Name: evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

Wir sind verpflichtet, Clemire Cimper für ihre ausgezeichneten technischen Support. Arbeit im Labor von H.L wurde finanziert vom Institut Pasteur, Centre National Pour la Recherche Scientific, und die Agence Nationale De La Recherche (Laboratoire d ' Excellence Revive, Investissement Avenir; ANR-10-LABX-73), die Agence Nationale De La Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) und Fondation ARC (PJA 20161205028). C.c. und A.C. finanziert die Promotion und Postdoc-Stipendien aus dem Konsortium wieder zu beleben.

Tiere wurden gemäß den Leitlinien der Europäischen Gemeinschaft und der Ethik-Kommission des Institut Pasteur (CETEA) genehmigt Protokolle behandelt.
 1. Vorbereitungen für die Lager-Lösungen <ol><li>bereiten die Materialien für Muskel Probe Fixierung. Lösen Sie 0,5 g Tragant Kaugummi mit 20 mL Wasser bei RT das Einfrieren Einbettung Medium für Muskel-Fixierung machen.</li>
	<li>SA-β-Gal-Färbung der Lösungen vorbereiten.
	<ol><li>Bereiten die Stammlösungen von K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) durch die jeweiligen Pulver in destilliertem Wasser auflösen.</li>
		<li>Bereiten Vorratslösung 0,2 % C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eosin) von in Wasser verdünnen.</li>
		<li>Vorbereitung der Stammlösung C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) durch Auflösen der X-gal-Pulver in C 3 H 7 keine (Dimethylformamid, DMF).</li>
		<li>Store K 3 Fe(CN) 6 und K 4 Fe(CN) 6 Lösungen bei 4 ° C und MgCl 2 bei RT 
		Hinweis: X-gal kann in aliquoten bei-20 ° C bis zu 6 Monate gespeichert werden. Eosin-Lösung kann bei RT aufbewahrt und nach dem Filtern bei Bedarf wiederverwendet werden. K 3 Fe(CN) 6 und K 4 Fe(CN) 6 Lösungen sind Protectedfromthe Licht. X-gal-Lösung ist nicht stabil im Wasser und muss vor Licht geschützt werden.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der Lösungen für Nanog Färbung: die Permeabilisierung Lösung enthält 0,1 % Na 3 C 6 H 5 O 7 (Trinatrium Citrat), 0,1 % C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton x-100) in destilliertem Wasser, sollten die gespeichert werden, bei 4 ° c bereiten Sie die blockierende Lösung mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die bei RT gespeichert werden sollen</li>
</ol> 2. SA-β-Gal-Färbung auf gefrorene TA Muscle Section <ol><li>bereiten das Befestigungsmaterial für den TA-Muskel indem man eine kleine Menge der Tragant Kaugummi auf ein Stück Kork.</li>
	<li>Verletzte Mäusen beiderlei Geschlechts (2 Monate alt, C57/B6) wurden 10 Tage vor mit Cardiotoxin (CDX) verletzt, wie zuvor beschrieben 13. Verwenden Sie nicht verletzt (PBS-Injektion) TA von der gleichen Maus, als die negativ-Kontrolle. Nach Wunsch in Vivo Umprogrammierung behandeln jede Maus mit Dox (1 mg/mL) im Trinkwasser am selben Tag (lichtgeschützt), direkt nach einer Verletzung CTX. 
	Hinweis: Die Dox-Lösung alle 3 Tage für eine vollständige Behandlung dauert 7 Tage geändert werden soll.
	<ol><li>Beide TA Muskeln (verletzt und Steuern) von Mäusen wie zuvor beschrieben ( Abbildung 1A) 13 isolieren. Zu gewährleisten die Querschnitte, legen die distale Sehne des Muskels TA in der Gum Tragant und verlassen etwa ¾ Teil des Muskels vor ( Abbildung 1 b) und Einfrieren in flüssigem Stickstoff gekühlt Isopentane für &#60; 1 min. 
		Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der TA-Muskel in eine senkrechte Position und in der Mitte des Korkens. Proben können bei-80 ° C oder direkt Cryosectioned in 10 µm Abschnitten gelagert werden.</li>
	</ol></li> <li>TA Muskeln zu verarbeiten, wie in der Abbildung 1 b.
	<ol><li>Verteilen die 1 St-10 th Abschnitte in der richtigen Reihenfolge auf zehn verschiedene Folien an der oberen linken Position der einzelnen Folien. Platzieren Sie Abschnitt 11 th neben Abschnitt 1 St auf der ersten Folie; Abschnitt 12 th folgen die gleiche Reihenfolge rechts neben den 2 Nd-Abschnitt auf der zweiten Folie platziert werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis 10 Sektionen/Folie ergeben sich für zehn Folien (100 Abschnitten insgesamt) um mindestens 1 mm Abstand zwischen dem ersten und den letzten Abschnitt zu gewährleisten.</li>
