מחקר זה נתמך על ידי את ההגנה איום הפחתת סוכנות (DTRA) תחת חוזה HDTRA1-14-C-0116, ואת המרכז למצוינות גנומיקה זיהום (משרד ההגנה #W911NF-11-1-0136 מקלדת).

עבודה זו בוצעה בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים. פרוטוקולים בעלי חיים המערבים מכרסמים אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס סן אנטוניו מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC) תחת פרוטוקול MU009(RA).
 1. להכין קטטר לקנה מחוון, פ tularensis Inoculum <ol><li>להכין קטטר (20 G x 2 ב) <ol><li>לחתוך את 20 G x 2 ב המחט ולטחון קצה המחט של בלאנט, חלקה לסיים עם כלי רוטרי. 
		הערה: אורך המחט קהות צריך לאפשר את הטיפ מתכת לבטל כ 3 מ מ לתוך שרוול קטטר כשהוא מתיישב על המחט קהות. המחט קהות נותן את הקטטר קשיחות מבנית כדי לאפשר מיקום של הקטטר לקנה, העדר של קצה המחט קהות המגיחה מתוך שרוול קטטר מונע פגיעה לקנה הנשימה.</li>
		<li>לנקות את המחטים קהות, קטטרים באמצעות אתנול 70% ולחטא תחת אור UV במשך 15 דקות</li>
	</ol></li> <li>להכין את קנה הנשימה מחוון <ol><li>לקצץ טיפ פיפטה 1,000 µL כדי לאפשר את הטיפ לשבת לתוך חור קטטר, טופס של החותם לאוויר.</li>
		<li>להסיר מסנן µL תרסיס מכשול פיפטה טיפ 200, המקום בפנים הטיפ פיפטה החתוך בעבר µL 1,000-</li>
		<li>להבטיח המסנן יכול לנוע בחופשיות בתוך קצה פיפטה 1,000 µL כאשר הטיפ הוא הצביע טיפ למטה.</li>
	</ol></li> <li>Inoculum tularensis פ <ol><li>לגדול tularensis פ עומס בן לילה על צלחת אגר המתאימה ב- 37 ° שריטה ג כ 100 µL של הדשא חיידקים מהצלחת אגר עם סטרילי מזריקים לולאה ולהשתמש לחסן 500 מ"ל Erlenmeyer בקבוק המכיל 250 מ של מדיום הגידול נוזלי המתאים (עבור Fn: ציר סויה tryptic (TSB) בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט) דגירה רועד בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס. 
		הערה: novicida פ משמש הוידאו גדל על צלחת אגר (TSA) tryptic סויה בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה נוזלי מבוגר ב g 4,221 x בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר חיידקים. 
		התראה: פעל המוסד &#39; המלצות אבטחה s כדי למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>בעדינות מחדש להשעות בגדר חיידקי 25 מ של מדיום נוזלי המתאים (Fn: TSB בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט) המכיל 10% גליצרול, באמצעות פיפטה 25 מ ל.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, aliquot התרבות חיידקי resuspended לתוך 500 aliquots µL, בקבוקים, להקפיא באמבט קרח יבש/אתנול, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>כדי לקבוע את כייל של הבקבוקונים תרבות קפוא, להסיר שתי מבחנות קפוא המאוחסנים ב- 80 ° C, להפשיר על קרח, ולבצע דילולים טורי, באגירה פוספט מלוחים (PBS) ואחריו ציפוי על מדיום הגידול המתאים (Fn: TSA המכיל 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד). צלחות הן מודגרות h 24-48-37 מעלות צלזיוס, יחידות ויוצרים מושבה (CFU) ממוספרים כדי לחשב את מספר תאים חיידקיים בתוך הבקבוקונים תרבות קפואים (ממוצע של שתי מבחנות).</li>
		<li>להכין את inoculum חיידקים על ידי מפשיר בקבוקון קפוא בקרח ולאחר מכן לדלל את התרבות עם PBS הריכוז הסופי של 10 7 CFU/100 µL. Inoculum צריך להיות בריכוז שיניבו את CFU הרצוי ב- 100 µL (הריכוז הסופי של גליצרול בתוך inoculum לא יכול להיות יותר מ- % 3, כדי למנוע חנק של העכברוש). תרבות קפוא הבקבוקונים מאוחסנים ב- 80 ° C יכול לשמש עד שישה חודשים לאחר הכנה-</li>
