אנו מכירים את מרכז המשאבים דרוזופילה וינה ובלומינגטון דרוזופילה מרכז המניות (NIH P40OD018537) למתן זני דרוזופילה. אנו מודים ג&#39;ק פרנסן ממרכז הדמיה Microscopical לקבל תמיכה מקצועית בתחום ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי vidi ומענקים TOP (917-96-346, 912-12-109) מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO), על ידי שתי מלגות PhD DCN / Radboud המרכז הרפואי האוניברסיטאי, על ידי רשת פיגור שכלי גרמנית במימון התכנית + NGFN של משרד חינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) ועל ידי Gencodys הרשת המשולב המידה הגדולה FP7 של האיחוד האירופי (בריאותי 241,995) כדי AS. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או הכנת כתב היד.

<ol>
	<li>Lin, Y. C., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+synapse+and+dendrite+maintenance+and+their+disruption+in+psychiatric+and+neurodegenerative+disorders.">Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).</li><li>van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+networks+in+intellectual+disabilities.">Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.</a> Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).</li><li>Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+vulnerability+of+synapses+and+circuits+associated+with+neuropsychiatric+disorders.">Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders.</a> J Neurochem. 126, 165-182 (2013).</li><li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+dendritic+structure+on+firing+pattern+in+model+neocortical+neurons.">Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons.</a> Nature. 382, 363-366 (1996).</li><li>Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+form+to+function:+calcium+compartmentalization+in+dendritic+spines.">From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).</li><li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology.">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).</li><li>Mehnert, K. I., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+morphology+of+neurons+in+Drosophila.">Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila.</a> Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).</li><li>Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).</li><li>Ruiz-Canada, C., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+on+the+use+of+the+Drosophila+embryonic/larval+neuromuscular+junction+as+a+model+system+to+study+synapse+development+and+function,+and+a+brief+summary+of+pathfinding+and+target+recognition.">Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).</li><li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).</li><li>Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-function+screen+for+genes+controlling+motor+axon+guidance+and+synaptogenesis+in+Drosophila.">A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila.</a> Curr Biol. 11, 417-430 (2001).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34, 729-741 (2002).</li><li>Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+suppressors+of+Drosophila+NSF2+neuromuscular+junction+overgrowth.">A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth.</a> Genetics. 170, 779-792 (2005).</li><li>Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+restrains+synaptic+growth+by+attenuating+a+MAP+kinase+signal.">Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal.</a> Neuron. 51, 57-69 (2006).</li><li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Fiji-Based+Algorithm+That+Systematically+Quantifies+Nine+Synaptic+Parameters+Provides+Insights+into+Drosophila+NMJ+Morphometry.">A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Dubos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+depletion+of+intellectual+disability+and+Parkinsonism+candidate+gene+ATP6AP2+in+fly+and+mouse+induces+cognitive+impairment+and+neurodegeneration.">Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration.</a> Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).</li><li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila NMJ Morphometrics. , (2017).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide IJ 1.46. , (2014).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide IJ 1.46. , (2014).</li><li>Pielage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+of+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58, 195-209 (2008).</li><li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ankyrin+2+is+required+for+synaptic+stability.">Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability.</a> Neuron. 58, 210-222 (2008).</li><li>Iqbal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+and+heterozygous+disruptions+of+ANK3:+at+the+crossroads+of+neurodevelopmental+and+psychiatric+disorders.">Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders.</a> Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).</li><li>Wan, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+regulates+synaptic+growth+in+Drosophila.">Highwire regulates synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 26, 313-329 (2000).</li><li>Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+maturation+and+maintenance+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).</li><li>Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-type+specific+functions+of+DNT1,+DNT2+and+Spz+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PLoS One. 8, e75902 (2013).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

&quot;דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; ו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; הם כלים רבי עוצמה עבור חוקרים מעוניינים בהערכה מורפולוגיה סינפסה. הערכה ידנית של פרמטרי NMJ היא מייגע; ההערכה היא כי פקודות מאקרו יצילו חוקר מנוסה עד 15 דקות / NMJ בילה על פילוח תמונה ידני. עם אחד עד שני עשרות סינפסות העריכו לכל תנאי או גנוטיפ, זה מהר מסכם לסכומים ניכרים של זמן נשמר, גם מחקרים בקנה מידה קטנים. בעת ביצוע מסכים גדולים, רווח השימוש באבחון תפוקה גבוהה, לעומת הערכה ידנית וכימות, יכול להיות עצום. בנוסף תפוקה מוגברת, פקודות מאקרו לספק ניתוח אובייקטיבי בקלות; הם פוסלים הטיות אישיות אחרים דורשות ניסויים עיוורים כמו גם הבדלים בין-אישיים המתרחשים כאשר חוקרים שונים מעורבים בניתוח. לבסוף, פקודות מאקרו לספק רגיש ומדויקalysis של תכונות NMJ, המאפשר זיהוי של רגולטורים הסינפטי שגורמים די מתוחכם ממה פגמי NMJ דרמטיים עד כה נותרו מערירים העין של החוקר. מידע מפורט על הליכי אימות האלגוריתמים מנוצלים מאקרו נמצא al הפרסום Nijhof et. 17. הפונקציונליות של פקודות מאקרו אומת למדוד תכונות מורפולוגיות כראוי של תסיסנית NMJs על שריר 4. לאחר מכן, הודגם כי פקודות מאקרו היו גם מתאים לנתח סינפסות השרירים האחרים אורגניזם זה. סביר להניח כי פקודות מאקרו יכול לשמש גם כדי למדוד פרמטרים מורפולוגיים של NMJ עם מבנה דומה מינים אחרים, כולל מינים תסיסנית אחרים וחרקים נוספים. גם NMJs מאוד רחוק באבולוציה, למשל, NMJs של עכברים, להראות קונפורמציה מבנית דומה למדי 29. המקרו לא נבדק על הכנות NMJ ממינים אחרים אך משתמשים פוטנציאליים מוזמנים לבדוק את הפקודות מאקרו למטרות כאלה. זה מאוד חשוב שהמשתמש בוחן את auto-הספים ואלגוריתמים השונים להגדרה / לבחור את גדרות המאקרו המתאימות ביותר עבור התמונות. עם ההגדרות האלה, ברמת דיוק של כ 95% מושגת כאשר הערכת מאקרו הושוותה הערכה ידנית. התאמת הגדרות מאקרו קטע שצריך 100% של תמונות יכול להיות תהליך מאוד מייגע או אפילו בלתי אפשרי. לכן, הדרה של תמונות לא מפולחות כראוי מומלצת אם המספרים שלהם מתחת 5%. ברור, אם האיכות של התמונות היא נמוכה, פקודות מאקרו יפיק יחס גבוה יותר של סגמנטציה מספקות. תמונות באיכות נמוכה תשפיע הערכה ידנית דומה ולכן לא ניתן לקשר את הביצועים של פקודות מאקרו. אף על פי כן מאקרו הם חזקים למדי כפי שהם תוכננו עבור התמונהs שנוצר על מיקרוסקופ התכול גבוה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי המאפשר הדמיה של מספר הגדול של דגימות) 17. נקודה קריטית היא שהמשתמש חזותי בודק את כל תמונות התוצאה שנוצרו על ידי הפקודות מאקרו. זה יאפשר לזהות לכלול תמונות עם פילוח מאכזב. בסעיף 6 של פרוטוקול זה, המשתמש מודרך כיצד להתאים את ההגדרות עבור פילוח תמונה נכונה בעת הפעלת מאקרו תת &quot;לנתח&quot;. כדי להכיר את דרישות במהירות של המקרו כיצד להתאים את הגדרות מאקרו תיקייה בשם &quot;Examples_adjusting הגדרות המאקרו&quot; נכלל https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a מאגר מאקרו. שלוש עשר תיקיות משנה, כל אחד עם דוגמאות תמונות המתקבלות על פלטפורמות מיקרוסקופ שונות (תכולה גבוהה / confocal / מיקרוסקופי פלואורסצנטי) ו immunostainings השונה, ניתנות. קובץ PDF תחת כותרת &quot;מדריך דוגמאות&quot; נכלל באותהתיקייה שבה ההגדרות הדרושות עבור כל דוגמא ניתנות, יחד עם מסמך טקסט מתן תמונות תוצאות ואת התוצאות הצפויות. המקרו תוכננו לעבד תמונות שנשמרו כמו .tiff מופרד קבצים, בכל זאת חלק מהמשתמשים עשויים להציל את התמונות שלהם במתכונת שונה. Https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a האינטרנט הבא 21 מכיל תיקייה בשם &quot;NMJ תסיסנית&quot; שבו שלושה קבצים לדוגמה (דוגמה 1 - 3) ומסמך &quot;מדריך דוגמאות&quot; עם הוראות מפורטות כיצד לייבא תמונות לתוך מאקרו אם לא מאוחסן כמו .tiff קבצים מופרדים ניתן למצוא גם באותה תיקייה. יחד, &quot;דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; ו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; פקודות מאקרו לכמת עשר תכונות NMJ שונים: אזור NMJ, ההיקף NMJ, מספר boutons, NMJ בוטון באזור, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איסלהNDS, מספר הסניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר האזורים פעילים. זה מספק יתרון גדול על פני כלים עד כה זמינים שיכול להעריך רק אחד או כמה תכונות הסינפטי 30, 31. ניתוח כמוני Multiparametric נושא פוטנציאל גדול עבור תגליות חדשות, למשל, לזהות רגולטורי רומן ששולטים אחד עד היבטים רבים של ביולוגית סינפסה. הוא גם מספק את הרזולוציה הנדרשת כדי לקבוע גני coregulate בדיוק תכונות NMJ הזהות או חופפים ולכן צפויים לפעול מסלולים מולקולריים משותפים. לבסוף, הוא פותח את האפשרות לחקור כיצד פרמטרים הסינפטי לתאם אחד עם השני בתנאים באין מפריעים 17 ואשר הודות לגנים מתאמים מורפומטריות מתואמים כזו. יחדיו, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בשתי פקודות מאקרו &quot;Morphometrics NMJ תסיסנית&quot; ו&quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot;, אשר לבצע כימות אובייקטיבי ורגיש של עשר תכונות מורפולוגיות NMJ באופן תפוקה גבוהה.

הפרעות קוגניטיביות כגון נכות אינטלקטואלית, הפרעת ספקטרום האוטיזם וסכיזופרניה מאופיינות לעתים קרובות פונקצית 1 הסינפטי נורמלי, 2, 3. מורפולוגיה פונקצית סינפסה היא בחוזקה סבוכים זה בזה: פגמים מורפולוגיים יכולים לגרום לתקלה הסינפטי, reversely, העברה סינפטית סוטה תשפיע התבגרות הסינפטי ומורפולוגיה 4, 5, 6. מספר אורגניזמים מודל הועסק על מנת להבין טוב יותר את הביולוגיה הסינפסה לשפוך אור על כמה שינויים סינפטיים להשפיע תפקוד המוח בריאות ומחלות 7, 8, 9. NMJ תסיסנית הוא למד בהרחבה ומבוססת במודל vivo עבור glutamatergic סאיםnapse ביולוגיה 10, 11. בעשורים האחרונים, מודל זה שימש במשך מחקרים פיזיולוגיים הגן ממוקד, כמו גם עבור מסכי גנטית בקנה מידה גדול, במטרה לזהות הבדלים מורפולוגיים בין NMJs. בפרט, מסך גנטי קדימה זיהה רבי רגולטורי מנגנונים חיוניים שבבסיס התפתחות הסינפסה לתפקד 12, 13, 14, 15, 16. עם זאת, רוב המסכים הללו הסתמכו על הערכה חזותית של מורפולוגיה מסוף NMJ ועל גילוי איכותני של הפרעות הסינפטי או הבקיע חצי כמותית של כמה תכונות מורפולוגיות. כתוצאה מכך, דווקא עדין הפרעות מורפולוגיים הסינפטי שאינם ברורים לעין האנושית הם החמיצו בקלות. על מנת להיות מסוגל לזהות הבדלים כמותיים באופן מקיף, אתיש NMJ להיבדק במדויק על ידי כימות שיטתי של פרמטרים מורפולוגיים של עניין. מדידת תכונות NMJ ידנית מייגעת, במיוחד כאשר ישנם מספר תכונות NMJ של ריבית ו / או בעת ביצוע הקרנות גנטיות בקנה מידה גדולה. על מנת לתמוך multiparametric, ניתוח מורפולוגי תפוקה גבוהה וכדי להשיג כימות אובייקטיבי, שתי פקודות מאקרו &quot;Morphometrics תסיסנית NMJ&quot; ו &quot;Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון&quot; פותחו 17. מאקרו שניהם לרוץ תוכנה לניתוח תמונה קוד פתוח פיג&#39;י 18, והוא יכול לכמת את שתי התמונות confocal ו nonconfocal. אמצעים &quot;דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; מסופי NMJ immunostained עם דיסק סמן postsynaptic גדול 1 (DLG-1) או peroxidase חזרת presynaptic (HRP), שיתוף שכותרתו עם bruchpilot סמן אזור פעיל (BRP). זה מכמת תשעה parame מורפולוגייםters (המתוארת בהמשך): אזור NMJ, ההיקף NMJ, מספר boutons, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איים, מספר סניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר אזורי פעיל המסוף הסינפטי (איור 1) . למרות אלגוריתם לקביעת מספר boutons שוהה המאקרו הזה, זה לא עומד בקריטריונים של דיוק 17. כדי להעריך את המספר כראוי של boutons, יש צורך להשתמש במאקרו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot;, אשר תוכנן במיוחד כדי לכמת boutons באמצעות הכנות NMJ immunostained ידי אנטי-Synaptotagmin (Syt) או חלבון מחרוזת אנטי-ציסטאין (CSP), ושיתוף immunolabeled עם BRP. המאקרו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; מכמת את הפרמטרים הבאים: מספר boutons, אזור בוטון NMJ, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איים, מספר סניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר zo פעילנס (איור 2). המקרו מורכב 3 תת-מאקרו: (I) &quot;המר לערום&quot; מזהה את כל קבצי התמונה הזמינים ויוצר-hyperstacks Z ו- תחזיות בעצמה מקסימלית של שני הערוצים. כפלט, מאקרו זה יפיק שני קבצים חדשים בכל סינפסה שנקרא &quot;stack_image_name&quot; ו &quot;flatstack_image_name&quot;. II) &quot;גדר ROI&quot; יפתח את כל תמונות הקרנת מקסימלית &quot;flatstack_image_name&quot; ברציפות ולהציגם עם הבקשה ידנית להגדיר את האזור של עניין (ROI) שבה המסוף הסינפטי הספציפי של העניין קיים. זו יושמה כדי לאפשר הרחקה של סינפסות חיבור השרירים הסמוכים ו / או סוגים אחרים של מסופי הסינפטי (כגון 1s) שיכול להיות נוכח התמונות 11. (III) &quot;לנתח&quot; חל אוטומטי ניתוח מלא לכל האזורים של התמונות בתוך הגבולות של ROI. כפי שבעקבות צעד זה, המשתמש יקבל שני קבצים חדשים: &quot;results.txt&quot; שבו כל המדידה המספרית תהיה מבוארת ו &quot;res_image_name.tif&quot; שבו סגמנטציה הבסיסית המיוצרת על ידי מאקרו שתודגם. במהלך ניתוח תמונה שלושה מבנים נגזרים כל מסוף סינפטי: מתווית NMJ, שלד NMJ, ומספר BRP חיובי האזורים פעילים. מתווית NMJ משמשת כדי לקבוע את אזור NMJ וההיקף שלה פרדת פרשה מים עוקבת מספקת מספר boutons. מן השלד, חמש תכונות NMJ מוסקות: אורך NMJ הכולל, הסכום של אורך הנתיב הארוך הרציף חיבור כל שתי נקודות קצה (אורך סניף ארוך), מספר תאים שאינם קשורים לכל NMJ (המכונה &quot;אי&quot; ), מספר הסניפים, ואת מספר נקודות הסתעפות (בהתפצלות אחד מתחברת סניפים שלושה או יותר). מספר האזורים הפעילים נקבע על-ערוץ BRP ידי ספירהכתמי BRP חיוביים. מתווית NMJ המבוארת (הקו צהוב), שלד NMJ (הקו כחול), ומספר BRP חיובי האזורים פעילים (מסומן מוקדים לבנים) מוצגות תמונת תוצאות המדידות של הפרמטרים מעובדות ל (. txt) קובץ הפלט (איור 3). דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; ו &#39;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&#39; תוארו הראשון ומאומתים בהרחבה על ידי Nijhof et al. 17. כתב יד זה מתמקד המתודולוגיה לנתח מורפולוגיה NMJ באמצעות פקודות מאקרו &#39;Morphometrics NMJ תסיסנית&#39; ו &#39;Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון&#39;. עם זאת, לפני ניתוחים מאקרו בסיוע, NMJ וניתוחים ו immunostainings צריכות להתבצע. אלה הם צעדים מכריעים, והשילוב של סמנים המשמש אימונוהיסטוכימיה צריך להיות מתאים ניתוחי מאקרו. צעדים אלה מוזכרים בקצרה section 1 של פרוטוקול זה לכוון את משתמש אזכור המתאר בפירוט את הפרוטוקולים לבצע הליכים אלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-discs large 1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AFFN-DLG1-4D6</td>
			<td>1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson IR</td>
			<td>323-005-021</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Synaptotagmin</td>
			<td>Gift from Hugo Bellen</td>
			<td></td>
			<td>Jan-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Cysteine string protein</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>DCSP-1(ab49)</td>
			<td>1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Bruchpilot</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Jan-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Z25006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Confocal microscope or fluorescence microscope</td>
			<td>Leica SP5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Mac or Pc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two algorithms for high-throughput and multi-parametric quantification of drosophila neuromuscular junction morphology

מורפולוגיה Synaptic היא בחוזקה הקשורים ליעילות סינפטית, ובמקרים רבים פגמי סינפסה מורפולוגיים בסופו של דבר להוביל לתקלה הסינפטי. צומת העצב-שריר הזחל תסיסנית (NMJ), מודל ומבוסס על סינפסות glutamatergic, נחקר בהרחבה במשך עשרות שנים. זיהוי של מוטציות גרימת פגמים מורפולוגיים NMJ חשף רפרטואר של גנים מווסתים פיתוח סינפסה ולתפקד. רבים מאלה שזוהו במחקרים רחב היקף אשר התמקדו גישות איכותיות כדי לזהות חריגויות מורפולוגי של תסיסנית NMJ. חסרון של ניתוחים איכותיים הוא ששחקנים עדינים רבים התורמים מורפולוגיה NMJ יבחינו סביר. בעוד ניתוחים כמותיים נדרשים לזהות את ההבדלים המורפולוגיים המעודנים, שניתוח כזה הוא עדיין לא בצע פקודות כי הם מייגעים. פרוטוקול זה מתאר באלגוריתמים לניתוח פרט לשני תמונה &quot;דרוזופילה </em&gt; NMJ Morphometrics&quot; ו &#39;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&#39;, זמין כמו פקודות מאקרו פיג&#39;י תואם, עבור ניתוח morphometric כמותית, מדויק ואובייקטיבי של דרוזופילה NMJ. מתודולוגיה זו פותחה כדי לנתח מסופי NMJ immunolabeled עם סמנים נפוצים DLG-1 ו . BRP בנוסף, היישום הרחב יותר שלה סמנים אחרים כגון Hrp, CSP ו Syt מוצג פרוטוקול זה המקרו מסוגל להעריך תשעה סרטים עלילתיים NMJ מורפולוגיים:. אזור NMJ, היקף NMJ, מספר boutons, אורך NMJ, סניף ארוך NMJ אורך, מספר האי, מספר הסניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר האזורים פעילים מסוף NMJ.

Watch this Scientific Journal Video about Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology at JoVE.com

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

שני אלגוריתמים לניתוח תמונה, &quot;Morphometrics תסיסנית NMJ&quot; ו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; נוצרו, לכמת באופן אוטומטי תשע תכונות מורפולוגיות של צומת דרוזופילה שרירית (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

two-algorithms-for-high-throughput-multi-parametric-quantification

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

9.5K Views.  Radboud University Medical Center.  שני אלגוריתמים לניתוח תמונה, "Morphometrics תסיסנית NMJ" ו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics" נוצרו, לכמת באופן אוטומטי תשע תכונות מורפולוגיות של צומת דרוזופילה שרירית (NMJ). 

Video: Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...