המחבר מבקש להודות אנט Blak רסמוסן, קריסטין מולר התמיכה הטכנית שלהם

האוסף של דגימות עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוח פלסטי מחייב אישור מן הוועדה האתית במוסדות המארח. פרוטוקול זה אושרה על ידי אזורי אתית הוועדה של אזור Midtjylland, דנמרק (M-20110027). השיטה המתוארת כאן נגזר ממחקרים דומים על ידי. Maciaq et al. 10 ו ליו, Karasek11.
1. בידוד של Keratinocytes מהעור האנושי
<ol>
	<li>נתחיל בכך את הפתרונות הבאים: 50 מ ל תמיסת גלוקוז טריפסין, 0.1% 0.25% ב- DPBS. מיקס ומסנן לחטא (0.2 µm) הפתרון. הכינו 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS פתרון, 50 מ של DPBS ותקין ללא סרום בינוני (KSFM). להוסיף 500 מ"ל של KSFM KSFM תוספי תזונה ו- 250 µL של gentamycin. לחמם את הפתרונות 37 ° C לפני השימוש.</li>
	<li>לאסוף עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוחים פלסטיים. הדגימות העור בשימוש כ 10 ס"מ x 15 ס מ, אך יכול להשתנות בגודלו. שמור הקריר העור תחת תחבורה על ידי הובלת את העור הדגימות בקופסת קלקר המכילה קירור. במידת הצורך, דוגמית העור ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להסיר שומן מן תחת המקטע העור באמצעות מספריים מעוקר, כמו מה, אזמל, מלקחיים.</li>
	<li>אבזם את המקטע העור (כ 10 ס"מ על 15 ס"מ) על כיסוי סטרילי על גבי צלחת באמצעות מחטים. ראשית, לנקות את העור עם כרית יבשה גאזה מעוקר. לאחר מכן לנקות את העור באמצעות כרית סטיריליים גזה עם 70% אתנול.</li>
	<li>באמצעות פלנר רגל, חתך של השכבה העליונה (האפידרמיס) של המקטע העור ושם אותו בתוך 9 ס מ פטרי. לאחר מכן, מיד להוסיף 25 מ של הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז (להכין בשלב 1.1) צלחת פטרי. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>באמצעות פיפטה להסיר את הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז הפטרי ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS כדי להשבית את טריפסין.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים שני, עכשיו שחרר את התאים באפידרמיס לתוך האמצעי על ידי גירוד ובעדינות לזעזע את אפידרמיס והן תא עורי של הסעיפים העור.</li>
	<li>לסנן את המתלים תאים באפידרמיס דרך פילטר מתכת (גודל החור של 1 מ מ), ולאסוף בשפופרת 50 מ. להוסיף הסעיפים הנותרים העור שפופרת 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של RPMI-1640 ללא FBS ו מערבולת למסנן ס' 10 ההשעיה דרך המתכת לסנן לתוך צינור 50 מ ל המכיל את המתלים תאים באפידרמיס. להוסיף DPBS הנפח הכולל של 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תאים באפידרמיס כ- 10 מ"ל של 37 ° C KSFM בהתאם לגודל בגדר התא. לספור את התאים באמצעות התכלת Trypan מכתים שיטת תחת מיקרוסקופ. מספר התאים המתקבל מקטע העור 10 ס"מ על 15 ס"מ הוא כ 50-100 x 106 תאים. את כל הבקבוק תרבות2 75 ס מ, העברת תאים6 8 x 10 יחד עם 12 מ של 37 ° C KSFM. ללחוץ בעדינות את המבחנות תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של תאי.</li>
	<li>דגירה של keratinocytes ב חממה 37 ° C עם 100% לחות ו-5% CO2. לשנות את המדיום ואחרי יומיים שלוש פעמים בשבוע. מעבר תאים כאשר 70-80% confluent, אשר לוקח כשבועיים תלוי קצב התפשטות keratinocytes התרבות.</li>
</ol>
2. passaging של Keratinocytes
<ol>