	</ol></li></ol> 2. עכברוש הרדמה <ol><li>להתחבר לחדר הרדמה מכשיר אידוי הפעלה כראוי איזופלוריין של מכונת הרדמה.</li>
	<li>חיבור הגז ניקוי צינור על תא הרדמה לגז ניקוי המערכת.</li>
	<li>פתח את זרימת החמצן על מכונת הרדמה כדי 4 ליטרים לדקה</li>
	<li>להגדיר את מאדה איזופלוריין 5%-</li>
	<li>למקם את החולדה בבית הבליעה הרדמה. 
	הערה: אנו בדרך כלל מנצלים חולדות בין 8-10 שבועות (130-180 גרם); עכברים צעירים שקשה לחסן באמצעות טכניקה זו בשל גודלו הקטן של חלל הפה.</li>
	<li>כאשר תנאי הגיוס של הרדמה התרחש, לשמר את החולדה-איזופלוריין 5%, 2 ל'/min חמצן אפקט. זה לוקח בערך 3-10 דקות</li>
	<li>לקבוע את העומק של הרדמה על ידי האיכות ואת קצב הנשימה פעימות הלב, ואת תגובת רפלקס גירוי כמו במבחן קמצוץ הבוהן. אידיאלי עומק ההרדמה שציין רוזן s 1-1.5 בין כל נשימה.</li>
</ol> 3. חיסון Intratracheal <ol><li>להסיר את החולדה מן החדר הרדמה ולמקם את העכברוש dorsally על הדוכן צנרור מכרסמים. לצרף את השיניים הקדמיות של עכברוש המחזיק כדי לשמור עכברוש במקום. 
	הערה: אם החולדה מתחיל להתעורר במהלך ההליך, ניתן להסיר את הקטטר, החולדה חזר לחדר הרדמה כדי להגיע למטוס עמוק יותר של הרדמה.</li>
	<li>להשתמש ביד הדומיננטית לעבור באותו צד של תמיכה יד הלשון עם נקודה רחבה ההלבשה האגודל מלקחיים.</li>
	<li>שימוש תומכת יד ובטוח הלשון laryngoscope נגד העכברוש, &#39; s להוריד את הלסת, ולהמחיש את קנה הנשימה והושט של החיה. קנה הנשימה לפתוח ולסגור כמו החולדה נושם.</li>
	<li>הוסף הצנתר המכיל 20 גאייג-קהה-מחט, מוכן בשלב 1.1, לתוך קנה הנשימה. אולי יש התנגדות קלה, וייתכן הכניסה לתוך קנה הנשימה &#34; באמפי &#34; עקב הקטטר לשפשף את הסחוסים בקנה הנשימה. בשל לחות או נשימה רדודה, קנה הנשימה יכול להיות מכוסה האפיגלוטיס המונע ויזואליזציה של קנה הנשימה. בעדינות לגעת בקצה של הסחוס האפיגלוטיס יגרום הכנף סחוס לפתוח ולחשוף את קנה הנשימה.</li>
	<li>הסר קהה-המחט של הקטטר תוך הקפדה על הקטטר נשאר לקנה.</li>
	<li>לאפשר כמה שניות לעבור העכברוש להיות מסוגל לנשום סביב קטטר מוכנס לתוך קנה הנשימה.</li>
	<li>מושב בחוזקה מחוון קנה הנשימה אל הקטטר פתיחה. תנועה של המכשול תרסיס יציין הצנתר הוכנס כהלכה לתוך קנה הנשימה.</li>
	<li>להבטיח כי החולדה שוכבת על הדוכן צנרור כך בחזה של החיה פונה בניצב למישור של העמדה צנרור.</li>
	<li>להסיר את מחוון קנה הנשימה ולספק 100 µL (10 7 CFU) של inoculum המכיל tularensis פ באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, בחוזקה ישיבה הטיפ כנגד הפתח קטטר.</li>
	<li>לצרף 1 מ"ל slip עצה טוברקולין מזרק מלא אוויר ולספק 300 µL של אוויר כדי לוודא inoculum יגיע לריאות של העכברוש.</li>
	<li>להסיר את הצנתר קנה הנשימה ולהסיר את החולדה פלטפורמת כירורגי.</li>
	<li>לאפשר את החולדה לעורר ולהחזיר לכלוב. ודא כי הנשימה חזר לשגרה.</li>
	<li>לקבוע את CFU ב tularensis פ inoculum כפי שמתואר בשלב 1.3.5 כדי לאשר את CFU יועבר. בתוך קנה הנשימה.</li>
	<li>חזור על השלבים 3.1-3.9 על חוסנו (תמים) חיות PBS µL 100 במקום inoculum.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularemia.">Tularemia.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).</li><li>Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Francisella+tularensis+infection.">Animal models of Francisella tularensis infection.</a> Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).