אנו מודים מתייאשים Fendrych לקריאה / צפייה ביקורתית סטפן Stadlbauer עבור ציוד אודיו. הודות חנות Miba המכונית ב IST אוסטריה עבור תרומתם OpenSPIM. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מתוכנית אנשים (Actions מארי קירי) של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7 / 2007-2013) תחת הסכם מענק REA n ° [291,734] מועצת המחקר האירופית (ERC פרויקט-2011 -StG-20101109-PSDP).

1. Culturing ארבידופסיס לפני הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני MS ½ (חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני) על ידי הוספת סוכרוז 2.15 גרם MS-בינוני, 10 גרם, 0.97 MES g (2- (-morpholino N) חומצה ethanesulfonic) ו -1 L DDH 2 O (מים מזוקקים פעמיים ) לתוך בקבוק L 1. התאם את ה- pH ל -5.8 באמצעות KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 גר &#39;/ ל gellan מסטיק עד בינוני ½ MS ו חיטוי אותו במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 30 מ&quot;ל של מדיום חם לתוך צלחות פטרי רבועים (245 x 245 x 25 מ&quot;מ) כדי ליצור שכבה של ג&#39;ל עם עובי של כ -2 מ&quot;מ. תנו מנות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי לאפשר את המדיום כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים זרעים ארבידופסיס מעוקרים לתוך צינור 1.5 תגובה מ&quot;ל המכילה 1 מ&quot;ל סטרילי H 2 O. תרימי את הזרעים באמצעות pipet זכוכית או טיפ 1,000 μL pipet ולזרוע אותם על פני השטח של ג&#39;ל. מניחים את הזרעים בנפרד כ -10 מ&quot;מ זה מזה. חותם את הצלחת עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת למשך 24 שעות ב 4מעלות צלזיוס (ריבוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפחו את הצלחת חממה לצמיחה, למשל ב 22 ° C במחזור 16/8 שעות יום / לילה עם 120-140 μmol / m² / s כמות האור במשך 6 ימים. עד 10 ימים צמחים ישנים יכולים לשמש. </li></ol> 2. לדוגמא צמח הכנה שיטה הערה: בעל המדגם ניתן להדפיס או 3D או בעבודת יד בבית מלאכת מכונית באמצעות הממדים מתוארים באיור 2C. קובץ מודל 3D מסופק ההשלמות (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). ראה את הקישור להזמנה את אותיות 3D ברשימת החומר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 גרם נמוכה להמיס agarose לתוך בקבוק 50 מ&quot;ל המכיל 50 מ&quot;ל בינוני ½ MS ו החיטוי אותו במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הפתרון agarose 1% נמוך להמיס צינורות 1.5 תגובה מ&quot;ל. חנות ב 4 ° C (ניתן להשתמש במשך חודשיים לפחות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים aliquot של 1 %% agarose נמוכה להמיס ב 80 ° C ולתת לו להתקרר עד33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את בעל המדגם ביחידת אולטרסאונד. לעקר בעל המדגם עם 70% אתנול ולשטוף עם מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את ג&#39;ל סביב הצמח באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הבלוק עם מרית שטוחה וחלק אותו בזהירות על בעל המדגם בעזרת מרית שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את הג&#39;ל על בעל מדגם עם 1% agarose (ב 33 ° C) בעזרת פיפטה 100 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את הצמח על הג&#39;ל עם agarose 1% בעזרת פיפטה 10 μL. שימוש במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא כי העלים אינם מכוסים עם ג&#39;ל. אין להציב את הג&#39;ל ישירות על האזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את המפעל מהתייבשות, לעבוד באין מפריע. הכנס את בעל מדגם לתוך טיפ 1,000 μL pipet בכל הזדמנות אפשרית. השתמש טיפ pipet כמו כובע והחלק אותו בזהירות מעל קצה אחד של בעל מדגם שבו ממוקם המפעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את בעל מדגם בקופסה קצה פיפטה ולהכין צמחים יותר במידת הצורך. צמחים יכולים להיות directly צלם או להחזיר בחממת הצמיחה. </li></ol> 3. הגדרת מיקרוסקופ הערה: מערכת התאורה LED היא מנורה שהותקנה. הפרטים הטכניים הנדרשים כדי לבנות את טבעת LED ניתן למצוא באיור 3 ורשימת החומר. ראה את קובץ ההשלמות (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) ה- board design. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג או דבק (סרט דו צדדי למשל) טבעת LED בצד התחתון של הזרוע OpenSPIM x / y / z / θ שלבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את טבעת LED עם ספק כוח מתכוונן (0-30 V, מקסימום 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המתח לעוצמת האור הרצוי (עבור ארבידופסיס, 120-140 μmol / m 2 / s, איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את התא המדגם עם 70% אתנול ולשטוף עם מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את העדשה האובייקטיבית עם רקמת ניקוי בנזין עדשה. לעקר את העדשה האובייקטיבית עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את perfusiעל צינורות לתא המדגם בהסדר חד סטרי. שים בקבוק 1 ליטר המכיל בינוני טרי ½ MS ועוד בקבוק ריק ליד משאבת זלוף peristaltic. חבר את הבקבוק עם מדיום כשהמפרצון התחתון של תא המדגם באמצעות צינור זלוף אחד. חבר היציאה העליונה של החדר המדגם עם הבקבוק הריק לאשפת המדיום בשימוש באמצעות צינור אחר זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את המהירות של זרימת 1 מ&quot;ל / דקה. הערה: כדי לא להישפך קאמרי המדגם, חשוב שיהיה יצוא גבוה יותר היבוא. כך או להגביר את קצב השאיבה או להשתמש בצינור בקוטר פנימי גדול עבור היצוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי ניילון נצמד שחורה לריבועים קטנים 3 מ&quot;מ, לשטוף עם אתנול 70% ולתת להם להתייבש לפני הצבת בתא מדגם על פני המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קצה pipet מבעל המדגם וכנס בעל המדגם בתא המדגם. אם בעל מדגם מיוצרים החדש לא נכנס זרוע הבמה, להשתמש חול דקנייר כדי לעשות את זה מדלל או להשתמש O-Ring (∅ 6 מ&quot;מ) במקרה זה הוא רזה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את המכסים, לחתוך את נייר האלומיניום השחור לשתי 50 x 25 חתיכות מ&quot;מ. כן 5 מ&quot;מ לחתוך באמצע צד אחד של כל חתיכה. מקפלים ליצור הזחה משולש (איור 1D). סגור את התא המדגם עם שני המכסים על ידי לשים את המכסים על גבי התא המדגם עם החריצים המשולשים מול בעל המדגם. ודא כי עלי הצמח הם לא בצל של העפעפיים ולקבל אור ממערכת התאורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את האזור של עניין באמצעות x / y / z וסיבוב הבמה למקם שורש לרוחב המתעוררים שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההקלטה, לאפשר למערכת לאזן במשך לפחות 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת רכישת התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר ערימה של 217 תמונות עם 3 מיקרומטר z-מרווח (650 מיקרומטר) ולהגדיר את הזמן לשגות עם מרווח הדמיה 15 דקות לתקופה כוללת של 17 שעות. הערה: תיעוד מפורט עלכיצד להפעיל את תוכנת OpenSPIM ניתן למצוא באתר (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחלת ההקלטה. </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G., Guo, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science.">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., Moore, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).</li><li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+Zebrafish+Early+Embryonic+Development+by+Scanned+Light+Sheet+Microscopy.">Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy.">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li><li>H&#246;ckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Embryogenesis:+A+Perspective+for+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology.">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li><li>Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+live+imaging+of+plant+growth+in+near+physiological+bright+conditions+using+light+sheet+fluorescence+microscopy.">High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy.</a> Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).</li><li>Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Dynamics+in+Root+Cells+of+Arabidopsis+thaliana+Visualized+with+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy.</a> PLoS ONE. 8 (10), (2013).</li><li>&#352;amajov&#225;, O., Tak&#225;&#269;, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+methods+and+techniques+to+study+endocytosis+in+plants.">Update on methods and techniques to study endocytosis in plants.</a> Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).</li><li>Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin+transport+mechanism+restricts+positive+orthogravitropism+in+lateral+roots.">An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots.</a> Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).</li><li>Lucas, M., Kenobi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+root+morphogenesis+is+dependent+on+the+mechanical+properties+of+the+overlaying+tissues.">Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).</li><li>Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spatial+Accommodation+by+Neighboring+Cells+Is+Required+for+Organ+Initiation+in+Arabidopsis.">A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis.</a> Science. 343 (6167), 178-183 (2014).</li><li>Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Arabidopsis+Development.">Live Imaging of Arabidopsis Development.</a> Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).</li><li>Berson, T., von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Golgi+network+localized+small+GTPase+RabA1d+is+involved+in+cell+plate+formation+and+oscillatory+root+hair+growth.">Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).</li><li>Langhans, M., Meckel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+detection+and+tracking+in+plants.">Single-molecule detection and tracking in plants.</a> Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).</li><li>Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+nuclear+localization+and+quantification+of+GFP-tagged+EB1c+in+Arabidopsis+root+using+light-sheet+microscopy.">Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy.</a> Front Plant Sci. 6, (2015).</li><li>Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+and+Self-Organizing+Properties+of+Post-embryonic+Plant+Organ+Cell+Division+Patterns.">Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns.</a> Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).</li><li>Berthet, B., Maizel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+and+live+imaging+of+plants.">Light sheet microscopy and live imaging of plants.</a> J Microsc. , (2016).</li><li>Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSPIM:+an+open-access+light-sheet+microscopy+platform.">OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li><li>de Luis Balaguer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-sample+Arabidopsis+Growth+and+Imaging+Chamber+(MAGIC)+for+long+term+imaging+in+the+ZEISS+Lightsheet+Z.1.">Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1.</a> Dev Biol. 419 (1), (2016).</li><li>Ove&#269;ka, M., Va&#353;kebov&#225;, L., Komis, G., Luptov&#269;iak, I., Smertenko, A., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plants+for+developmental+and+cellular+imaging+by+light-sheet+microscopy.">Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).</li><li>Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Balu&#353;ka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumination+of+Arabidopsis+roots+induces+immediate+burst+of+ROS+production.">Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production.</a> Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).</li><li>Silva-Navas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Root:+a+system+for+cultivating+plants+with+the+roots+in+darkness+or+under+different+light+conditions.">D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions.</a> Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Brand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+and+reliable+two-component+system+for+tissue-specific+gene+induction+in+Arabidopsis.">A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

יש גיליון אור פלואורסצנטי מיקרוסקופיה היתרון הגדול לשלב phototoxicity נמוך ומהירות רכישה מהירה, אשר ניתן להשתמש בם כדי ללכוד כמויות גדולות עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה תוך שמירה על המדגם במצב פיסיולוגי. הרזולוציה של מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להשוות לזה של מיקרוסקופ confocal 9. עם זאת, פיזור אור וקליטה מתרחשים לאורך שביל העירור ופליטה בנפרד ואת איכות התמונה הכוללת יכולה להיות נמוכה משמעותי בתוך רקמות אטומות לעומת פני השטח. כדי לעקוף סיבוך זה ניתן להשתמש את האפשרות לסובב את המדגם לאורך הציר האנכי ולבחון את הנפח זהה מכיוונים שונים. אבל זה לא תמיד יתרון, שורשים לרוחב למשל לצאת בצד אחד של השורש וההדמיה מאחור תוצאות איכות תמונה נמוכה מבלי להשיג מידע נוסף. עם זאת, הסיבוב יכול לשמש בעיקר כדי למקם את sample על הצד הטוב. ההסדר האופקי הקלסי של העדשות האובייקטיביות מאפשר דרכים חדשות של הרכבה מדגמת. צמחים ליהנות במצב אנכי. מוצג כאן, &quot;על פני השטח של הג&#39;ל&quot; שיטת הרכבה יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטות הרכבה אחרות כגון הטבעת השורש הפנימית של ג&#39;ל 24,25. 1) מערכת השורש נמצאת בקשר ישיר עם במדיום הנוזלי. תא המדגם מחובר למערכת זלוף אשר מספקת מדיום חדש ברציפות. זה יכול לשמש גם כדי להחליף את כל הנפח במהירות של החדר מדגם ליישם מדיה או תרופות שונות. 2) לפני לטעום צמחים כנים לגדול כפי שהם משמשים לגידול במעבדות. צמחים יכולים לבחור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ורק הצמחים הרצויים צריכים להיות מוכנים. 3) המפעל מועבר מצלחת פטרי לבעל המדגם בלי שנוגעים בו. ובכך הצמח יכול לפתח עוד יותר על ג&#39;ל אותו הוא הלך וגדל על ב incubato הצמיחהr לחץ מכאני מצטמצמים למינימום. 4) ההשקפה על הדגימה אינה חסומה ו סטיות אופטיות הן מזעריות כי החלל בין המדגם לבין מטרת זיהוי מלא אך ורק עם מדיום ולא חומרים אחרים עם מדדי שבירה שונים. על מנת לבצע הדמיה לטווח ארוך, מערכת תאורה צמח יש צורך להבטיח פעילות הפוטוסינתזה של הצמח. ברוב המעבדות הצמחים גדלים על ג&#39;ל שקוף, כלומר השורשים נחשפים לאור. דבר זה עלול לגרום לתגובות שונות לסביבת העבודה גורם לשינויים ביוכימיה והתפתחותם 26,27. על מנת להקטין את כמות האור על מערכת השורשים, רדיד פלסטיק שחור שימש לכיסוי פני המים כמו גם מכסה מנייר אלומיניום שחור כיסה את תא המדגם. אור יכול להגיע עלי הצמח דרך החור המרכזי במכסה. במצב זה, אין עלייה קלה ברקע נצפתה, רומזתg כי כמות האור התועה מן הנוריות האדומות וכחולות הופחתה באופן משמעותי על ידי מסנן GFP וגישות ההצללה. זה אפשר לשמור את האור דולק במהלך רכישת תמונה מבלי להגדיל את רעשי רקע מצלמה. בעל המדגם נועד להדפסת 3D. עם זאת, הבחירה של חומר חיונית כמו כמה פלסטיק שנבדקו היה לא 100% יציבים, וכתוצאה מכך סחיפה של המדגם. לכן, מומלץ להשתמש שרפים במקום או לבנות בעל מדגם ידי כרסום מוט פוליאתילן (PEP). בעת שימוש התקנת מיקרוסקופ גיליון אור עם מערכת תאורה דו צדדית בעל המדגם עלול להפריע אחד מדפי האור בהתאם לזווית הסיבוב. כדי להפחית את הלחץ המכני במהלך גורף את הצמח מהצלחת, להשתמש זווית שטוחה של מרית. הצמח יכול במהירות להתייבש וזרימת אוויר ניסיון בפעם הראשונה. נסה להימנע מכל טיוטת אוויר (תנועות מהירות, זרימת אוויר-תנאים), ווRK באין מפריע וחלק בעל מדגם לתוך טיפ 1,000 μL pipet בכל הזדמנות אפשרית. בתוך מיקרוסקופ, חשוב לא לטבול את הצמח כולו בנוזל ולשמור על עלים יבשים. הטכניקה היא אידיאלית עבור הדמיה בשלבים מוקדמים של היווצרות שורש לרוחב. בעת ביצוע הדמיה לטווח ארוך של טיפים שורש בוגר אחד חייב לזכור כי השורשים ארבידופסיס לגדול עם 100-300 מיקרומטר / h במהירות מחוץ לשדה הראייה. יישום עתידי מאוד שימושי יכול להיות אלגוריתם מעקב אוטומטי, אשר יאפשר צמיחת קצה השורש הבא על פני פרק הזמן ממושך. היכולת לשלוט בתנאים סביבתיים כגון אור והרכב תזונתי של המדיום במהלך תהליך הרכישה מאפשרת חוקרת כיצד צמחים להסתגל לשינויים. שורש נמצא בקשר ישיר עם במדיום נוזלי, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליישם תרופות להפעיל ביטוי גנים כימית, למשל באמצעות dexamethasone מושרה 28 או β-ESTRadiol מערכת מושרה 29. עם זאת, זה לוקח זמן להחליף את כל נפח תא המדגם לשטוף את תרופה. ההתקנה עשויה להשתפר באמצעות מזעור ההיקף הקאמרי מדגם להאיץ חילופי בינוני. עם זאת, טכניקה זו יש פוטנציאל גדול. השילוב של הליך הרכבה, תנאי גידול סטנדרטיים רכישת התמונה העדינה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון מאפשר מחקרים ארוך טווח של התפתחות צמח עם רזולוציה גבוהה ברמה פיזיולוגית. זה יעזור לחוקרים לחקור מנגנונים בסיסיים של התפתחות צמח.

אחת משאלות המפתח בהתפתחות צמח הבנה הוא כיצד תאים בודדים להתנהג במהלך התמיינות וצמיחת איברים. באופן אידיאלי, אירועים הסלולר, כמו דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון תאי, ניתן לראות את האור של הקשר רחב של הרקמה. מטרה זו מציבה אתגרים טכניים ודורשת התבוננות איבר שלמה עם מרחבית גבוהה וכן פתרון זמני על פרק הזמן ממושך, אשר עשוי לגרום לתופעות צילום רעילים. מאז צמחים להסתגל במהירות לשינויים סביבתיים, תנאי הגידול חייבים להיות תחת פיקוח הדוק. כדי לעשות הדמיה לטווח ארוך מבלי להפריע את המצב הפיזיולוגי של הצמח, שלושה דברים צריכים להיות מובטחים, 1) תנאי גידול בתא המדגם, 2) מדגם יציב גובר על פני תקופות זמן ארוכות, ו 3) ההדמיה עם לעוצמות אור נמוכות כדי למנוע מצבים צילום נזק הלא פיזיולוגי. conditi גדל פיסיולוגיons בתא מיקרוסקופ הדגימה הם קריטיים עבור ניסויים לטווח ארוך. ישנם מספר של פרוטוקולים זמינים המתארות תאי גידול הדמיה עבור מיקרוסקופי confocal 1 - 3. עם זאת, מיקרוסקופיה confocal מציגה-עוצמת אור גבוהה למפעל, אשר יכול לגרום לתגובות של מצוקה נפשית ובדרך כלל מעכבת את הצמיחה 4. בנוסף, רוב המיקרוסקופים קונבנציונליים לאפשר מיקום אופקי בלבד של המדגם, אשר אינו אופטימלי עבור צמחים מאז הם מנסים לכוון את עצמם ולגדול לקראת וקטור כובד. במהלך עשר השנים האחרונות, מיקרוסקופ אור הגיליון התפתחה ככלי רב עצמה כדי ללכוד את הפיתוח של דגימות גדולות ברזולוציה הסלולר לפרקי זמן של עד כמה ימים 5 - 9. במיקרוסקופ אור הגיליון מאפשרת מיצוב הדגימה אנכית והוא משמש יותר ויותר במחקר צמח לומדת פיתוח שורש 10 - 21, נבדק לאחרונה על ידי ברt ו מייזל 22. רבים מן המחקרים שהוזכרו 10,13 - 18,21 היו אופטימיזציה וערכו במעבדה של ארנסט HK Stelzer העסיקה דרך מיוחדת המדגם גובר מאופיין גדל השורש על פני השטח של ג&#39;ל 17. במחקרים אלה, מיקרוסקופ מחוייט שמש, שבו הצמח מוחזק מלמטה. לעומת זאת, הרוב המכריע של מיקרוסקופי אור גיליון רחב זמינים להחזיק מדגם מלמעלה. לפיכך, שיטת הכנה המסוימת הזה לא ניתן ליישם בקלות. השיטה המוצגת כאן מספקת פרוטוקול לשיטת ההרכבה והמבוססת על-פני שטח הרלוונטי עבור OpenSPIM 23, פלטפורמת גישה פתוחה על מנת ליישם השיפור מיקרוסקופי תאורת מטוס סלקטיבי (SPIM). המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לאפשר הדמיה לטווח הארוך של שורשי ארבידופסיס במיקרוסקופ OpenSPIM אור הגיליון. המטרה זו מושגת על ידי גידול צמחים זקוף על היםurface של ג&#39;ל עם השורשים בתוך נוזל ואילו העלים להישאר באוויר. על מנת להבטיח פעילות הפוטוסינתזה של הצמח, מערכת תאורה מחוייט מאירה את העלים אבל לא את השורשים (איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Agarose, low melting</td>
			<td >VWR</td>
			<td >AFFY3282125GM</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black aluminum foil</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >BKF12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black plastic foil</td>
			<td >Carl Roth</td>
			<td >HT83.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED blue (453 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LD&#160;CN5M-1R1S-35-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED red (625 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LR T66F-ABBB-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED board - PCB design software</td>
