. אנחנו חבים Clemire Cimper לתמיכה טכנית מעולה שלה. העבודה במעבדה של מרגשת מומן על ידי מכון פסטר, מרכז לאומי pour la רשרש מדעי, ואת סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (d'Excellence Laboratoire Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR-16-CE13-0017-01) ואת Fondation ארק (PJA 20161205028). . סיסי, איי. סי ממומנות על ידי Ph.d., פוסט דוקטורנטים מן האיחוד להחיות.

חיות שטופלו לפי הנחיות הקהילה האירופית, ועדת האתיקה של הפרוטוקולים Institut Pasteur (CETEA) אישרה.
 1. ההכנות של הפתרונות מניות <ol><li>להכין את החומרים לבניית השריר לדוגמה קיבוע. להמיס 0.5 ג'י tragacanth מסטיק עם 20 מ ל מים ב RT כדי להפוך המדיום הטבעה-הקפאה עבור שריר קיבעון.</li>
	<li>להכין את הפתרונות עבור צביעת SA-β-גל-
	<ol><li>להכין מלאי פתרונות של K 3 Fe(CN) 6 (100 מ מ), K 4 Fe(CN) 6 (100 מ מ), MgCl 2 (1 מ') על ידי המסת אבקות בהתאמה במים מזוקקים.</li>
		<li>להכין את הפתרון מניות של 0.2% C 20 H 6 Br 4 נה 2 O 5 (אאוזין) על-ידי לדלל אותה במים.</li>
		<li>להכין הפתרון מניות של C 14 H 15 BrClNO 6 (X-גל) (50 מ"ג/מ"ל) על ידי המסת אבקה X-גל ב- C 3 H 7 אין (dimethylformamide, DMF).</li>
		<li>K חנות 3 Fe(CN) 6 ו- K פתרונות 4 Fe(CN) 6-4 ° C, ו- MgCl 2-RT. 
		הערה: X-גל ניתן לאחסן ב- aliquot ב-20 ° C, עד 6 חודשים. אאוזין הפתרון יכול להיות שמרו ב RT, לאחר סינון במידת הצורך. K-3-Fe(CN)-6 K 4 Fe(CN) 6 פתרונות protectedfromthe אור בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. X-גל פתרון אינו יציב במים והוא חייב להיות מוגן מפני האור.</li>
	</ol></li> <li>הכנה של הפתרונות Nanog מכתים: הפתרון permeabilization מכיל 0.1% נה 3 ג' 6 H 5 או 7 (ציטראט trisodium), 0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (טריטון X-100) במים מזוקקים, אשר צריך להיות מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס. להכין את הפתרון חסימה המכילה 5% סרום שור עוברית (FBS) בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), צריך להיות מאוחסן ב- RT.</li>
</ol> 2. Staining SA-β-גל בחלק שריר TA קפוא <ol><li>להכין החומר קיבוע עבור שריר ת א על ידי הנחת כמות קטנה של tragacanth מסטיק על חתיכת פקק.</li>
	<li>עכברים נפגע משני המינים (2 בן חודש, C57/B6) נפצעו 10 ימים לפני עם cardiotoxin (CDX) כפי שתואר לעיל 13. שימוש שאינו נפגע TA (הזרקת PBS) מן העכבר זהה של הפקד שלילי. אם אין ויוו התכנות רצוי, לטפל בכל עכבר עם Dox (1 מ"ג/מ"ל) במי השתייה באותו יום (מוגן מפני האור), מיד לאחר הפציעה אקס. 
	הערה: הפתרון Dox צריך להיות שונה כל 3 ימים עבור משך הטיפול הכולל של 7 ימים.
	<ol><li>לבודד שני השרירים TA (נפגע ולשלוט) של עכברים כפי שתואר לעיל ( איור 1 א') 13. כדי להבטיח הסעיפים רוחבי, להכניס המסטיק tragacanth הגיד דיסטלי של שריר ת א ולא להשאיר בערך ¾ חלק השריר בחוץ ( איור 1B) ומקפיאים ישירות בחנקן נוזלי מקורר איזופנטאן עבור &#60; 1 הגבלת 
		הערה: ודא שלשריר ת א הוא מאונך, במרכז של הפקק. דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C, או ישירות cryosectioned בסעיפים 10 מיקרומטר.</li>
	</ol></li> <li>לעבד את השרירים TA כפי שמתואר על איור 1B.
	<ol><li>להפיץ 1 th st-10 סעיפים בסדר הנכון על גבי עשר שקופיות שונות במיקום השמאלי העליון של כל שקופית. למקם את המקטע th 11 סמוכים במקטע st 1 בשקופית הראשונה; בסעיף ה 12 יעברו באותו סדר למקם נכון חוץ בסעיף 2 nd על שקופית ראשונה. חזור על תהליך זה עד סעיפים 10/שקופית מתקבלים עבור שקופיות עשר (סעיפים 100 סה כ) כדי להבטיח מינימום 1 מ"מ המרחק בין החלק הראשון לבין המקטע האחרון.</li>
	</ol></li> <li>לתקן את הסעיפים במשך 4 דקות ב- PBS המכיל 1% paraformaldehyde ו- 0.2% גלוטראלדהיד. לשטוף עם PBS, 2 x 10 דקות. בשלב הבא, דגירה בסעיפים PBS (ה-pH = 5.5) במשך 30 דקות לבצע את כל השלבים ב RT. 
	הערה: הקיבעון חייב להיות מתון כדי לשמור על פעילות אנזימטיות. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. ה-pH של מגניב הוא קריטי, הפתרון X-גל חייב להיות מוגן מפני האור.</li>
