK+and+ERK+pathways.">UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways.</a> J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).</li><li>Wu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+human+telomerase+reverse-transcriptase+(hTERT)+re-appraised:+nucleolin+and+telomerase+cross+paths.">Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths.</a> J Cell Sci. 119, 2797-2806 (2006).</li><li>Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+chondrogenic+phenotype+in+culture.">Regulation of the chondrogenic phenotype in culture.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).</li><li>Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox9+has+essential+roles+in+successive+steps+of+the+chondrocyte+differentiation+pathway+and+is+required+for+expression+of+Sox5+and+Sox6.">The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6.</a> Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).</li><li>Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+is+a+potent+activator+of+the+chondrocyte-specific+enhancer+of+the+pro+alpha1(II)+collagen+gene.">SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene.</a> Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+for+clinical+application+to+cartilage+regeneration.">Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds.">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li><li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a.">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li><li>Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+mesenchymal+progenitors+from+human+bone+marrow+differentiate+in+vitro+according+to+a+hierarchical+model.">Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.</a> J Cell Sci. 113, 1161-1166 (2000).</li></ol>

We declare that we have no conflicts of interest associated with this work.

מדינת stemness של תאים חשובה מאוד עבור ביטוי יתר נגרמת CG של SOX9. במחקר שלנו, ביטוי SOX9 יכול להיגרם על ידי CG ב ASCs מוקדם-חלוף (2-3), אך לא ASCs-מעבר מאוחר יותר. זה כבר דווח כי, במהלך טיפוח, ASCs מכיל CD34 + תאים עד 3 קטעים 16. ASCs נוטה לאבד את הביטוי של CD34 כמו התאים passaged, וכתוצאה מכ?...

פגמי סחוס במפרק לא לרפא באופן טבעי. כתוצאה מכך, השתלת תא גזע הוצעה גישה מבטיחה לתיקון סחוס לקוי. עם זאת, שיטה זו דורשת היא רכישת מספר מספיק של תאי גזע ואת האינדוקציה של תאים אלה כדי לעבור התמיינות chondrogenic. מח עצם (בע&quot;מ) כבר בשימוש נרחב כמקור לתאי גזע, אבל בידוד תא מ- BM יש שני חסרונות עיקריים: הפולשנות ואת התשואה מספיק. בגלל הקלות של רכישתה, רקמת שומן היא מקור עדיף של תאי גזע. מחקרים קודמים הדגימו את ההיתכנות של בידוד תאי גזע מרקמות שומן התרמת בידול chondrogenic בתאים אלה באמצעות ציטוקינים, כגון TGF-β1 1, 2. שיטות אלו יעילות אבל יקרות. כחלופה עלות נמוכה יותר כדי ציטוקינים, לחץ מכני יכול לשמשלהשרות התמיינות chondrogenic. העמסה מכאנית משחקת תפקיד קריטי בשמירה על הבריאות של סחוס במפרק 3, וזה יכול לגרום פנוטיפים chondrogenic בתאים שונים. לדוגמא, לחץ ההידרוסטטי גורם פנוטיפים chondrogenic ב ובתאים נגזרים synovium דרך מסלול קינאז / JNK MAP 4, ודחיסה מכאנית גורם chondrogenesis בתאי גזע mesenchymal אדם (MSCs) על ידי upregulating גני chondrocytic 5. בנוסף, מאמץ הגזירה תורם הביטוי של מטריקס הקשורות chondrogenesis (ECM) ב MSCs אדם 6. הכביד צנטריפוגלי (CG), מתח מכאני שיושם לשלוט בקלות שנוצר על ידי צנטריפוגה, יכול לגרום ביטוי גני הפרש בתאי 7. לדוגמה, בתאי קרצינומה אפיתל ריאות, הביטוי של אינטרלוקין (IL) -1b הוא upregulated ידי צנטריפוגה 8. Therefore, כמו לחץ מכאני מושרה באופן ניסיוני, CG יכול לשמש כדי לגרום ביטוי גני chondrocytic בתאי גזע. עם זאת, עדיין לא ברור האם CG יכול לגרום בידול chondrogenic של תאי גזע. במחקר זה, מצאנו כי CG המושרה הגברת הביטוי של SOX9, רגולטור אדון chondrogenesis, ב ASCs האדם, וכתוצאה מכך ביטוי יתר של גנים chondrocytic. בנוסף, השווינו את ההשפעות של CG על chondrogenesis לאלה של β1 TGF, גורם הגדילה הנפוץ ביותר כדי לגרום במבחנה chondrogenesis בתאי גזע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Cornical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Cornical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>7551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASC Culture Media Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Low glucose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11885-084</td>
			<td>growth base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/1 mM EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondrogenic Differentiation Media Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995</td>
			<td>chondrogenic differentiation base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>100nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P4333</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>50ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5607</td>
			<td>50ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS</td>
			<td>BD</td>
			<td>354352</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF&#946;1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>10ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Cover Glass</td>
			<td>Superior</td>
			<td>HSU-0111580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldyhyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BIOSESANG</td>
			<td>T1027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SP-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen II antibody</td>
			<td>abcam&#160;</td>
			<td>ab34712</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, 
			&#160;Alexa Fluor 594 conjugate&#160;</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>&#160;A-11037</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass, Coated</td>
			<td>Hyun Il Lab-Mate</td>
			<td>HMA-S9914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>366919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprypylalcohol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>K1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Taq DNA Polymerase</td>
			<td>iNtRON BIOTECH</td>
			<td>25021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15581-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading star</td>
			<td>Dyne Bio</td>
			<td>A750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb (+) DNA ladder marker</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>DM003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose-derived stem cells (ASCs)</td>
			<td>&#160;Catholic MASTER Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chondrogenic differentiation induction of adipose-derived stem cells by centrifugal gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 &#215; g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

הכביד צנטריפוגלי ומשרה את ביטוי היתר של סמני בידול chondrogenic בתאי גזע שמקורם שומן. כדי לקבוע את מידת כוח הכבידה צנטריפוגלי שרלוונטי להשרות התמיינות chondrogenic, ASCs היו מגורה עם דרגות שונות של CG (0, 300, 600,...

Watch this Scientific Journal Video about Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity at JoVE.com

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

chondrogenic-differentiation-induction-adipose-derived-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Views.  The Catholic University of Korea. Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Video: Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...