Questo studio è stato sostenuto dall'agenzia di riduzione di minaccia di difesa (DTRA) sotto contratto HDTRA1-14-C-0116 e il centro di eccellenza nel campo della genomica di infezione (DOD n #W911NF-11-1-0136).

quest'opera è stata eseguita in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Protocolli degli animali che coinvolgono roditori sono stati approvati dall'Università del Texas a San Antonio istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) sotto protocollo MU009(RA).
 1. preparazione del catetere, indicatore di Trachea e F. tularensis inoculo <ol><li>Preparare il catetere (20 x 2 pollici) <ol><li>tagliare il 20 x 2 in ago e macinare la punta dell'ago un Blunt e liscia finitura con un utensile rotante. 
		Nota: La lunghezza dell'ago smussato dovrebbe consentire la punta di metallo di recedere circa 3 mm nel manicotto del catetere quando completamente inserito sull'ago smussato. L'ago blunted dà la rigidità strutturale del catetere per consentire il posizionamento del catetere nella trachea, e l'assenza della punta dell'ago blunted sporgenti dal manicotto del catetere evita la lesione alla trachea.</li>
		<li>Pulire il blunted aghi e cateteri con etanolo al 70% e sterilizzare per 15 minuti alla luce UV</li>
	</ol></li> <li>Preparare Trachea indicatore <ol><li>tagliare la punta di una pipetta di 1.000 µ l per permettere che la punta per sedersi in un'apertura di catetere e formare una guarnizione ermetica.</li>
		<li>Rimuovere un filtro da un 200 µ l aerosol barriera pipetta suggerimento e posto dentro la punta della pipetta precedentemente tagliati e 1.000 µ l.</li>
		<li>Garantire il filtro possa muoversi liberamente all'interno la punta della pipetta 1.000 µ l quando la punta è puntata punta a.</li>
	</ol></li> <li>F. tularensis inoculo <ol><li>Grow F. tularensis ceppo durante la notte sulla piastra di agar appropriato a 37 ° C. raschiare circa 100 µ l del prato batterico dalla piastra di agar con una sterile inoculando ciclo e utilizzare per inoculare un matraccio di Erlenmeyer contenente 250 mL di terreno di coltura liquido appropriato da 500 mL (per Fn: brodo di soia triptico (TSB) completato con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato) e incubare agitazione durante la notte a 37 ° C. 
		Nota: F. novicida utilizzato nel video era cresciuta su una piastra di agar (TSA) di soia triptico completata con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato.</li>
		<li>Centrifugare la coltura liquida coltivata durante la notte a 4.221 x g a temperatura ambiente per 10 min e rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet batteri. 
		Attenzione: Si prega di seguire istituzione &#39; consigli di biosicurezza s per eliminare il surnatante.</li>
		<li>Delicatamente risospendere il pellet batterico con 25 mL di terreno liquido appropriato (Fn: TSB completati con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato) contenente 10% glicerolo, utilizzando una pipetta da mL 25.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta da 1 mL, aliquota la coltura batterica sedimento in 500 aliquote µ l in fiale, congelare in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e conservare a -80 ° C.</li>
		<li>Per determinarne il titolo dei flaconi di coltura congelata, rimuovere due flaconcini congelati conservati a-80 ° C, scongelare su ghiaccio ed eseguire diluizioni in tampone fosfato salino (PBS) seguita da placcatura su terreno di coltura appropriato (Fn: TSA contenente 0,1% L-cisteina cloridrato). Le piastre sono incubate 24-48 h a 37 ° C e unità formanti colonie (CFU) vengono enumerate per calcolare il numero di cellule batteriche all'interno i flaconi di coltura congelata (media di due flaconcini).</li>
		<li>Preparare l'inoculo batterico dallo scioglimento di un flaconcino congelato sul ghiaccio e poi diluire la cultura con PBS alla concentrazione finale di 10 7 CFU/100 µ l. L'inoculo deve essere ad una concentrazione che consentiranno di ottenere il desiderato CFU in 100 µ l (la concentrazione finale di glicerolo all'interno dell'inoculo non può essere superiore al 3%, per evitare asfissia del ratto). Flaconi di coltura congelati conservati a-80 ° C possono essere utilizzati per fino a sei mesi dopo la preparazione.</li>
	</ol></li></ol> 2. Anestesia di ratto <ol><li>collegare la camera di anestesia per il vaporizzatore di isoflurane correttamente operativo di una macchina di anestesia.</li>
	<li>Collegare il tubo sulla camera di anestesia per il sistema di evacuazione dei gas di evacuazione dei gas.</li>
	<li>Aprire il flusso di ossigeno sulla macchina di anestesia a 4 L/min.</li>
	<li>Impostare il vaporizzatore di isoflurane al 5%.</li>
	<li>Porre il ratto nella camera anestesia. 
	Nota: In genere utilizziamo ratti tra 8-10 settimane di età (130-180 g); più giovani ratti sono difficili da inoculare tramite questa tecnica a causa delle piccole dimensioni della cavità di bocca.</li>
	<li>Quando l'induzione dell'anestesia ha avuto luogo, mantenere il ratto al 5% isoflurane, 2 L/min di ossigeno per effetto. Questa operazione richiede circa 3-10 min</li>
	<li>Determinare la profondità dell'anestesia per la qualità e il tasso di respirazione e battito cardiaco e la reazione alla stimolazione riflessa come nella prova di pizzico di punta. Ideale profondità dell'anestesia è indicato da 1-1.5 s totali tra ogni respiro.</li>
</ol> 3. Intratracheale inoculazione <ol><li>rimuovere il ratto dalla camera di anestesia e posiziona il ratto dorsalmente sul cavalletto intubazione del roditore. Allegare i denti anteriori del ratto al titolare per mantenere ratto sul posto. 
	Nota: Se il topo comincia a risvegliarsi durante la procedura, il catetere può essere rimosso e il ratto restituito alla camera di anestesia per raggiungere un piano più profondo dell'anestesia.</li>
	<li>Utilizzare mano dominante per muovere la lingua stesso lato come mano di sostegno con forcipe punto ampia medicazione pollice.</li>