	<li>מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 4.5 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות 75 ס מ2 .</li>
	<li>הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 4.5 מ ל/75 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.</li>
	<li>כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוק תרבות נגד היד כדי לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 6 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס)2 . הבקבוק תרבות 75 ס מ, להעביר התליה תא צינורות 50 מ.</li>
	<li>לשטוף את המבחנות תרבות עם 3 מ"ל של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. צנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.
	<ol>
		<li>Resuspend תאי pelleted 10 מ"ל של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לספור את התאים ולהעביר 3 x 106 תאים בקבוקון תרבות 150 ס"מ2 יחד עם 20 מ של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לנער בעדינות את הבקבוק תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים. להקפיא את התאים כאשר התרבות היא 80-90% confluent, אשר לוקח כ 4-6 ימים בהתאם קצב התפשטות keratinocytes (ראה סעיף 3, הקפאת פרוטוקול להלן). הרחב את keratinocytes ליצירת מניות קפוא המתאים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. הקפאת Keratinocytes
<ol>
	<li>מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 9 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות2 150 ס"מ.</li>
	<li>הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 9 מ ל/150 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.</li>
	<li>כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוקון תרבות נגד היד על מנת לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 12 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס) הבקבוקון תרבות של2 ס מ 150, תשאף התליה תא ל 50 מ ל צינורות.</li>
	<li>לשטוף את המבחנות תרבות עם 6 מ של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. Centrifuge צינורות 10 דקות ב g x 450-4 מעלות צלזיוס. הכן תא קר כקרח קפוא בינוני (KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>Resuspend בגדר תא KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד לספור את התאים, הקפאת תאים על צפיפות של 6 x 106 תאים למ"ל באמצעות שיטות הקפאה קריוגנית קירור איטי תקן12.</li>
	<li>לאחסן את keratinocytes בחנקן נוזלי (אדי שלב) עד מוכן לשימוש.</li>
</ol>
4. מפשיר ו Culturing Keratinocytes קפוא
<ol>
	<li>במהירות להפשיר את הבקבוקונים קפוא המתאים באמבט מים 37 ° C. השתמש 70% אתנול לנקות את החלק החיצוני של cryovial. להעביר מספר מתאים של תאים (כ- 15,000 תאים/cm2) בקבוקון תרבות ולהוסיף מיד מדיום הגידול ומחוממת מראש (KSFM) הבקבוקון תרבות. ניתן להשתמש בכל גודל של תרבות מבחנות בהתאם הכיוונון של הניסוי.</li>
	<li>השתמש בינוני תרבות 5 מ"ל בקבוקון תרבות2 25 ס מ.</li></ol>מספר התאים הוסיף שהבקבוקון תרבות עשויות להשתנות כי הצמיחה של התאים משתנה התורם תורם. דגירה בתאים 37 ° C חממה עם 100% לחות ו-5% CO2.
	<li>שינוי המדיום לאחר יומיים, שלוש פעמים מדי שבוע באמצעות KSFM מראש ומחוממת טריים. הערה: הנתונים שלנו הראו כי בממוצע 95% של תאים מבודדים באמצעות פרוטוקול המתוארים כאן הם חיוביים עבור cytokeratine-14 תקין-מרקר13.</li>

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes:+key+immunocytes+of+the+integument.">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions.">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li><li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases.">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li><li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation.">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li><li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+(MMP-1)+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes.">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li><li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes.">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li><li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth:+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes.">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li><li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation.">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li><li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture.">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin.">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2008).</li><li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent.">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li><li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

. המחבר יש אין ניגוד אינטרסים.

כאן, אנו נתאר כיצד לבודד בקלות keratinocytes האדם העיקרי מן העור למבוגרים, וכיצד תרבות אותם במבחנה. מודל זה יכול להיות יישום נרחב לחקירה של ביולוגיה של התא עוריות ולאחר יכול להיות שימושי עבור מהחוקרים המעוניינים ללמוד מחלות עורית.
חלק מהיתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הוא בנ?...

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף האדם ומשמש מחסום מגן מפני הסביבה החיצונית. העור מורכב שתי שכבות עיקריות: דרמיס לאפידרמיס, איפה האפידרמיס מהווה את השכבה החיצונית ביותר של העור. הסוג הנפוץ ביותר תאי האפידרמיס הוא keratinocytes הכוללת יותר מ 95% של מסה1,תא2. Keratinocytes נשמרים בשלבים שונים של בידול האפידרמיס, מאורגנים לשכבות הבזליים, spinous, פרטנית ו cornified התואמים בשלבים מסוימים של בידול3. התפקיד העיקרי של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך לייצר מחסום שלם לעולם החיצון.
Keratinocytes לייצג גם את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בעור, לכן יש תפקיד חשוב ב4,תגובה חיסונית מולדת5. חשיפת keratinocytes לגירויים חיצוניים מוביל ההפעלה של איתות המסלולים תאיים ובעקבות כך, ייצור של מספר מתווכים דלקתיים שונים, לרבות ציטוקינים, נוגדנים פפטידים מיקרוביאלית. חלבונים אלה נגזר תקין להשתתף בתגובה דלקתית על ידי גיוס והפעלת תאים חיסוניים כגון תאים דנדריטים, נויטרופילים ספציפי T תאים6,7. לכן, בגלל keratinocytes לשחק תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים רבים, הרציונל מאחורי הטכניקה המובאת כאן היה ליצור מודל במבחנה ללמוד ביולוגיה העור. תרבויות תקין ראשוני המתקבל העורלה neonatal משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד העור-ביולוגיה-8,-9. עם זאת, עם הטכניקה המתוארת כאן, keratinocytes של שני המינים מתקבלים וכתוצאה מכך מגוון ביולוגי גבוה יותר של התאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על בידוד ועל הדור של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, כולל תחזוקה, הקפאה של keratinocytes. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר ראשי keratinocytes אנושי שיכול לשמש כמודל ללמוד ביולוגיה עורית חוץ גופית בתוך.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17005-034</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM supplements</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37000-015</td>
			<td style="width:167px;">Supplements for KSFM</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">DPBS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:167px;">Dimethyl sulfoxid</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15710-049</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium additive</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sterilization filter</td>
			<td style="width:119px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:167px;">Syringe filter with a pore size of 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7409</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7528</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-010</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td style="width:167px;">Used to inactivate trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Forceps from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Scissors from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:119px;">Swann Morton</td>
			<td style="width:119px;">0501</td>
			<td style="width:167px;">Scalpels from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gauze pads</td>
			<td style="width:119px;">NOBAMED</td>
			<td style="width:119px;">875420</td>
			<td style="width:167px;">Gauze pads from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Foot planer</td>
			<td style="width:119px;">Credo Solingen</td>
			<td style="width:119px;">1510</td>
			<td style="width:167px;">Foot planer from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:119px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td style="width:167px;">Petri dishes from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Metal filter</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">In-house 1 mm hole size metal filter</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">156499</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">150 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">TTP</td>
			<td style="width:119px;">90151</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells when passaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

הפונקציה העיקרית של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך שומר על מחסום מכני אל העולם החיצון. בנוסף, keratinocytes ממלאות תפקיד חיוני החניכה, תחזוקה, רגולציה של תגובות חיסוניות עוריות באופן אקטיבי של מערכת החיסון המולדת להגיב לגירויים antigenic בצורה מהירה, לא ספציפית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור בידוד של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, ומדגימים כי תאים אלה מגיבים סידן-induced התמיינות סופנית, כפי שנמדדה על ידי ביטוי מוגבר של involucrin סמן בידול. בנוסף, אנו מראים כי keratinocytes מבודדים הם מגיבים IL-1β-induced הפעלת איתות המסלולים תאיים כפי שנמדד על-ידי הפעלת מסלול MAPK p38. יחדיו, נתאר שיטת בידוד, culturing של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. מאחר keratinocytes הן סוג התא השולט האפידרמיס, שיטה זו שימושית לחקור את המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית בתוך חוץ גופית.

סידן-induced התמיינות סופנית Keratinocytes האדם עוברים התמיינות סופנית בעת טיפול עם סידן14,15,16. ראשי keratinocytes האנושי היו מבודדים ותרבותית כמפורט בפרוטוקול לעיל. כאשר כ 50-60% confluent, התאים היו מגורה עם סידן (1.2 מ מ) או הרכב ותמונות של התאים צולמו ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin at JoVE.com

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.2K Views.  Aarhus University Hospital. העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.

Video: Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...