</li><li>Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Natural+History+of+Pneumonic+Tularemia+in+Female+Fischer+344+Rats+after+Inhalational+Exposure+to+Aerosolized+Francisella+tularensis+subspecies+tularensis+Strain+Schu+S4.">The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4.</a> Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).</li><li>Ray, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fischer+344+rat+reflects+human+susceptibility+to+Francisella+pulmonary+challenge+and+provides+a+new+platform+for+virulence+and+protection+studies.">The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies.</a> PloS one. 5, e9952 (2010).</li><li>Jemski, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tularemia:+comparison+of+selected+routes+of+vaccination+in+Fischer+344+rats.">Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats.</a> Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).</li><li>Wu, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+of+Fischer+344+rats+against+pulmonary+infections+by+Francisella+tularensis+type+A+strains.">Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains.</a> Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).</li><li>Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+contribute+to+effective+vaccination+against+respiratory+infection+by+type+A+Francisella+tularensis+strains.">Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains.</a> Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).</li><li>Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularaemia:+bioterrorism+defence+renews+interest+in+Francisella+tularensis.">Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).</li><li>Kingry, L. C., Petersen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+review+of+Francisella+tularensis+and+Francisella+novicida.">Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida.</a> Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).</li><li>Rohmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Francisella+tularensis+genomes+reveals+evolutionary+events+associated+with+the+emergence+of+human+pathogenic+strains.">Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains.</a> Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).</li><li>Chu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+Francisella+novicida+vaccine+protects+against+Francisella+tularensis+pulmonary+challenge+in+rats+and+non-human+primates.">Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).</li><li>Signarovitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Live+Attenuated+Francisella+novicida+U112&#916;iglB+Protects+against+Pulmonary+F.+tularensis+SCHU+S4+in+the+Fischer+344+Rat+Model.">Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112&#916;iglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model.</a> PloS one. 7 (10), e47639 (2012).</li><li>Cunningham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+vaccine+efficacy+by+expression+of+a+TLR5+ligand+in+the+defined+live+attenuated+Francisella+tularensis+subsp.+novicida+strain+U112DiglB::fljB.">Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB.</a> Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

העכברוש פישר 344 הופך להיות מודל חשוב עבור פיתוח חיסון tularemia3. חשיפה tularensis פ דרך המסלול ריאתי הוא קריטי עבור הוכחת יעילות כנגד צורות שהוסבה לכלי נשק של tularensis פ, כי אלה יימסרו אירוסולים. חיסון Intratracheal של העכברוש מקלה על חשיפה של הריאות עכברוש tularensis פ ללא צורך גדול, יק...

פ tularensis (Ft) גורם המחלה האנושית, tularemia. כאשר החיידק נרכשים דרך המסלול ריאתי, זה מוביל tularemia pneumonic, אשר יש תחלואה גבוהה התמותה1. פ tularensis נחשב סוכן biothreat בשל הסכנה הקשורים לטפסים שידורה, ויש כיום אין חיסון שאושרו לשימוש בני אדם בארה ב מאמץ אינטנסיבי נמצא בעיצומו בימים אלה לפתח חיסונים, צעדים טיפוליים נגד tularemia pneumonic, כדי להגן על האוכלוסייה האנושית נגד השימוש הפסול הזה biothreat חיידקי
רוב המחקר tularemia התמקדה המודל העכבר, בשל הרגישות של עכברים לזיהום פ tularensis , השכיחות של נוגדנים. עם זאת, עכברים הוכיחו להיות דוגמנית קשה לפיתוח חיסון, בשל הקושי של הוכחת יעילות החיסון זה מודל2. לאחרונה, העכברוש פישר 344 פותחה כמודל עבור פיתוח חיסון tularemia3. הרגישות של החולדה פישר 344 תת השונים פ tularensis מחקה רגישות אנושית4, חולדות יכול להיות מוגן נגד אתגר ריאתי פ tularensis על ידי חיסון באמצעות זן תרכיב חי ידוע של הגנה בני5,6,7. כי החולדה פישר 344 מודלים תכונות מסוימות של זיהום פ tularensis של בני אדם, זה יכול להיות מודל מאוד שימושי עבור הפיתוח של חיסון המגן מפני ריאתי tularensis פ חשיפה.
חיסון יעיל צריך להגן. על בני האדם מפני חשיפה ריאתי tularensis פ. החשיפה ריאתי סביר של שהוסבה לכלי נשק tularensis פ יהיה aerosolized חיידקים בשאיפה לתוך הריאות8. עם זאת, תרסיס מהדור tularensis פ הוא מסוכן ובלתי מסורבלת, דורש ציוד מיוחד הבלימה. מסלול חלופי של חשיפה ריאתי בחולדה שהוא אולי יותר להתאמה עבור מספר מעבדות חסר ציוד מיוחד היא דרך חיסון intratracheal6. טכניקה זו מנצל laryngoscope את המיקום הנכון של צנתר בתוך קנה הנשימה של עכברוש anesthetized. מיקומה בתוך קנה הנשימה, יותר מאשר את הוושט, מאומת על ידי מכשיר פשוט מדמיין זרימת האוויר מהריאות. פ tularensis מועברת לאחר מכן לריאות דרך הצנתר על ידי המינהל עם מזרק, ואחריו החדרת אוויר לתוך הצנתר על מנת להבטיח משלוח ריאתי של החיידקים. לעומת זאת, Jemski5 דיווח בעבר כי tularensis פ מחוסן לתוך פישר 344 חולדות דרך המסלול תוך-אפי יכול לא להיות תרבותי מן הריאות עד 3 ימים לאחר חיסון, המציין את חיסון תוך-אפי בחולדות אינה לא תוצאה ישירה של חיידקים לתוך הריאות.
הסוכן בחר צורות של tularensis פ (פ tularensis subsp. tularensis, subsp. tularensis פ holarctica) מחייבים הליכים הבלימה אבטחה ברמה 3 (BSL3), אשר תמנע צילום וידאו. עם זאת, פ novicida (Fn) פטור הסוכן בחר מצב עקב שלה avirulence בבני אדם בריאים, יכול להיות מנוצל בבטחה תחת אבטחה ברמה 2 (BSL2) תנאים9,10. יתר על כן, Fn משמש כבסיס עבור חיסונים הקלוש בשידור חי יכול להגן מפני חשיפה ריאתי tularensis פ כאשר מתבצעת דרך חיסון intratracheal11,12,13. הטכניקה המובאת כאן מאפשר הלימוד של זיהומים המתרחשים דרך המסלול ריאתי ניצול חולדות כמודל לבני. טכניקה זו יכולה להתבצע ללא צורך ציוד מניבות תרסיס מיוחד. Fn שימש את הטכניקות הבוליוודי.

<table width="1062">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:376px;height:40px;">GreenLine fiber optic blade size 0</td>
			<td style="width:175px;">Carefusion</td>
			<td style="width:344px;">5-5231-00</td>
			<td style="width:167px;">Macintosh American profile</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GreenLight system laryngoscope handle</td>
			<td>Carefusion</td>
			<td>4559GSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Exel International Safelet I.V. Catheter</td>
			<td>EXEL INTERNATIONAL</td>
			<td>26743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Broad Point Dressing Thumb Forceps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>76-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200ul barrier tip</td>
			<td>GeneseeScientific</td>
			<td>24-142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000ul pipette tip</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>24-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>3000228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>RIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Butler Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent anesthesia machine</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td>VTC302 Classic T3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent Anesthesia chamber</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>AB 1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intratracheal inoculation of fischer 344 rats with francisella tularensis

זיהום ריאתי עם החיידק Francisella tularensis יכול לגרום למחלה רצינית וקטלניים, tularemia, אצל בני אדם. עקב המחסור הנוכחי חיסון tularemia שאושרו עבור בני אדם, המחקר מתמקדת פיתוח החיסון ניצול מודלים בעלי חיים המתאימים. העכברוש פישר 344 התפתחה מודל זה משקף את הרגישות האנושית tularensis פ זיהום, ובכך הוא מודל אטרקטיבי עבור פיתוח החיסון tularemia. חיסון Intratracheal של העכברוש 344 פישר עם פ tularensis מחקה חשיפה ריאתי אצל בני אדם. שילוח מוצלח לתוך קנה הנשימה עכברוש הוא קריטי עבור משלוח ריאתי. Laryngoscope עם תאורה משמש לצנרר כראוי את tracheae של מרדימים חולדות; המיקום הנכון בתוך קנה הנשימה נקבעת על ידי מכשיר פשוט לזהות את הנשימה. בעקבות צנרור, התרבות tularensis פ מועבר ב מנה נמדד באמצעות מזרק. טכניקה זו המשקלל ריאתי מסירת tularensis פ בתוך קנה הנשימה העכברושים להעריך את יעילות החיסון.

תגובת חיסון intratracheal של tularensis פ בחולדה ההורמונאלית יכול להיקבע על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) נגד חיידקים UV-לא פעיל, כפי שתואר לעיל11. סה כ אימונוגלובולין G (IgG) בתגובה של פישר 344 חולדות לא מופעל כל התא חיידקים היה חיסון המוערך פוסט-intratracheal עם זן הקלוש...

Watch this Scientific Journal Video about Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis at JoVE.com

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

פרוטוקול זה מתאר intratracheal ההזרקות של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis. הליך זה מחקה ריאתי החשיפה של בני אדם סוכן biothreat פוטנציאל זה יכול לשמש כדי לבדוק את החיסון והיעילות הטיפולית נגד tularemia ריאתי.

Intratracheal חיסון של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

intratracheal-inoculation-fischer-344-rats-with-francisella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

7.1K Views.  University of Texas San Antonio. פרוטוקול זה מתאר intratracheal ההזרקות של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis. הליך זה מחקה ריאתי החשיפה של בני אדם סוכן biothreat פוטנציאל זה יכול לשמש כדי לבדוק את החיסון והיעילות הטיפולית נגד tularemia ריאתי.

Video: Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Orthotopic Hind-Limb Transplantation in Rats

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel therapeutic entity in reconstructive surgery. However, long term high-dose multi-drug immunosuppressive therapy is required to ensure graft survival, bearing the risk of serious side effects which halters broader application. Further progression in this field may depend on better understanding of basic immunology and ischemia reperfusion injury in composite tissue grafts.
To date, orthotopic hind limb transplantation in rats has been the preferred rodent model for reconstructive transplantation (RT), however, it is an extremely demanding procedure that requires extraordinary microsurgical skills for reattachment of vasculature, bones, muscles and nerves.
We have introduced the vascular cuff anastomosis technique to this model, providing a rapid and reliable approach to rat hind limb transplantation. This technique simplifies and shortens the surgical procedure and enables surgeons with basic microsurgical experience to successfully perform the operation with high survival and low complication rates. The technique seems to be well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury (IRI) studies.

Here we describe the orthotopic rat hind-limb transplantation procedure, which seems to be the gold standard in vivo model for composite tissue allotransplantation research.

השתלת orthotopic לימב הינד-בחולדות

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized animals. Before embarking on an examination of animals for parasites, two things should be considered. One: what use will be made of the information collected, and two: which test is the most appropriate. Knowing that animals are parasitized may be something that the facility accepts, but there is often a need to treat animals and then to determine the efficacy of treatment. Parasites may be detected in animals through various techniques, including samples taken from live or euthanized animals. Historically, the tests with the greatest diagnostic sensitivity required euthanasia of the animal, although PCR has allowed high-sensitivity testing for several types of parasite. This article demonstrates procedures for the detection of endo- and ectoparasites in mice and rats. The same procedures are applicable to other rodents, although the species of parasites found will differ.

This article describes various procedures for screening rats and mice to detect endo- or ectoparasitism. Several diagnostic assays will be demonstrated, both those suitable for use on live animals and those used after euthanasia of the animal. Photographs to aid in identification of rat and mouse parasites will be included.

אבחון חיצוני ו Endoparasites בחולדות מעבדה ועכברים

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of otherwise healthy women during their reproductive years18,32-34. Predisposing factors include antibiotic usage, uncontrolled diabetes and disturbance in reproductive hormone levels due to pregnancy, oral contraceptives or hormone replacement therapies33,34. Recurrent VVC (RVVC), defined as three or more episodes per year, affects a separate 5 to 8% of women with no predisposing factors33.
An experimental mouse model of VVC has been established and used to study the pathogenesis and mucosal host response to Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. This model has also been employed to test potential antifungal therapies in vivo13,24. The model requires that the animals be maintained in a state of pseudoestrus for optimal Candida colonization/infection6,14,23. Under such conditions, inoculated animals will have detectable vaginal fungal burden for weeks to months. Past studies show an extremely high parallel between the animal model and human infection relative to immunological and physiological properties3,16,21. Differences, however, include a lack of Candida as normal vaginal flora and a neutral vaginal pH in the mice.
Here, we demonstrate a series of key methods in the mouse vaginitis model that include vaginal inoculation, rapid collection of vaginal specimens, assessment of vaginal fungal burden, and tissue preparations for cellular extraction/isolation. This is followed by representative results for constituents of vaginal lavage fluid, fungal burden, and draining lymph node leukocyte yields. With the use of anesthetics, lavage samples can be collected at multiple time points on the same mice for longitudinal evaluation of infection/colonization. Furthermore, this model requires no immunosuppressive agents to initiate infection, allowing immunological studies under defined host conditions. Finally, the model and each technique introduced here could potentially give rise to use of the methodologies to examine other infectious diseases of the lower female genital tract (bacterial, parasitic, viral) and respective local or systemic host defenses.

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key techniques to be used in the evaluation of Candida vaginitis in an experimental animal model are described. The methods will allow rapid collection of vaginal specimens and lymphocytes from draining lumbar lymph nodes. These techniques could give rise to mouse models of other diseases in the female lower genital tract.

הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Thymectomy מלא בחולדות מבוגרות עם לא פולשני endotracheal אינטובציה

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...