	<li>Uso mano di supporto e fissare la linguetta con il laringoscopio contro il ratto &#39; s mandibola e visualizzare la trachea e l'esofago dell'animale. La trachea si aprirà o chiuderà come ratto respira.</li>
	<li>Inserire il catetere contenente un ottuso calibro 20-ago, preparata al punto 1.1, nella trachea. Potrebbe esserci una leggera resistenza e inserimento nella trachea può essere &#34; su strada sconnessa &#34; dovuto il catetere strofinando le cartilagini tracheale. Dovuti a umidità o respirazione superficiale, la trachea può essere coperto dall'epiglottide che impedisce la visualizzazione della trachea. Toccando delicatamente il bordo della cartilagine epiglottide causerà il lembo di cartilagine aprire e scoprire la trachea.</li>
	<li>Rimuovere l'ago smussato dal catetere, garantendo nel contempo il catetere rimane nella trachea.</li>
	<li>Attendere alcuni secondi passare per ratto per poter respirare intorno catetere inserito nella trachea.</li>
	<li>Saldamente l'indicatore di trachea sul catetere di apertura. Movimento della barriera aerosol indicherà il catetere è inserito correttamente nella trachea.</li>
	<li>Garantire che il ratto è posa nello stand di intubazione tale che il petto dell'animale si trova di fronte perpendicolare al piano dello stand intubazione.</li>
	<li>Rimuovere l'indicatore di trachea e 100 µ l (10 7 CFU) dell'inoculo contenente utilizzando una punta di pipetta 200 µ l di F. tularensis, posti a sedere saldamente la punta contro l'apertura di catetere.</li>
	<li>Applicare una siringa per tubercolina 1ml antiscivolo punta riempita d'aria e consegnare 300 µ l di aria per garantire l'inoculo raggiunge i polmoni del ratto.</li>
	<li>Rimuovere il catetere dalla trachea e rimuovere il ratto dalla piattaforma chirurgica.</li>
	<li>Consentire il topo a risvegliare e tornare alla gabbia. Assicurarsi che la respirazione è tornato alla normalità.</li>
	<li>Determinare il CFU in F. tularensis inoculo come descritto al punto 1.3.5 per confermare il CFU consegnato nella trachea.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1-3.9 su animali non vaccinati (ingenuo) con 100 µ l PBS al posto dell'inoculo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularemia.">Tularemia.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).</li><li>Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Francisella+tularensis+infection.">Animal models of Francisella tularensis infection.</a> Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).</li><li>Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Natural+History+of+Pneumonic+Tularemia+in+Female+Fischer+344+Rats+after+Inhalational+Exposure+to+Aerosolized+Francisella+tularensis+subspecies+tularensis+Strain+Schu+S4.">The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4.</a> Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).</li><li>Ray, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fischer+344+rat+reflects+human+susceptibility+to+Francisella+pulmonary+challenge+and+provides+a+new+platform+for+virulence+and+protection+studies.">The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies.</a> PloS one. 5, e9952 (2010).</li><li>Jemski, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tularemia:+comparison+of+selected+routes+of+vaccination+in+Fischer+344+rats.">Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats.</a> Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).</li><li>Wu, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+of+Fischer+344+rats+against+pulmonary+infections+by+Francisella+tularensis+type+A+strains.">Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains.</a> Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).</li><li>Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+contribute+to+effective+vaccination+against+respiratory+infection+by+type+A+Francisella+tularensis+strains.">Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains.</a> Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).</li><li>Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularaemia:+bioterrorism+defence+renews+interest+in+Francisella+tularensis.">Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).</li><li>Kingry, L. C., Petersen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+review+of+Francisella+tularensis+and+Francisella+novicida.">Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida.</a> Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).</li><li>Rohmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Francisella+tularensis+genomes+reveals+evolutionary+events+associated+with+the+emergence+of+human+pathogenic+strains.">Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains.</a> Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).</li><li>Chu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+Francisella+novicida+vaccine+protects+against+Francisella+tularensis+pulmonary+challenge+in+rats+and+non-human+primates.">Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).</li><li>Signarovitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Live+Attenuated+Francisella+novicida+U112&#916;iglB+Protects+against+Pulmonary+F.+tularensis+SCHU+S4+in+the+Fischer+344+Rat+Model.">Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112&#916;iglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model.</a> PloS one. 7 (10), e47639 (2012).</li><li>Cunningham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+vaccine+efficacy+by+expression+of+a+TLR5+ligand+in+the+defined+live+attenuated+Francisella+tularensis+subsp.+novicida+strain+U112DiglB::fljB.">Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB.</a> Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Il ratto di Fischer 344 sta diventando un importante modello per tularemia vaccino sviluppo3. L'esposizione a F. tularensis attraverso la via polmonare è fondamentale per dimostrare l'efficacia contro weaponized forme di F. tularensis, perché questi sono trasportati sotto forma di aerosol. Intratracheale inoculazione del ratto facilita l'esposizione dei polmoni del ratto di F. tularensis senza la necessità di aerosol grande, costoso e complicato dispositivo di generaz...

F. tularensis (Ft) causa la malattia umana, tularemia. Quando i batteri vengono acquisiti attraverso la via polmonare, questo porta alla tularemia polmonare, che ha un'elevata morbilità e mortalità1. F. tularensis è considerato un agente biothreat dovuto il pericolo associato con forme aerosolizzate e non esiste attualmente un vaccino approvato per uso umano negli Stati Uniti Un intenso sforzo è attualmente in corso per sviluppare vaccini e misure terapeutiche contro tularemia polmonare, per proteggere la popolazione umana contro l'uso illecito di questa biothreat batterica.
Gran parte della ricerca di tularemia è concentrata sul modello del mouse, a causa della estrema sensibilità dei topi all'infezione di F. tularensis e la prevalenza dei reagenti. Tuttavia, i topi hanno dimostrato di essere un modello difficile per lo sviluppo di vaccini, a causa della difficoltà di dimostrare l'efficacia del vaccino in questo modello2. Recentemente, il ratto di Fischer 344 è stato sviluppato come un modello per lo sviluppo di tularemia vaccino3. La sensibilità del ratto Fischer 344 a varie sottospecie di F. tularensis imita sensibilità umana4e ratti possono essere protetti contro F. tularensis polmonare sfida dalla vaccinazione con un ceppo del vaccino vivo conosciuto per proteggere gli esseri umani5,6,7. Perché il ratto di Fischer 344 modelli alcune caratteristiche di F. tularensis infezione degli esseri umani, può essere un modello estremamente utile per lo sviluppo di un vaccino che protegge contro polmonare F. tularensis esposizione.
Ha bisogno di un vaccino efficace proteggere l'uomo contro l'esposizione polmonare di F. tularensis. Il più probabile esposizione polmonare da weaponized F. tularensis sarebbe aerosolized batteri inalati nei polmoni8. Tuttavia, generazione di aerosol di F. tularensis è pericoloso e ingombrante e richiede attrezzature specializzate e contenimento. Un percorso alternativo di esposizione polmonare nel ratto che è forse più adattabile per i laboratori più carente di attrezzature specializzate è via intratracheale inoculazione6. Questa tecnica utilizza un laringoscopio per il corretto posizionamento di un catetere all'interno della trachea di un ratto anestetizzato. Posizionamento all'interno della trachea, piuttosto che l'esofago, è verificato da un dispositivo semplice che Visualizza il flusso d'aria dai polmoni. F. tularensis viene successivamente recapitato nei polmoni attraverso il catetere dall'amministrazione con una siringa, seguita dall'introduzione di aria nel catetere per garantire una consegna polmonare dei batteri. Al contrario, che indica che l'inoculazione intranasale in ratti fa Jemski5 precedentemente segnalato che F. tularensis inoculato nei ratti Fischer 344 per via intranasale non poteva essere coltivato dai polmoni fino al post-inoculazione 3 giorni, non risultato in consegna diretta di batteri nei polmoni.
Moduli selezionare agente di F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) richiedono procedure di contenimento di biosicurezza di livello 3 (BSL3), che impedirebbero la videografia. Tuttavia, F. novicida (Fn) è esente dallo status di agente selezionare a causa sua avirulenza nell'uomo sano e può essere utilizzato in sicurezza in condizioni di livello 2 di biosicurezza (BSL2)9,10. Inoltre, Fn serve come base per vaccini vivi attenuati in grado di proteggere contro l'esposizione polmonare di F. tularensis quando consegnato via intratracheale inoculazione11,12,13. La tecnica presentata qui consente lo studio delle infezioni che si verificano attraverso la via polmonare utilizzando ratti come un modello per gli esseri umani. Questa tecnica può essere eseguita senza la necessità di attrezzature specializzate generatori di aerosol. FN è stato usato per le tecniche girate qui.

<table width="1062">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:376px;height:40px;">GreenLine fiber optic blade size 0</td>
			<td style="width:175px;">Carefusion</td>
			<td style="width:344px;">5-5231-00</td>
			<td style="width:167px;">Macintosh American profile</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GreenLight system laryngoscope handle</td>
			<td>Carefusion</td>
			<td>4559GSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Exel International Safelet I.V. Catheter</td>
			<td>EXEL INTERNATIONAL</td>
			<td>26743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Broad Point Dressing Thumb Forceps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>76-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200ul barrier tip</td>
			<td>GeneseeScientific</td>
			<td>24-142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000ul pipette tip</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>24-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>3000228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>RIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Butler Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent anesthesia machine</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td>VTC302 Classic T3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent Anesthesia chamber</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>AB 1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intratracheal inoculation of fischer 344 rats with francisella tularensis

Infezione polmonare con il batterio Francisella tularensis può condurre alla malattia grave e potenzialmente mortale, tularemia, negli esseri umani. Dovuto la mancanza attuale di un vaccino di tularemia approvati per gli esseri umani, la ricerca è focalizzata sullo sviluppo del vaccino utilizzando appropriati modelli animali. Il ratto di Fischer 344 è emerso come un modello che riflette umana suscettibilità all'infezione di F. tularensis e quindi è un modello interessante per lo sviluppo di vaccini di tularemia. Intratracheale inoculazione del ratto Fischer 344 con F. tularensis imita l'esposizione polmonare in esseri umani. La consegna di successo nella trachea del ratto è critica per la consegna polmonare. Viene utilizzato un laringoscopio con illuminazione a intubate correttamente le trachee di ratti anestetizzati; il corretto posizionamento all'interno della trachea è determinato da un semplice dispositivo per rilevare la respirazione. A seguito di intubazione, la cultura di F. tularensis viene consegnata in una dose misurata tramite siringa. Questa tecnica consente di standardizzare consegna polmonare di F. tularensis entro la trachea di ratto per valutare l'efficacia del vaccino.

La risposta umorale ad inoculazione intratracheale di F. tularensis nel ratto può essere determinata da enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) contro batteri inattivati UV, come descritto in precedenza11. Risposta di immunoglobulina G (IgG) totale dei ratti Fischer 344 ai batteri inattivati a cellula intera era valutato post-intratracheale inoculazione con un ceppo attenuato di Fn (10 inoculo di7 CFU) al giorno 14 e giorno 28 (<strong cla...

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Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Questo protocollo descrive intratracheale inoculazioni di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis. Questa procedura imita polmonare dell'esposizione degli esseri umani a questo potenziale agente di biothreat e può essere utilizzato per testare il vaccino ed efficacia terapeutica contro tularemia polmonare.

Intratracheale inoculazione di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

intratracheal-inoculation-fischer-344-rats-with-francisella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

7.1K Views.  University of Texas San Antonio. Questo protocollo descrive intratracheale inoculazioni di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis. Questa procedura imita polmonare dell'esposizione degli esseri umani a questo potenziale agente di biothreat e può essere utilizzato per testare il vaccino ed efficacia terapeutica contro tularemia polmonare.

Video: Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Orthotopic Hind-Limb Transplantation in Rats

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel therapeutic entity in reconstructive surgery. However, long term high-dose multi-drug immunosuppressive therapy is required to ensure graft survival, bearing the risk of serious side effects which halters broader application. Further progression in this field may depend on better understanding of basic immunology and ischemia reperfusion injury in composite tissue grafts.
To date, orthotopic hind limb transplantation in rats has been the preferred rodent model for reconstructive transplantation (RT), however, it is an extremely demanding procedure that requires extraordinary microsurgical skills for reattachment of vasculature, bones, muscles and nerves.
We have introduced the vascular cuff anastomosis technique to this model, providing a rapid and reliable approach to rat hind limb transplantation. This technique simplifies and shortens the surgical procedure and enables surgeons with basic microsurgical experience to successfully perform the operation with high survival and low complication rates. The technique seems to be well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury (IRI) studies.

Here we describe the orthotopic rat hind-limb transplantation procedure, which seems to be the gold standard in vivo model for composite tissue allotransplantation research.

Ortotopico Hind-Limb trapianto in topi

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel ...

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Immunologia e infezioni

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized animals. Before embarking on an examination of animals for parasites, two things should be considered. One: what use will be made of the information collected, and two: which test is the most appropriate. Knowing that animals are parasitized may be something that the facility accepts, but there is often a need to treat animals and then to determine the efficacy of treatment. Parasites may be detected in animals through various techniques, including samples taken from live or euthanized animals. Historically, the tests with the greatest diagnostic sensitivity required euthanasia of the animal, although PCR has allowed high-sensitivity testing for several types of parasite. This article demonstrates procedures for the detection of endo- and ectoparasites in mice and rats. The same procedures are applicable to other rodents, although the species of parasites found will differ.

This article describes various procedures for screening rats and mice to detect endo- or ectoparasitism. Several diagnostic assays will be demonstrated, both those suitable for use on live animals and those used after euthanasia of the animal. Photographs to aid in identification of rat and mouse parasites will be included.

La diagnosi di Ecto-e endoparassiti in ratti e topi di laboratorio

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of otherwise healthy women during their reproductive years18,32-34. Predisposing factors include antibiotic usage, uncontrolled diabetes and disturbance in reproductive hormone levels due to pregnancy, oral contraceptives or hormone replacement therapies33,34. Recurrent VVC (RVVC), defined as three or more episodes per year, affects a separate 5 to 8% of women with no predisposing factors33.
An experimental mouse model of VVC has been established and used to study the pathogenesis and mucosal host response to Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. This model has also been employed to test potential antifungal therapies in vivo13,24. The model requires that the animals be maintained in a state of pseudoestrus for optimal Candida colonization/infection6,14,23. Under such conditions, inoculated animals will have detectable vaginal fungal burden for weeks to months. Past studies show an extremely high parallel between the animal model and human infection relative to immunological and physiological properties3,16,21. Differences, however, include a lack of Candida as normal vaginal flora and a neutral vaginal pH in the mice.
Here, we demonstrate a series of key methods in the mouse vaginitis model that include vaginal inoculation, rapid collection of vaginal specimens, assessment of vaginal fungal burden, and tissue preparations for cellular extraction/isolation. This is followed by representative results for constituents of vaginal lavage fluid, fungal burden, and draining lymph node leukocyte yields. With the use of anesthetics, lavage samples can be collected at multiple time points on the same mice for longitudinal evaluation of infection/colonization. Furthermore, this model requires no immunosuppressive agents to initiate infection, allowing immunological studies under defined host conditions. Finally, the model and each technique introduced here could potentially give rise to use of the methodologies to examine other infectious diseases of the lower female genital tract (bacterial, parasitic, viral) and respective local or systemic host defenses.

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key techniques to be used in the evaluation of Candida vaginitis in an experimental animal model are described. The methods will allow rapid collection of vaginal specimens and lymphocytes from draining lumbar lymph nodes. These techniques could give rise to mouse models of other diseases in the female lower genital tract.

Protocolli per l&#39;inoculazione vaginale e Prelievo dei campioni nel modello murino sperimentale di Candida Vaginite

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedure per l&#39;identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l&#39;apparato digerente di una specie aviaria

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Thymectomy completa in ratti adulti con non-invasiva intubazione endotracheale

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Applicazione di perturbazioni costanti simili a massaggi sui vitelli per topi e monitoraggio dei conseguenti cambiamenti di pressione intramuscolare

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...