			<td >Cadsoft Eagle</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MES monohydrate</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M1503.0100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropore Surgical Tape</td>
			<td >3M</td>
			<td >1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murashige &#38; Skoog Medium (MS-Medium)</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M0221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phytagel&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P8169</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sample holder 3D print</td>
			<td>i.materialise</td>
			<td ><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square petri dishes (245x245x25 mm)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >734-2179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >84097-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

שיטת הכנת מדגם זה מאפשרת טיפוח של הצמח בתוך החדר מדגם מיקרוסקופ תוך שמירה על מערכת שורשים עם מיקרוסקופ אור גיליון (איור 1). הצמח גדל על פני השטח של שכבת ג&#39;ל (½ בינוני MS המכיל 1.5% gellan מסטיק) רכוב על בעל מדגם אישית מעוצבת (איור 2). בעל המדגם הוא 3D מודפס באמצעות שרף שקוף כחומר. גרסת יוצר המדגישה את הממדים מתוארות באיור 2C. שורשי שקועים בנוזל (½ בינוני MS), אשר מתרענן ללא הרף על ידי מערכת טפטוף. העלים נשארים באוויר מואר ברציפות עם עוצמת אור של 130 μmol / m² / שעות המגיע נוריות כחולות ואדומות כי מסודרות טבעת מעל הצמח (איור 1 א &#39;, ב&#39; ו איור 3A-C). טבעת LED מיוצרת בסדנה המכונית שלנואנו מספקים פרטים טכניים על איך לבנות את טבעת LED של האיור 3 ורשימת החומר. עוצמת האור יכול להיות מותאם באופן רציף החל 30-250 μmol / m 2 / s (איור 3D). מערכת השורש מוצללת על ידי יריעות קטנות של ניילון נצמד שחור המכסה את פני מים (איור 1). כל אור התועה מן ההארה כי נאסף על ידי עדשת זיהוי מסונן לפי מסנן GFP (האיור 3E). עם ההגדרה הזאת, לשגות זמן של שורש ארבידופסיס לרוחב גובר נרשם במשך 17 שעות באמצעות עדשת 20X / 0.5 (איור 4). השורש לרוחב מקורו שכבת תאי pericycle, הנמצא עמוק בתוך השורש העיקרי. כדי להדגים את יכולות ההדמיה אפילו עמוקות בתוך רקמה לפרקי זמן ממושך, בהגדלה גבוהה (40X / 0.75) שמשה כדי ללכוד את ההיווצרות של ro לרוחבot מן primordium השלב הראשון עד הופעתה מתוך השורש העיקרי בתוך פרק זמן של 38 שעות (איור 5). פרוסת 2D למופת של ערכת הנתונים מוצגת באיור. 5B. הקלטה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר הדינמיקה של היווצרות שורש לרוחב ב -3 D (איור 5 א) עם רזולוציה הסלולר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> איור 1: גידול התנאים בתוך תא מדגם OpenSPIM. א) סקיצה של חדר ההדמיה. הצמח גדל זקוף על פני השטח של ג&#39;ל, רכוב על בעל מדגם שהותקן (ראה גם איור 2). השורשים גדלים בתוך נוזל, אשר החליף באופן רציף על ידי מערכת טפטוף. המפעל משאיר לגדול אוויר מואר על ידי נוריות אדומות וכחולות (ראה גם איור 3). מערכת שורש מוצללת שנינות<html> גיליונות h קטנים של ניילון נצמד שחור המכסים את פני מים. מכסה עשוי שני חלקים של רדיד אלומיניום שחור מקטין עוד יותר את כמות האור מתחת לפני המים ושומר לחות בתא המדגם. הפאנל מוגדל מימין מדגיש את היבול על פני השטח של גוש ג&#39;ל שקוע במדיום נוזלי. ירידה של agarose עולה על השורש על הג&#39;ל. התיבה המקווקות מציינת את האזור של העניין נצפה על ידי מיקרוסקופ. צילום B) של חדר הדמיה (ללא מכסה). מספרים (1) - (10) ב A ו- B מייצגים: (1): x / y / z / θ שלבית עם טבעת LED, (2): בעל המדגם, (3): מכסה, (4): thaliana ארבידופסיס , (5): גיליונות של ניילון נצמד שחור, (6): מערכת זלוף, (7): עדשה אובייקטיבית זיהוי, (8): במדיום נוזלי, (9): תא מדגם, (10): עדשה אובייקטיבית תאורה. ג) המכסה עשוי שני חלקים של רדיד אלומיניום שחור.<html> Target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> איור 2: בעל המדגם. א) מודל 3D. קובץ מודל 3D מסופק ההשלמות. צילום B) של הדפסים 3D באמצעות חומרים שונים (1) - (3): פלסטיק אקרילי שקוף, (4) ו- (5): שרף, (6): שרף שקוף. ג) ציור טכני של בעל המדגם, המספרים מייצגים מילימטר. תצלום D) של בעל מדגם מיוצר עם מפעל רכוב. האזור המקווקו יכול להיות שנצפה על ידי מיקרוסקופ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> להעלות / 55,044 / 55044fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3: הגדרת תאורת צמח. א) דיאגרמת מעגל סכמטי של המנורה. זוגות של נוריות ניתן להפעיל / כיבוי באופן פרטני עבור ברק כיוונית. LED: דיודה פולטת אור, R: התנגדות, T: טרנזיסטור, JP: ראש סיכה. B) את העיצוב הסופי של מנורת התאורה צויר באמצעות-תוכנת PCB (מעגלים מודפסים: מעגלים מודפסים). אנו מספקים את קובץ עיצוב לוח ההשלמות. הלוח יוצר אז התאסף בחנות מכונת MIBA של המכון שלנו. צילום C) של טבעת LED מופעל. ארבעה זוגות של אדום LED כחול מסודרים בטבעת. ד) מגוון של מתח יכול להיות מותאם בין 3.5 V ו -14.0 עמידויות V. שימשו בכדי להגיע לסכום של אור החל 30-250 μmol / m 2 / s (R1-8: 220 אוהם, R9-12: 1,220 אוהם ). ה) ספקטרום הפליטה של המנורה, GFP ו YFP.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> איור 4: הקלטה של מעבר זמן של ארבידופסיס thaliana שורש לרוחב. שתיל בן 5 ימים מבטא סמן קרום (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) וכתב גרעיני (pGATA23 :: NLS-גאס-GFP) במיוחד לציון pericycle התאים המתמיינים שורש לרוחב. ערימה של 217 תמונות (3 מיקרומטר z-ריווח) נכבשה כל 15 דקות במשך 17 הקלטה h באמצעות עדשה 20X / 0.5. א) ארבע נקודות פסק זמן של 69 מוצגים השלכה בעוצמה מקסימלית. B) שישה מתוך 217 פרוסות יחידות של Z- מחסנית של נקודת זמן אחת מוצגות. ברי סולם ב A ו- B מייצגים 100 מיקרומטר.עומס / 55,044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> איור 5: הקלטה של מעבר זמן של ארבידופסיס thaliana שורש לרוחב. שתיל בן 6 ימים מבטא סמן קרום (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) וכתב גרעיני (pGATA23 :: NLS-גאס-GFP) במיוחד לציון pericycle התאים המתמיינים שורש לרוחב. ערימה של 200 תמונות (1.5 מיקרומטר z-ריווח) נכבשה כל 15 דקות במשך 38 הקלטה h באמצעות עדשה 40X / 0.75. א) טיוח 3D של ארבע נקודות זמן, המספרים ברשת מייצגי מיקרומטר, B) פרוסה אחת דרך המישור המרכזי של השורש הראשי. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">אנא</a>לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. קובץ מודל 3D מסופק. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> קובץ משלימה LED טבעת Board.brd. קובץ עיצוב הלוח מסופק. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel at JoVE.com

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

light-sheet-fluorescence-microscopy-plant-roots-growing-on-surface

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Video: Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...