	</ol></li> <li>In den Abschnitten 4 min in PBS mit 1 % Paraformaldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd zu beheben. Waschen Sie mit PBS, 2 x 10 min. Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer (pH = 5,5) für 30 min. alle Schritte bei RT 
	Hinweis: Die Fixierung ist mild, enzymatische Aktivität beizubehalten. Führen Sie diesen Schritt unter der Haube. Der pH-Wert des öffentlich-rechtlichen Rundfunks ist entscheidend und die X-gal-Lösung muss vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Inkubieren Abschnitte in der X-gal-Lösung enthält: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 und 400 µg/mL X-Gal mit PBS-Puffer, pH = 5,5. Im Dunkeln bei 37 ° C für mindestens 24 Std. Waschen die Folien mit PBS, 3 x 10 min bei RT inkubieren 
	Hinweis: Die Inkubation erfordert ein Minimum von 24 Stunden und dauert 48 Stunden um das SA-β-Gal-Signal zu maximieren. Die Lösung muss nach 24 Stunden Inkubation geändert werden. Die Folien sollten vor Licht geschützt werden. Wenn nur SA-β-Gal-Färbung gewünscht wird, fahren Sie mit Schritt 2.5. Wenn Co Färbung mit Nanog gewünscht wird, bitte vorwärts überspringen Sie Schritt 3.1.</li>
	<li>Fix Folien in 1 % Paraformaldehyd in PBS für 30 min. Waschen gleitet mit PBS, 3 x 10 min. Gegenfärbung mit 0,2 % Eosin. Tauchen Sie die Folien in der Eosin-Lösung für 1 min und kurz mit destilliertem Wasser abspülen. Zu guter Letzt montieren die Folien mit wässrigen nicht fluoreszieren Eindeckmedium (siehe Tabelle der Werkstoffe). 
	Hinweis: Es ist wichtig, die Post-Fixierung durchführen. Führen Sie diesen Schritt unter der Haube. Alle Schritte werden ausgeführt, bei RT</li>
</ol> 3. Immunohistochemistry mittels Anti-Nanog Antikörper <ol><li>befestigen Sie die Folien mit PBS mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min. Waschen mit PBS, 2 x 10 min. Fügen Sie 200 µL der Permeabilisierung Lösung direkt auf die Folien und 5 min inkubieren. <ol><li>Wash Folien mit PBS, 2 x 5 min. und in der letzten Wäsche, Nutzung 200 µL PBS mit 0,25 % BSA direkt auf den Folien. Führen Sie diese Schritte bei RT 
		Achtung: Führen Sie die Fixierung Schritt unter der Haube.</li>
	</ol></li> <li>Inkubieren Folien mit dem primären Anti-Nanog Antikörper (Endkonzentration: 1,25 Ug/mL) über Nacht bei 4 ° C in PBS mit 5 % FBS. Objektträger mit PBS, 2 x 10 min waschen und in der letzten Wäsche Gebrauch 200 µL PBS mit 0,25 % BSA für 5 min. Perform Schritte das Waschen bei RT 
	Hinweis: Inkubieren Sie Folien in einer Box mit feuchten Papiertuch um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Folien mit 100 µL der rAb-HRP Sekundärantikörper aus eine gebrauchsfertige kit (siehe Tabelle der Materialien), für 45 min. Waschen mit PBS, 3 x 5 min, zu Folien Sekundärantikörper zu entfernen. Alle Schritte bei RT mit Schutz vor Licht.</li>
	<li>Visualisierung <ol><li>zuerst, verdünnen die 3,3 &#39;-Diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) im Substratpuffer durch die gebrauchsfertige Kit (20 µL DAB für 1 mL Substrat Pufferlösung) bereitgestellt. 100 µL der DAB-Lösung direkt in jede Folie hinzufügen und maximal 10 min bei RT inkubieren 
		Hinweis: Die verdünnte Lösung DAB sollte frisch zubereitet werden und kann bis zu einer Woche bei 4 ° c gelagert werden Die Inkubationszeit kann angepasst werden, um das Hintergrundsignal zu minimieren aber das gleiche für alle Folien gehalten werden müssen.</li>
		<li>Die DAB-Lösung durch das Ausspülen mit Wasser entfernen. Counterstain den Folien mit schnell rote Lösung (bereit zu verwenden, siehe die Tabelle der Materialien) für 20 min. Waschen die Folien mit Wasser noch einmal kurz.</li>
		<li>Entwässern sie mit 95 % igem Ethanol für 5 min 100 % Ethanol, 2 x 5 min. gefolgt. Zu guter Letzt montieren Sie die Folien mit schnell aushärtende Eindeckmedium (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
		<li>Beobachten die Folien unter dem Mikroskop im Hellfeld bei 20 X Hintergrund zu vermeiden. 