	<li>Incubate במקטעים המכילים X-גל פתרון: 4 מ מ K3Fe(CN) 6, 4 מ מ K4Fe(CN) 6, 2 מ מ MgCl2 ו 400 µg/mL X-גל ב- PBS, pH = 5.5. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 24h. לשטוף את השקופיות עם PBS, 3 x 10 דקות, ב- RT. 
	הערה: הדגירה דורש מינימום של 24 שעות ביממה, יכול להימשך למשך 48 שעות על מנת למקסם את האות SA-β-גל. הפתרון צריך להיות שונה לאחר 24 שעות של דגירה. השקופיות צריכים להיות מוגנים מפני אור. אם רק מכתימה SA-β-גל היא הרצויה, המשך לשלב 2.5. אם צביעת במשותף עם Nanog רצוי, אנא דלג קדימה לשלב 3.1.</li>
	Paraformaldehyde <li>תיקון שקופיות 1% ב- PBS במשך 30 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 10 מינימלית Counterstain עם 0.2% אאוזין. לטבול את השקופיות הפתרון אאוזין עבור 1 דקות ולשטוף אותם עם מים מזוקקים בקצרה. לבסוף, לטעון את השקופיות מימית-שאינם-ואזוריט הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים). 
	הערה: זה חיוני לבצע את קיבוע שאחרי. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. כל הפעולות מבוצעות ב- RT.</li>
</ol> 3. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן Anti-Nanog <ol><li>לתקן את השקופיות עם PBS המכיל 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות לשטוף עם PBS, 2 x 10 דק להוסיף 200 µL של הפתרון permeabilization ישירות על השקופיות, תקופת דגירה של 5 דקות. <ol><li>שטיפת שקופיות עם PBS, 2 x 5 דקות, בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל 0.25% BSA ישירות על השקופיות. ביצוע כל הצעדים הללו-RT. 
		התראה: בצע את שלב קיבוע מתחת למכסה המנוע.</li>
	</ol></li> <li>Incubate שקופיות עם נוגדן נגד ראשי-Nanog (ריכוז סופי: 1.25 ug/mL) לילה ב 4 ° C ב- PBS המכילה 5% FBS. שקופיות עם PBS, 2 x 10 דקות וקונטה בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל BSA 0.25% עבור 5 דק. בצע כל הכביסה מדרגות בכל RT. 
	הערה: דגירה שקופיות בתוך קופסה עם מגבת נייר רטובה כדי למנוע אידוי.</li>
	שקופיות <li>Incubate עם µL 100 של נוגדנים משניים ראב-HRP מ מוכן לשימוש קיט (ראה טבלה של חומרים) במשך 45 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 5 דק ', כדי להסיר נוגדנים משניים. לבצע את כל השלבים ב RT עם הגנה מפני האור.</li>
	<li>ויזואליזציה <ol><li>תחילה, לדלל את 3,3 &#39;-diaminobenzidine (ג 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), כי אמחה קלות) במאגר המצע מסופקים על ידי מוכן להשתמש ערכת (20 µL של DAB עבור 1 מ"ל של המצע בופר). להוסיף 100 µL של פתרון DAB ישירות על גבי כל שקופית ולאחר תקופת דגירה של לכל היותר 10 דקות ב- RT. 
		הערה: הפתרון מדולל DAB צריך להיות מוכן טרי, ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 º C. זמן הדגירה יכול להיות מותאם כדי למזער את האות רקע אבל חייב להישמר זהה עבור כל השקופיות.</li>
		<li>להסיר הפתרון DAB על ידי שטיפה עם מים. Counterstain השקופיות עם פתרון מהיר אדום (מוכן להשתמש, ראה את הטבלה של חומרים) במשך 20 דקות לשטוף את השקופיות עם מים שוב בקצרה.</li>
		<li>מייבשים אותם עם אתנול 95% עבור 5 מ'ואחריו 100% אתנול, 2 x 5 דקות. לבסוף, לטעון את השקופיות הקשחת מהיר הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לצפות בשקופיות במיקרוסקופ בשדה בהיר בגיל 20 X כדי להימנע רקע. 
		הערה: פתרון מהיר אדום יכול להיות שמרו ב RT ומשמש מחדש לאחר סינון.</li>
	</ol></li></ol> 4. ניתוח, כימות <ol><li>SA-β-גל כמת <ol><li>סרוק את השקופיות ובחרו הסעיפים הכי טוב בכל שקופית המבוסס על תמונות נרכשות. להשתמש לפחות 2 סעיפים/ת א עבור כימות. לשפוט את המקטע &#39; s איכות המבוססת על רקמות תקינות, איכות של צביעת, ו counterstaining. עבור כימות, לבחור בין שני המקטעים באיכות הגבוהה ביותר עם המרחק אפשרי המקסימלי בין דגימות, אשר מאפשר ייצוג טוב יותר של SA-β-גל כימות לאורך כל השריר TA-</li>
		<li>כימות של SA-β-גל חיובי תאים ( איור 2).
		<ol><li>לקבוע הדירוג של גודל פיקסל על-ידי בחירה ידנית הקטן ביותר, את התאים SA-β-גל חיובי הגדול.
			<ol><li>פתחו את התמונה הדיגיטלית של השקופית סריקה באמצעות תוכנת ImageJ.</li>
				<li>הממשק, לחץ על &#39; ניתוח &#39; &#62; &#39; כלי &#39; &#62; &#39; רועי מנהל &#39; &#62; &#39; ניתוח &#39; &#62; &#39; קבע מדידה &#39; &#62; &#39; בחר אזור &#39;. השתמש בכלי בחירה ולהקיף הקטן ביותר ואת הכי חיובי SA-β-גל תא ולהוסיף אותו למנהל רועי על ידי לחיצה על &#39; הוסף &#39;. למדוד את גודל באמצעות &#39; מידה &#39; כפתור ולשמור את הערכים לשימוש מאוחר יותר.</li>
			</ol></li> <li>להתאים את הפרמטר סף כדי להבטיח כל התאים הגלויים חיובי נבחרו.
			<ol><li>להמיר התמונה סולם אפור על ידי לחיצה &#39; תמונות &#39; &#62; &#39; סוג &#39; &#62; &#39; 8 סיביות &#39; ( איור 2 א). בשלב הבא, ללכת &#39; תמונות &#39; &#62; &#39; התאם &#39; &#62; &#39; סף &#39;, להזיז את הסמן השני עד כל התאים SA-β-גל חיובי מכוסים בצבע אדום ( איור 2B) ולאחר מכן לחץ &#39; החל &#39;.</li>
				<li>ניתוח חלקיקים על-ידי לחיצה &#39; נתח &#39; &#62; &#39; חלקיקים לנתח &#39; &#62; &#39; גודל (פיקסל ^ 2) &#39;, והחלת את הערך המוגדר בשלב 4.1.2.1, הזן &#39; מעגליות &#39;: &#39; 0.00 1.00 &#39;, לחץ על &#39; בסדר &#39;; סיכום של כל מה חלקיקים שנספרו מוצג במנהל ROI ( איור דו-ממדי).</li>
			</ol></li> <li>להעביר את כל החלקיקים שנבחרו לתמונה המקורית. להתאים את הבחירה באופן ידני כדי להבטיח כימות מדויק. הוסף תאים חיוביים (חץ ירוק, איור 2E) ו/או להסיר תאים חיובי כוזב (חץ אדום, 2E איור). לבסוף, למדוד את השטח על ידי חלוקה לרמות באמצעות סעיף ( איור דו-ממדי) &#39; הכלי בחירה &#39;. לחץ על &#39; רועי מנהל &#39; &#62; &#39; הוסף &#39; &#62; &#39; מידה &#39;.</li>
			<li>חשוב, לנרמל את מספר התאים חיובי על-ידי האזור של המקטע.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog כמת <ol><li>לספור את התאים Nanog חיובי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באופן ידני בהגדלה X 20- 
		הערה: counterstaining מהר אדום מאפשר הערכה טובה של המורפולוגיה של שריר ת א. עם זאת, ההכתמה קלילה מאוד, חסר מתווה ברור של המקטע. הסורק לעיתים קרובות לא יצליח לזהות את הגבול של הסעיפים, לא יכול להתמקד כראוי. זה אפשרי להשתמש סמן בעיגול את הקצוות של הסעיפים לפני סריקה או להשתמש בסורק רגיש יותר לזהות את המקטע. עבור פרוטוקול הנוכחי, זה היעילה לספור את התאים חיובי Nanog באופן ידני.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+p16(Ink4a)-positive+cells+shorten+healthy+lifespan.">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype:+the+dark+side+of+tumor+suppression.">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li><li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure.">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA.">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li><li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo.">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li><li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle.">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li><li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration.">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features.">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li><li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation.">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li><li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection.">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury.">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528 (2015).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence?.">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?.</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li><li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SA+beta+Gal+staining:+biomarker+or+delusion.">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאן, אנו מציגים שיטה לאתר את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד של עכברים reprogrammable. ניתן להשתמש בשיטה זו להעריך לכמת בשני הזדקנות ביולוגית, זירוז פלסטיות הסלולר ויווושל לבחון את התפקיד של הזדקנות ביולוגית של רקמות תיקון והתחדשות.
בפרוטוקול הנוכחי, וזמינותו הזדקנות ביולו?...

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא צורה של התגובה לעקה מאופיין על ידי מעצר יציב של מחזור התא. בעשור האחרון, מחקר הקימה בחוזקה הזדקנות ביולוגית מזוהה עם תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים שונים כולל התפתחות, פיברוזיס של האורגניזם בתהליך ההזדקנות1,2. הזדקנות ביולוגית הסלולר זוהה לראשונה ב fibroblasts האנושי בסוף על תוחלת החיים שלהם replicative המופעלות על-ידי טלומר קיצור3. מלבד הלחץ replicative, ישנם הרבה גירויים אחרים, זה יכול לגרום הזדקנות ביולוגית, כולל ה-DNA נזק, סטרס חמצוני, אותות oncogenic גנומית/epigenomic תיקונים קטנים, שכל אחד מהם יכול בסופו של דבר להפעיל המסלולים p53/p21 ו/או pRB כדי לבסס ולחזק את מעצרו של צמיחה קבוע1. אחד המאפיינים החשובים של תאים senescent הוא שהם נשארים פעילים סמויה ו robustly אקספרס (SASP) הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה: הפרשת ציטוקינים דלקתיים רבים, גורמי גדילה ו מטריצה חוץ-תאית גורמים4. גורמים SASP הוצעו כדי לשחק תפקיד חשוב תיווכה ותגביר את אפקט הזדקנות ביולוגית, בגלל השפעתם חזק על משיכת תאים חיסוניים ושינוי המקומי ומערכתית רקמת milieus1. מעניין, הזדקנות ביולוגית הוצע לאחרונה להיות חשובה עבור רקמות תיקון והתחדשות5,6. בנוסף, נתונים מספר מעבדות, כולל שלנו, הציע כי רקמת נזק-induced הזדקנות ביולוגית יכול להגביר פלסטיות סלולרית, באמצעות SASPs, כדי לקדם התחדשות7–9. לכן, כל הנתונים המתעוררים להדגיש את החשיבות של לימוד הזדקנות ביולוגית בתוך vivo.
בעידן פוסט pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) פלסטיות הסלולר הוא הקיבולת של תא לרכוש זהות חדשה, לאמץ מגורל חלופי כאשר הם נחשפים לגירויים שונים ב- תרבות, אין ויוו10. זה ידוע כי התכנות מלאה יכולה להיות מושגת ויוו11,12, שבו הביטוי בקלטת המכיל ארבעה גורמים יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4ו- c-Myc (OSKM) יכול להיות מושרה ויוו לקדם היווצרות teratomas באיברים רבים. לכן, מודל העכבר reprogrammable (i4F) יכול לשמש מערכת חזקה כדי לזהות הרגולטורים קריטי מסלולים חשובים עבור הסלולר פלסטיות11.
מערכת מתאימה ורגיש ויוו הכרחי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מסדיר פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. כאן, אנו מציגים מערכת איתנה, פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הקשר בין הזדקנות ביולוגית פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. הנזק שריר שילוב של cardiotoxin (אקס) המושרה בקבוצה השריר השוקתי הקדמי (TA), מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות, המודל העכבר i4F, מאפשר הזיהוי של הזדקנות ביולוגית הסלולר והן vivo התכנות במהלך התחדשות השרירים.
כדי להעריך את הקשר בין הסלולר פלסטיות הזדקנות ביולוגית, עכברים i4F נפגע עם אקס כדי לגרום לנזק חריפה הינם מטופלים עם דוקסיציקלין (0.2 מ"ג/מ"ל) במשך 7 ימים כדי לגרום ויוו התכנות. אמנם אקס המושרה לנזק חריפה התחדשות פרוטוקול כבר שפורסמו לאחרונה13, מסיבות מוסריות, הליך זה יושמט בפרוטוקול הנוכחי. TA שריר מדגמים ייאספו בגיל 10 ימים שלאחר פגיעה13, כאשר השיא של תאים senescent בעבר נצפו14. . הנה, פרוטוקול מפורט זה מתאר את כל הצעדים הדרושים כדי להעריך את רמת הזדקנות ביולוגית (דרך SA-β-גל) ואת התיכנות (דרך IHC צביעת של Nanog).
הזדקנות ביולוגית-הקשורים בטא-galactosidase (SA-β-גל) וזמינותו היא וזמינותו הנפוצות ביותר לזהות senescent התאים שניכם תרבות, אין ויוו15. לעומת מבחני אחרים, וזמינותו SA-β-גל מאפשר הזיהוי של התאים senescent בסביבה הטבעית שלהם האדריכלות רקמות ללא פגע, אשר חשוב במיוחד למחקר ויוו . יתר על כן, זה אפשרי זוג וזמינותו SA-β-גל עם סמנים אחרים באמצעות IHC. עם זאת, וזמינותו SA-β-גל לדרוש את דגימות טרי או קפוא, הנשאר מגבלה עיקרית. כאשר רקמות טרי או קפוא זמינות באופן שגרתי, כגון דגימות שריר ת א קפואים, SA-β-גל היא כמובן וזמינותו המתאימים ביותר כדי לזהות תאים senescent. Nanog הוא הסמן להשתמש כדי לזהות תאים reprogramed משתי סיבות: 1) זה סמן חיוני עבור pluripotency; 2) ויותר חשוב, הביטוי שלה לא מונעת על ידי דוקסיציקלין (dox), ולכן הוא מזהה pluripotency המושרה במקום הביטוי כפויה בקלטת יאמאנאקה.
חשוב לציין, הפרוטוקולים מכתימים שהוצגו במחקר זה יכול להתבצע בנפרד כדי לפשט את ההליך כמת, אך ניתן לבצע גם הליך שיתוף מכתימים כדי להמחיש את שניהם senescent, גזע pluripotent על אותו סעיף.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>For inducing in vivo reprogramming</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, France</td><td>L8102</td><td>For muscle injury</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron microscopy science</td><td>50-980-487</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>NaCitrate : &lt;br/&gt;Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>Antibody anti- Nanog</td><td>Cell signalling</td><td>8822S</td><td>Rabbit monoclonal antibody</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>For Nanog revelation</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Fast red</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&amp;reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Microscope for Nanog quantification</td></tr><tr><td>Mouse: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Reprogrammable mouse model</td></tr><tr><td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>slides scanning</td></tr></tbody></table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא תגובה מתח זה מאופיין על ידי מעצר צמיחה סלולרי יציב, וזה חשוב עבור תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון סרטן, הזדקנות. לאחרונה, הזדקנות ביולוגית גם היה מעורב רקמות תיקון והתחדשות. לכן, זה הפך קריטי יותר ויותר לזהות תאים senescent ויוו. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל) assay הוא הבדיקה הנפוצה ביותר לזהות תאים senescent הן בתרבות והן ויוו. Assay הזה מבוסס על התכנים lysosomal מוגבר תאים senescent, מה שמאפשר זיהוי פתולוגיה lysosomal β-galactosidase פעילות ב- pH suboptimum (6 או 5.5). לעומת מבחני אחרים, כגון cytometry זרימה, זה מאפשר הזיהוי של תאים senescent בסביבתם תושב, המציע מידע בעל ערך כגון מיקום הנוגעים הארכיטקטורה רקמות, המורפולוגיה, ו האפשרות של צימוד עם סמנים אחרים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC). המגבלה העיקרית של SA-β-גל וזמינותו היא הדרישה של דגימות טרי או קפוא.
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מקדמת הסלולר פלסטיות ורקמות התחדשות בתוך vivo. אנו משתמשים SA-β-גל כדי לזהות תאים senescent בשריר השלד על פגיעה, אשר היא מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות. יתר על כן, אנו משתמשים IHC כדי לזהות Nanog, סמן של תאי גזע pluripotent, במודל של עכברים מהונדס. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבחון ולכמת הזדקנות ביולוגית הסלולר בהקשר של פלסטיות הסלולר המושרה ואת ויוו התכנות.

גילוי שריר הנוצרות על-ידי פגיעה הסלולר הזדקנות ביולוגית
זה לאחרונה הוכח כי פגיעה בשריר גורם הזדקנות ביולוגית הסלולר ארעי14. ב- 10 ימים לאחר פציעה (DPI), רוב myofibers פגום הם עוברים תהליך התחדשות עם גרעינים במיקום מרכזי, סימן היכר של רג?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

9.5K Views.  Institut Pasteur. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.

Video: Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

Genetics

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Bioengineering

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new muscle fibers under the right conditions. Although SCs can be harvested from muscle tissue and cultured in vitro, the resulting myoblast cells are not very effective in promoting myogenesis when transplanted into host muscle. Surgically exposing the host muscle and grafting segments of donor muscle tissue, or the isolated muscle fibers with their SCs onto host muscle, promotes better myogenesis compared to myoblast transplantation. We have developed a novel technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME involves passing a surgical needle through the host muscle, drawing a piece of donor muscle tissue through the needle track, and then leaving the donor tissue embedded in the host muscle so that it may act as a source of SCs for the host muscle. Here we describe in detail the steps involved in performing MIME in an immunodeficient mouse model that expresses a green fluorescent protein (GFP) in all of its cells. Immunodeficiency in the host mouse reduces the risk of immune rejection of the donor tissue, and GFP expression enables easy identification of the host muscle fibers (GFP+) and donor-cell-derived muscle fibers (GFP-). Our pilot data suggest that MIME can be used to implant an extensor digitorum longus (EDL) muscle from a donor mouse into the tibialis anterior (TA) muscle of a host mouse. Our data also suggest that when a myotoxin (barium chloride, BaCl2) is injected into the host muscle after MIME, there is evidence of donor-cell-derived myogenesis in the host muscle, with approximately 5%, 26%, 26% and 43% of the fibers in a single host TA muscle showing no host contribution, minimal host contribution, moderate host contribution, and maximal host contribution, respectively.

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

We describe a novel experimental technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME), which is based on the evidence that skeletal muscle tissue contains viable myogenic cells that can facilitate donor-cell-mediated myogenesis when implanted into a host muscle.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

Medicine

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Biology

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

קצירת שרירי שלד עכברים לתרבית תאי גזע והנישה שלהם

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

מחבר זרקור: פרוטוקול Ex Vivo לטיפוח תאי גזע שריר שקטים עם רכיבי נישה 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

יישומים של

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע