עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק לא. DBI 0519984) לבין המכון הלאומי לבריאות (ללא מענק. 5R01GM078279) ..

1) הכנת חומר המפעל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Protoplasts ניתן להסיק הרבה מיני צמחים ורקמות שונים ובלבד התמהיל הנכון של אנזימי עיכול דופן התא משמש 1. לפני ניסוי בקנה מידה מלא נעשית, עיכול בקנה מידה קטן של החומר מומלץ על מנת להעריך את היעילות protoplasting של הרקמה, אנזימים, וכו &#39;, כדי לאמוד את אחוז התאים החיוביים למיון התא. כאן, protoplasts נגזר שורשי שתילי thaliana ארבידופסיס כי תא מסוג במיוחד לבטא חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP) משמשים. Endodermis מרכז שקט מסומנים על ידי P SCR: GFP ומרכז שוקט על ידי P WOX5: GFP 2,3 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים בוגרים hydroponically ב phytatrays (סיגמא; איור 2 א) על מסנן ניילון (250 מיקרומטר רשת; NITEX) המאפשרת השורשים לצמוח דרך לתוך מדיום הגידול (0.22% w / v Murashige ובינוניים Skoog בסל [סיגמא], 1% w / v סוכרוז, 0.05% w / v MES [2 - (N-morpholino) חומצה ethanesulfonic], pH 5.7 עם KOH). לחלופין, ניתן לגדל צמחים על גבי מסנן ניילון (100 מיקרומטר רשת) ב במאונך צלחות אגר 1% (איור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש במסננים הנ&quot;ל לא רק מסייע הקציר של השורשים, הוא גם מאפשר טיפול נוסף קל של שתילים, אם תרצה בכך. המסננים מאפשרים את השתילים שיועברו בהמוניהם phytatrays חדש או צלחות אגר השלים עם זרז של עניין. כך, למשל, להגדיר את phytatray למעלה נעשה שימוש לצורך ניתוח התא סוג ספציפי של התגובה תעתיק לטיפול חנקן שתילים ארבידופסיס 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו כי סמן פלורסנט מיקרוסקופית שלך באה לידי ביטוי בצורה נכונה (במיוחד בעת שימוש באפשרות הטיפול, כמו סוג התא הסמנים הספציפיים עצמם עשויים להיות מושפעים הטיפול). במקרה זה, שתילים נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ניקון, איור 1). שימו לב לסוג ספציפי שורות תאים פלורסנט סמן צריכה להיות מאופיינת בתחילה תחת מיקרוסקופ confocal כדי לקבוע בדיוק אילו סוגי תאים מסומנים ולקבוע השתנות בביטוי. </li></ol> 2) הכנת התמיסה protoplasting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1.25 w / v% cellulase (Yakult), 0.3% w / v Macerozyme (Yakult), 0.4 מ &#39;ד מניטול, 20 מ&quot;מ ו - MES KCl 20 מ&quot;מ (ממלאי M 1) במים demineralized ולהתאים את ה-pH ל 5.7 עם 1 מ טריס / HCl pH 7.5. פתרון זה יהיה עכור מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הפתרון 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (הפתרון יהפוך ברור) ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני הוספת 0.1% w / v BSA (אלבומין בסרום שור), 10 mM CaCl 2, ו - 5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol . </li></ol> 3) קציר protoplasting החומר צמח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורשי נקצרים על ידי גירוד להם את רשת ניילון עם אזמל והפקידו לתוך בקבוקון המכיל את הפתרון protoplasting. באופן כללי, 10 מ&quot;ל של תמיסת protoplasting משמש לכל 1,500 שורשי שתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער את צלוחיות בעדינות (75 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. זמן הדגירה כבר עשוי להגדיל את התשואה protoplast אלא גם להוסיף אפקט של protoplasting עצמו על ביטוי גנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן הפתרון protoplast עם מסננת תא 40 מיקרומטר (BD פלקון) ולחלק את הפתרון מעל חרוטי 15 צינורות מ&quot;ל (BD פלקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינורות בצנטריפוגה הנדנדה דלי במשך 10 דקות ב הערה ג 500 זה מהירות צנטריפוגה יהיה תלוי בסוג של protoplasts בשימוש, השבריריות שלהם ואת כמות פסולת התא הנוצר במהלך הטיפול האנזימטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רוב supernatant, resuspend protoplasts בפתרון הנותרים ולבדוק אותם מיקרוסקופית (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שימוש hemacytometer להעריך את מספר וצפיפות protoplasts. צפיפות התאים תקבע הזרקה מדגם מהירות, קצב האירועים לכל השני ולכן סך כל הזמן הדרוש כדי למיין את התאים ב FACS (ראה גם סעיף 4.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7) או להמשיך ישירות FACS או לרחוץ resuspend protoplasts בפתרון דגירה, כגון W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, KCl 5 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ MES, להתאים את pH עד 5.7 עם KOH) או פתרון protoplasting ללא הוסיף אנזימים. במיוחד כאשר מסתכלים שינויים תעתיק, יש חשיבות כדי למזער את החשיפה של הדגימות בתנאים שעשויים להשפיע על ביטוי גנים, כגון שינוי למאגר protoplasts נשמרים פנימה לכן מומלץ לשמור על protoplasts בפתרון protoplasting והמשך כדי FACS בהקדם האפשרי. </li></ol> 4) מיון פלואורסצנטי תא פעיל של protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ולהכין את סדרן התא. כאן, FACSAria (BD) משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת זרם לזרום עם 100 &amp; mu; זרבובית מ &#39;לחץ נדן 20 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות התאים הזרקת מהירות מדגם ניתן להתאים את הניסוי מסוים בהתבסס על אם התשואה הטובה ביותר האפשרית או מהירות השגה המהיר ביותר הוא הרצוי. יש לנו מיון בהצלחה עם צפיפות של עד 10,000,000 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תסיסה מדגם אפשרות FACS כדי למנוע שקיעה של protoplasts. אם סתימת של FACS היא בעיה, ישנם שלושה שלבים לפתרון בעיות אפשריות: 1. בצע backflush מדגם-line. 2. מדולל ההשעיה protoplast שלך כדי להפחית את הצפיפות. 3. לנקות את הפתרון protoplast על ידי חזרה על השלב סינון (3.3) לאחר צנטריפוגה ו resuspension. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשיר למדידת פיזור קדימה (FSC), לצד פיזור (SSC) ופליטה ב 530/30 ננומטר עבור ה-GFP ו ננומטר 610/20 אדום עבור ספקטרום autofluorescence (RSA) לאחר עירור על ידי לייזר 488 ננומטר. אלה הם למעשה רק את הפרמטרים המשמשים לבודד GFP חיובי protoplasts. הנה, את הגדרות המתח היו כדלקמן: FSC - 60V, SSC 250V, 350V ו-GFP RSA 335V. שים לב כי הגדרות מתח אופטימלי יהיה שונה עבור כל FACS ויהיה גם צורך להתאים את אורך החיים של סדרן התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי הגדרת dotplot עבור פיזור קדימה לעומת פיזור לוואי. להחיל את ההגדרות כך מתח את האירועים הנמדדים הם התרכזו בעלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, ליצור עלילה נקודה של אותות פלואורסצנטי ירוק לעומת אדום. להחיל את ההגדרות כך מתח את האירועים נמדדת התשואה אוכלוסייה אלכסוני מרוכז בעלילה כאשר מסתכלים השעיה (לא GFP) wild-type protoplast. ההשעיה protoplast נגזר משורת סמן GFP יפיק האוכלוסייה ברורה של אירועים פלואורסצנטי ירוק לעולם לא לראות wild-type דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת אילוצים פיצויים להתאים חפיפה בין ספקטרום ה-GFP ו-RSA. פרופר אילוץ הגדרות הפיצוי יאפשר הפרדה טובה יותר של ה-GFP חיובי protoplasts מ protoplasts הלא GFP ופסולת. האילוצים משמש כאן הן כדלקמן: RSA, GFP מינוס 17.91%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שער לזהות GFP חיובי אירועים, שליטה שלילי של אי - GFP protoplasts צריך לשמש כדי לסייע בהגדרת גבולות השער (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום הפסקת פיזור קדימה כדי להשאיר פסולת קטן מתוך ניתוח. דמיינו את ה-GFP חיובי אירועי העלילה מול SSC FSC כדי לקבוע את המיקום של הפסקת. הנה, הפסקת נקבע 5000. שים לב FACS יהיה לספור פסולת כאירועים למיין מדגם עם רמות גבוהות של פסולת ייתכן GFP שונה אחוזים אירועים חיוביים מהצפוי. זה לא בהכרח בעיה. עם זאת, פסולת יותר במדגם, ככל למיין את ייקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם הניסוי ואת שפע של סוג התא כדי להיות מנותח, להגדיר את מצב דיוק FACS או עבור תשואה אופטימלית או טוהר אופטימלי של תאים ממוינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת RNA, להכין אוסף צינורות (1.5 מ&quot;ל צינורות microfuge) עם כמות מתאימה של חיץ מיצוי RNA. עם ההגדרה הזו, 20,000 אירועים מיון תניב בנפח כולל של כ 100 μl אשר מוינו ל 350 μl של חיץ החילוץ (RNeasy מיקרו בערכה, QIAGEN). מערבבים דגימות לאחר השלמת מהסוג כמו השעיה התא יכול בריכה בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות דגימות או להמשיך ישירות RNA החילוץ. מנתח microarray מוצלח כבר preformed עם RNA המופק קטנה כמו 500 אירועים מיון. הנה, השתמשנו ערכת חילוץ RNeasy מיקרו (QIAGEN), את WT-Ovation פיקו RNA מערכת הגברה ו FL-Ovation cDNA ביוטין Module V2 (NuGEN). </li></ol> נציג תוצאות אחת phytatray של כ -1,500 אחד בן שבוע P SCR: שתילים GFP הניבו כ -60,000 protoplasts (כפי שנמדד על ידי hemacytometer). 2.6% מכלל 65,000 אירועים FACS-מעובד הוגדרו GFP להיות חיובי מוינו (איור 4 ב). שמונה צלחות של כ 1500 ארבעה ימים בת P WOX5:: כל השתילים GFP (12,000 סה&quot;כ) הניבה כ - 30,000,000 protoplasts (כפי שנמדד על ידי hemacytometer). 0.063% של 16,000,000 אירועים FACS-מעובד הוגדרו GFP להיות חיובי מוינו (איור 4 ג&#39;). 10,000 אירועי מיון משמשים בדרך כלל עבור מיצוי רנ&quot;א יכול להניב 20-140 ng סך רנ&quot;א (איור 5). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סוג ספציפי Cell-GFP סמן שורות שורש ארבידופסיס. מיקרוסקופ פלואורסצנטי התמונות צולמו עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) ו-GFP לסנן על מיקרוסקופ Eclipse 90i (Nikon) פועל על Metamorph תוכנה (התקנים מולקולריים). התמונות DIC ו-GFP היו מעולף למטרות ויזואליזציה. שתי שורות סמן השתמשו בניסוי הזה חזותי מוצגים;א) P SCR: GFP ו-B) P WOX5: ה-GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שתילים הצמח תנאי הגידול. גדלו בקר סביבתי hydroponically phytatrays ב (א) או על צלחות אגר במאונך (ב). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Protoplasts הצמח להביע GFP. מיקרוסקופ פלואורסצנטי התמונות צולמו עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) ומסנן GFP על מיקרוסקופ Eclipse 90i (Nikon) פועל על Metamorph תוכנה (התקנים מולקולריים). התמונות DIC ו-GFP היו מעולף למטרות ויזואליזציה. החצים מצביעים על תא פרץ, פסולת תאים protoplast GFP חיובי. המרחק בין שני קווים לבנים הוא 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. מיון פלואורסצנטי תא פעיל של ה-GFP חיובי protoplasts Protoplasts נגזר סוג בר (א) SCR P:.: GFP (ב) או P WOX5: GFP (ג) קווי סמן נותחו מיון עם FACSAria (BD) מוגדר באמצעות שערים על dotplot של ירוק (530 / 30 ננומטר; ציר x) לעומת אדום (610 / 20 ננומטר; ציר Y) פלואורסצנטי. 100.000 אירועים מוצגים כל חלקה. האירועים נופלים בתוך השער מיון GFP מודגשים בירוק. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. נציג RNA עקירות מ 10.000 תאים ממוינים. תאים מוינו ישירות RNA מיצוי חיץ (QIAGEN), RNA היה מטוהרים ובדק על טוהר ריכוז, שלמות על 2100 Bioanalyzer (Agilent). שלושה משכפל לשני קווי סמן מוצגים.

<ol>
	<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li><li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots.">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li><li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity.">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li><li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+fluorescent+selection+permits+precise,+rapid,+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts.">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li><li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis.">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li></ol>

Protoplasts יכול, באופן עקרוני, להיגזר במגוון של רקמות הצמח, אופטימיזציה תנאים נוחים יהיה מאוד לשפר את איכות וכמות RNA. הן פתרון protoplasting ואת חיץ הדגירה בחירה בשימוש ישפיעו על היבט זה. רבים חלבוני ניאון שונים יכול לשמש, בהתאם ליכולות של FACS ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>250 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-250/50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-100/47</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-10k</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytatrays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal Medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S5-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M2933</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1767</td>
<td>10 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>Eclipse 90i microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9546</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8041</td>
<td>1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CALBIOCHEM</td>
<td>444203</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2536</td>
<td> 1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>orbital shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LAB-LINE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>conical 15 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>table centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>Legend RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACSAria</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>20170-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy micro kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAGEN</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>WT-Ovation Pico RNA Amplification System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>3300_12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FL-Ovation cDNA Biotin Module V2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>4200_12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts

ברזולוציה גבוהה, סוג ספציפי תא ניתוח של ביטוי גנים משפר באופן משמעותי את ההבנה של תקנה התפתחותית ולתגובות לגירויים סביבתיים באורגניזם כלשהו תאיים. ההכלאה ב באתרו גן להדמיה עיתונאי יכול במידה מוגבלת לשמש למטרה זו אבל ברזולוציה גבוהה כמותי RT-PCR או תפוקה גבוהה transcriptome רחב ניתוח הבידוד של RNA מתוך סוגי תאים מסוים הנדרש. נייד ניתוק של רקמת להביע סמן חלבון פלואורסצנטי בסוג תאים ספציפיים ומיון הבאים פלואורסצנטי תא פעיל (FACS) מאפשרת לאסוף כמות מספקת של חומר להפקת RNA, cDNA ניתוח סינתזה / הגברה microarray. סט נרחב של סוג ספציפי שורות תאים כתב ניאון זמין לקהילה מחקר הצמח. במקרה זה, שתי שורות סמן השורש thaliana ארבידופסיס משמשים: P SCR: GFP (endodermis מרכז שקט) ו-P WOX5: GFP (מרכז שקט). מספר רב (אלפים) של השתילים גדלים hydroponically או על צלחות אגר וקצרו להשיג חומר שורש מספיק לניתוח נוסף. נייד ניתוק של חומר צמחי מושגת על ידי עיכול אנזימטי של התא הקיר. הליך זה עושה שימוש plasmolysis osmolarity-Induced גבוה cellulases זמינים מסחרית, pectinases ו hemicellulases לשחרר protoplasts לתוך פתרון. FACS-GFP חיובי תאים עושה שימוש להדמיה של ירוק לעומת ספקטרום פליטה אדום של protoplasts נרגש לייזר 488 ננומטר. GFP חיובי protoplasts ניתן להבחין ביחס מוגברת שלהם ירוק פליטה אדום. Protoplasts ממוינות בדרך כלל ישירות לתוך חוצץ מיצוי RNA ומאוחסנים לעיבוד נוסף במועד מאוחר יותר. טכניקה זו מתגלה להיות פשוטה מבחינה מעשית. יתר על כן, הוא הראה כי ניתן להשתמש בו ללא קושי לבודד בכמות מספקת של תאים עבור ניתוח transcriptome, אפילו סוגי תאים נדירים מאוד (למשל תאים מרכז שקט). לבסוף, תוכנית ההתקנה של צמיחה עבור שתילים ארבידופסיס הוא הוכיח המאפשרת טיפול לא מסובך הצמחים לפני מיון התא (לדוגמא עבור סוג ספציפי של התא ניתוח של תגובות דחק ביוטי או אביוטי). משלים פוטנציאל לשימושים FACS של protoplasts צמח הם דנו.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts at JoVE.com

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת טיפול<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt; השתילים לפני מיון התא.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

fluorescence-activated-cell-sorting-of-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

24.6K Views.  New York University. שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת טיפול ארבידופסיס thaliana השתילים לפני מיון התא.

Video: Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...