		Hinweis: Schnell rote Lösung kann bei RT gehalten und nach dem Filtern wiederverwendet.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse und Quantifizierung <ol><li>SA-β-Gal Quantifizierung <ol><li>Dias scannen und wählen die besten Abschnitte auf jeder Folie anhand der aufgenommenen Bilder. Verwenden Sie mindestens 2 Abschnitte/TA für die Quantifizierung. Beurteilen im Abschnitt &#39; s-Qualität basiert auf Gewebe Integrität, Qualität der Färbung und der Gegenfärbung. Wählen Sie für die Quantifizierung der höchsten Qualität zweiteilig mit die maximale Distanz zwischen Proben, ermöglicht bessere Darstellung des SA-β-Gal Quantifizierung in der ganzen TA Muskel.</li>
		<li>Quantifizierung der SA-β-Gal-positiven Zellen ( Abbildung 2).
		<ol><li>Bestimmen den Rang eines die Pixelgröße von manuell auswählen, die kleinste und die größte positive SA-β-Gal-Zellen.
			<ol><li>Öffnen Sie das digitale Bild des gescannten Dias mit ImageJ-Software.</li>
				<li>In der Benutzeroberfläche, klicken Sie &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; Tools &#39; &#62; &#39; ROI Manager &#39; &#62; &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; Messung eingestellt &#39; &#62; &#39; wählen Sie Bereich &#39;. Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und surround-die kleinste und größte positive SA-β-Gal Zell und fügen sie Sie des ROI-Managers durch Klicken auf &#39; Add &#39;. Messen der Größen, die mit der &#39; Maßnahme &#39; button und speichern Sie die Werte für den späteren Gebrauch.</li>
			</ol></li> <li>Einstellen des Parameters "Schwelle" gewährleisten die sichtbaren positiven Zellen ausgewählt sind.
			<ol><li>Convert Graustufen durch Klicken auf das Bild &#39; Bild &#39; &#62; &#39; Typ &#39; &#62; &#39; 8-Bit &#39; ( Abbildung 2A). Als nächstes gehen Sie zu &#39; Bild &#39; &#62; &#39; einstellen &#39; &#62; &#39; Schwelle &#39;, den zweiten Cursor bis rot ( Abb. 2 b) die positive SA-β-Gal-Zellen bedeckt sind, und klicken Sie dann &#39; anwenden &#39;.</li>
				<li>Analysieren Partikel durch Klicken auf &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; analysieren Partikel &#39; &#62; &#39; Größe (Pixel ^ 2) &#39;, und den Wert im Schritt 4.1.2.1 definiert anzuwenden, geben Sie &#39; Zirkularität &#39;: &#39; 0,00-1,00 &#39;, klicken Sie &#39; ok &#39;; eine Zusammenfassung aller die gezählten Partikel zeigt sich in der ROI-Manager ( Abb. 2D).</li>
			</ol></li> <li>Die ausgewählten Partikel auf das ursprüngliche Bild übertragen. Passen Sie die Einstellungen manuell, um genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Fügen Sie positive Zellen (grüner Pfeil, Abb. 2E hinzu) bzw. Entfernen Sie falsche positive Zellen (roter Pfeil, Abb. 2E). Messen Sie schließlich den Bereich umreißen den Abschnitt ( Abb. 2D) mit der &#39; Auswahl-Werkzeug &#39;. Klicken Sie &#39; ROI-Manager &#39; &#62; &#39; Add &#39; &#62; &#39; Maßnahme &#39;.</li>
			<li>Wichtiger ist, die Anzahl der positiven Zellen durch die Fläche des Abschnitts zu normalisieren.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog Quantifizierung <ol><li>zählen die Nanog positive Zellen unter dem Mikroskop im hellen Bereich manuell mit 20 X Vergrößerung. 
		Hinweis: Schnell rot Gegenfärbung ermöglicht gute Beurteilung der Morphologie des TA-Muskels. Aber die Färbung ist sehr leicht und fehlt eine klare Gliederung des Abschnitts. Der Scanner oft nicht die Grenze der Abschnitte identifizieren und kann nicht richtig konzentrieren. Es ist möglich, verwenden Sie Marker, um Kreis die Kanten der Teile vor dem Scannen oder einen empfindlicheren Scanner verwenden, um den Abschnitt zu erkennen. Für das aktuelle Protokoll ist es am effizientesten, die Nanog positive Zellen manuell zählen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Hier stellen wir eine Methode, um beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur programmierbar Mäuse. Diese Methode kann verwendet werden, bewerten beide Seneszenz zu quantifizieren und induzieren zelluläre Plastizität in Vivound untersuchen die Rolle der Seneszenz in Gewebe-Reparatur und Regeneration.
In dem aktuellen Protokoll dient der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay in Vivo seneszenten Zellen in der Skelettm...

Zelluläre Seneszenz ist eine Form von Stress-Reaktion zeichnet sich durch eine stabile Zellzyklus Festnahme. In den letzten zehn Jahren hat Forschung etabliert, dass Seneszenz mit verschiedenen biologischen und pathologische Prozesse einschließlich der Embryonalentwicklung, Fibrose und Organismus Altern1,2verbunden ist. Zelluläre Seneszenz wurde zuerst in menschlichen Fibroblasten am Ende ihrer replikativen Lebensdauer ausgelöst durch Telomerverkürzung3gekennzeichnet. Neben replikativen Stress gibt es viele andere Reize, die Seneszenz, einschließlich DNA-Schäden, oxidativer Stress, onkogenen Signale und genomische/epigenomischen Veränderungen, die schließlich die p53/p21 und/oder pRB Wege zum aktivieren kann auslösen können Aufbau und die Konsolidierung der permanenten Wachstums Verhaftung1. Eines der wichtigen Merkmale der alternde Zellen ist, dass sie metabolisch aktiv bleiben und kräftig einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP ausdrücken): Sekretion von inflammatorischen Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrix Faktoren-4. SASP Faktoren sind vorgeschlagen worden, um eine wichtige Rolle bei der Vermittlung und Verstärkung des Seneszenz Effekts aufgrund ihrer potenten Wirkung auf Immunzellen zieht und lokale und systemische Gewebe Milieus1zu verändern. Interessanterweise hat Seneszenz vor kurzem vorgeschlagen worden, für Gewebe Reparatur und Regeneration5,6wichtig sein. Darüber hinaus hat die Daten aus mehreren Labors, einschließlich der unsrigen, vorgeschlagen, dass Gewebe Schaden-Induzierte Seneszenz zellulärer Plastizität, über SASPs, Förderung der Regeneration7–9verbessern könnte. Daher, die entstehenden Daten unterstreichen die Bedeutung des Studiums Seneszenz in Vivo.
In der Post-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Ära ist zelluläre Plastizität die Fähigkeit einer Zelle, eine neue Identität zu erwerben und eine alternative Schicksal wenn verschiedene Reize in Kultur und in Vivo10ausgesetzt zu verabschieden. Es ist bekannt, dass vollständige Neuprogrammierung kann erreicht in Vivo11,12, wo der Ausdruck der der Kassette mit vier Yamanaka Faktoren: Oct4, Sox2, Klf4und c-Myc (OSKM) kann induzierte in Vivo , darum Bildung in mehreren Organen zu fördern werden. Daher ein programmierbar Mausmodell (i4F) als ein leistungsfähiges System lässt sich identifizieren wichtige Regulatoren und Signalwege, die für die zelluläre Plastizität11wichtig sind.
Eine geeignete und sensibel in Vivo -System ist wichtig zu verstehen, wie zelluläre Seneszenz reguliert zelluläre Plastizität im Zusammenhang mit der Geweberegeneration. Hier präsentieren wir Ihnen ein robustes System und ein detailliertes Protokoll, das Bindeglied zwischen Seneszenz und zelluläre Plastizität im Zusammenhang mit der Geweberegeneration zu bewerten. Die Kombination von Cardiotoxin (CTX) induzierte Schädigung der Muskulatur in den m. Tibialis Anterior (TA) Muskel-Gruppe, ein etabliertes System, Geweberegeneration und i4F Mausmodell zu studieren ermöglicht die Erkennung von zellulären Seneszenz und in vivo Umprogrammierung während der Muskelregeneration.
Um die Verbindung zwischen zelluläre Plastizität und Seneszenz zu bewerten, i4F Mäuse mit CTX induzieren akute Muskelschäden verletzt und behandelt mit Doxycyclin (0,2 mg/mL) innerhalb von 7 Tagen, in Vivo Umprogrammierung zu induzieren. Während eine CTX akuten Muskelschäden induzierten und Regeneration Protokoll kürzlich veröffentlichten13, aus ethischen Gründen wurde, wird dieses Verfahren in das aktuelle Protokoll weggelassen werden. TA-Muskel-Proben werden bei 10 Tagen Post Verletzungen13, erhoben, wenn der Höhepunkt der alternde Zellen wurden bisher14beobachtet. Dieses ausführliche Protokoll beschreibt hier, alle erforderlichen Schritte, um die Ebene der Seneszenz (über SA-β-Gal) und Neuprogrammierung (über IHC beflecken von Nanog) zu bewerten.
Seneszenz-assoziierten Beta-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay ist die am häufigsten verwendeten Assay, beide seneszenten Zellen in Kultur und in Vivo15zu erkennen. Im Vergleich zu anderen Tests, ermöglicht der SA-β-Gal-Test die Identifikation der alternde Zellen in ihrer natürlichen Umgebung mit intaktem Gewebearchitektur, die besonders wichtig für in-Vivo -Studie ist. Darüber hinaus ist es möglich, die SA-β-Gal-Assay mit anderen Markern mit IHC zu koppeln. Allerdings erfordert der SA-β-Gal-Assay frische oder gefrorene Proben, bleibt eine große Einschränkung. Wenn frisches oder gefrorenes Gewebe wie gefrorene TA Muskel Proben routinemäßig verfügbar sind, ist SA-β-Gal offensichtlich die am besten geeigneten Assay seneszenten Zellen zu erkennen. NANOG ist der Marker verwendet, um neuprogrammiert Zellen aus zwei Gründen: 1) Es ist eine wesentliche Marker für Pluripotenz; (2) Darüber hinaus seinen Ausdruck wird nicht durch Doxycyclin (Dox) angetrieben, deshalb erkennt es induzierten Pluripotenz anstatt der erzwungenen Ausdruck der Yamanaka-Kassette.
Es ist wichtig zu beachten, die Färbung Protokolle präsentiert in dieser Studie können separat durchgeführt werden, um die Quantifizierung Verfahren zu vereinfachen, sondern können auch in eine Co Färbeverfahren, beide seneszenten zu visualisieren und pluripotente Stammzellen im selben Abschnitt durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>For inducing in vivo reprogramming</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, France</td><td>L8102</td><td>For muscle injury</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron microscopy science</td><td>50-980-487</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>NaCitrate : &lt;br/&gt;Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>Antibody anti- Nanog</td><td>Cell signalling</td><td>8822S</td><td>Rabbit monoclonal antibody</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>For Nanog revelation</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Fast red</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&amp;reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Microscope for Nanog quantification</td></tr><tr><td>Mouse: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Reprogrammable mouse model</td></tr><tr><td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>slides scanning</td></tr></tbody></table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

Zelluläre Seneszenz ist eine Stress-Reaktion zeichnet sich durch ein stabiles Zellwachstum Verhaftung, die für viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Krebs und Altern wichtig ist. Vor kurzem hat Seneszenz auch in Gewebe-Reparatur und Regeneration verwickelt. Daher ist es immer entscheidend, alternde Zellen in Vivozu identifizieren geworden. Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay ist die am häufigsten verwendeten Assay, alternde Zellen in Kultur und in Vivozu erkennen. Dieser Assay basiert auf den erhöhten lysosomale Inhalt in den seneszenten Zellen, wodurch die histochemische Erkennung von lysosomalen β-Galaktosidase Aktivität bei bedenklich pH (6 oder 5,5). Im Vergleich zu anderen Tests, z. B. Durchflusszytometrie, dies erlaubt die Identifikation der alternde Zellen in ihrem Wohnsitz Umfeld, bietet wertvolle Informationen wie die Lage in Bezug auf die Gewebearchitektur, der Morphologie und der Möglichkeit der Kopplung mit anderen Markern über immunhistochemische (IHC). Die größte Beschränkung des SA-β-Gal-Assays ist die Anforderung von frischen oder gefrorenen Proben.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll um zu verstehen, wie zelluläre Seneszenz fördert zelluläre Plastizität und Tissue Regeneration in Vivo. Wir verwenden SA-β-Gal um zu erkennen seneszenten Zellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen, die ein etabliertes System, Geweberegeneration zu studieren ist. Darüber hinaus verwenden wir IHC Nanog, eine Markierung von pluripotenten Stammzellen in einem transgenen Mausmodell zu erkennen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, prüfen und zelluläre Seneszenz im Rahmen des induzierten zelluläre Plastizität und in Vivo Umprogrammierung zu quantifizieren.

Erkennung von Muskel-Verletzungen-induzierte zellulären Seneszenz
Es wurde kürzlich nachgewiesen, dass Muskelverletzung transiente zellulären Seneszenz14induziert. 10 Tage nach der Verletzung (DPI) der Großteil der beschädigten Myofibers sind in der Regeneration mit zentral gelegenen Kerne, ein Markenzeichen Myofibers, zu regenerieren und die Architektur des Muskels ist wieder hergestellt. Die eindringe...

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

9.5K Aufrufe.  Institut Pasteur. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.

Serie: Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

Analyse der Satellitenzellfunktion während der Skelettmuskelregeneration durch Kardiotoxinverletzung und Injektion von selbstliefernder siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

Genetik

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biotechnik

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new muscle fibers under the right conditions. Although SCs can be harvested from muscle tissue and cultured in vitro, the resulting myoblast cells are not very effective in promoting myogenesis when transplanted into host muscle. Surgically exposing the host muscle and grafting segments of donor muscle tissue, or the isolated muscle fibers with their SCs onto host muscle, promotes better myogenesis compared to myoblast transplantation. We have developed a novel technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME involves passing a surgical needle through the host muscle, drawing a piece of donor muscle tissue through the needle track, and then leaving the donor tissue embedded in the host muscle so that it may act as a source of SCs for the host muscle. Here we describe in detail the steps involved in performing MIME in an immunodeficient mouse model that expresses a green fluorescent protein (GFP) in all of its cells. Immunodeficiency in the host mouse reduces the risk of immune rejection of the donor tissue, and GFP expression enables easy identification of the host muscle fibers (GFP+) and donor-cell-derived muscle fibers (GFP-). Our pilot data suggest that MIME can be used to implant an extensor digitorum longus (EDL) muscle from a donor mouse into the tibialis anterior (TA) muscle of a host mouse. Our data also suggest that when a myotoxin (barium chloride, BaCl2) is injected into the host muscle after MIME, there is evidence of donor-cell-derived myogenesis in the host muscle, with approximately 5%, 26%, 26% and 43% of the fibers in a single host TA muscle showing no host contribution, minimal host contribution, moderate host contribution, and maximal host contribution, respectively.

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

We describe a novel experimental technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME), which is based on the evidence that skeletal muscle tissue contains viable myogenic cells that can facilitate donor-cell-mediated myogenesis when implanted into a host muscle.

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

Medizin

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Biologie

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

Gewinnung von Skelettmuskeln der Maus zur Kultivierung von Stammzellen und ihrer Nische

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

Autor im Rampenlicht: Ex-vivo-Protokoll zur Kultivierung ruhender Muskelstammzellen mit Nischenkomponenten 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Analyse der Satellitenzellfunktion während der Skelettmuskelregeneration durch Kardiotoxinverletzung und Injektion von selbstliefernder siRNA In Vivo

Anwendungen

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe