עבודה זו ממומנת על ידי NIH / NCI מענק R01CA-118916

1. תמצית גזע תאים אפיתל של העור האנושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים את ההליך של בידוד בתאי גזע אפיתל אחד צריך להכין את במדיות בהתאמה ריאגנטים (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוגר טרי אדם עור הקרקפת מהנהלים מתיחת פנים או אגרוף ביופסיה נאסף, דגירה אז DMEM FBS / 10% / Dispase (4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לילה ב 4 ° C. דגירה של 2-4 שעות ב 37 ° C הוא גם יעיל. חתיכות העור צריך להיות רוחב מרבי של 1 ס&quot;מ על מנת לאפשר אנזים לחדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העור לתוך צלחת פטרי מעוקרות, למשוך את כל השיער מן העור על ידי לתפוס את השערה סמוך לפני השטח של העור ומושך בחוזקה חלקה. בחר זקיקים בשלב telogen המבוסס על מורפולוגיה שלהם תחת מיקרוסקופ לנתח, לחתוך את האזור בליטה (איור 1A) זקיקי להעביר לתוך צינור מעוקרים 15 מ&quot;ל. זקיקי Anagen יכול לשמש גם אם לחתוך בבית העליון 1 / 3 של זקיק להשיג זקיקי השיער &quot;הבליטה&quot; באזור (איור 1 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שברי זקיק בודד בתערובת של 0.05% טריפסין-EDTA (GIBCO) ו Versene (0.53 mM EDTA 4Na, GIBCO) (01:01) עבור 15-20 דקות בטמפרטורת החדר עם רעד מעת לעת, להוסיף 4 מ&quot;ל DMEM + 10 FBS% לעצור את התגובה, ספין למטה 5 דקות ב 800 סל&quot;ד. לחלופין, רקמה זקיק explants שבר יכול להיות ממוקם בתוך תרבות בלא טריפסין לעכל את התרבות התאים מן זקיקי אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant בזהירות (לחסוך ~ 0.2-0.5 מ&quot;ל כדי להימנע מאיבוד תאים) מחדש להשעות ב 1 מ&quot;ל KCM (בינוני keratinocyte), ללא EGF. </li></ol> 2. ראשי תרבות אפיתל גזע תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני culturing שתאי הגזע אפיתל, mitomycin C שטופלו 3T3-J2 תאים (תאים מזין) צריכים להיות מוכנים כמו הבאים. 3T3-J2 תאים בתרבית DMEM עם 10% FBS לפני הטיפול. הסר מדיה culturing ולשטוף תא פעמיים עם PBS, לטיפול בתא עם 15μg / mL mitomycin C ב DMEM ללא בסרום במשך שעות 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הסר את C המכיל mitomycin DMEM ולשטוף פעמיים עם PBS, התאים מוכנים לשימוש. (Mitomycin C שטופלו 3T3-J2 תאים יכולים גם להיות מוכנים בעבר ומאוחסנים ב -80 ° C. ההפשרה וזרעי התאים יום אחד לפני העיקרית culturing גזע לתאי האפיתל, דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. 150,000-200,000 3T3-J2 התאים היטב לכל צלחת 6-גם מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זקיק שיער מבודדים זרע בתאי גזע משלב 1.5 על mitomycin C שטופלו 3T3-J2 תאים KCM ללא EGF לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2, השתנה KCM EGF המכילים למחרת. התאים גדלים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לח המכיל 5% CO 2. קרטינוציטים כל ניזונים עם KCM המכיל EGF כל 2 ימים גדל עבור 14-20 ימים. בדוק התא כל יום תחת מיקרוסקופ. זקיק שיער בתאי גזע יהוו מושבות (איור 2 א). זקיק שיער explants יהוו בצמחים לאחר 10-14 ימים (תרשים 2B). </li></ol> 3. אפיתל המעבר גזע תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם PBS פעם. הסר 3T3-J2 מזין תאים על ידי טיפול (מחומם מראש ל RT) Versene. תרבות דגירה השביעו ב Versene במשך 5 דקות, ולאחר מכן בעדינות לרעוד לשאוב את התאים מזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף זקיק שיער בתאי גזע עם או Versene או PBS פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טרום התחמם (עד 37 ° C, קריטי) טריפסין-EDTA (2X) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות או יותר במידת הצורך עבור תא גזע זקיק השיער לנתק. לא יותר מ 15 דקות היא הטובה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף KCM w / o EGF לעצור את טריפסין, פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לפזר תאים, ספין למטה על 200 גרם, 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש תאים עם להשעות KCM ללא הרוזן, EGF מחדש צלחת על שכבת mitomycin C שטופלו בתאים 3T3-J2. </li></ol> 4. להנציח גזע תאים אפיתל תאים ראשוניים, בתאי גזע בוגרים ואפילו להגיע הזדקנות לאחר המעבר חודשים סדרתי בתרבות. הנצחה של בתאי גזע העיקרית היא דרך יעילה כדי להקל על בעיה זו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט העיקרי בתאי גזע אפיתל (~ 350,000 תאים / היטב היטב צלחת 6) במעבר 1 על שכבת מזין (3T3-J2) והתרבות עבור 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות PA317 LXSN 16E6E7 שורת תאים יום לאחר זריעת התאים העיקריים גזע אפיתל עם DMEM המכיל 10% FBS. (קו זה מייצר את LXSN16E6E7 רטרווירוס amphotropic המקודד את HPV16 E6 ו E7 מסגרות קריאה פתוחה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ביציבות להדביק להנציח סוגי תאים רבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייחס PA317 LXSN 16E6E7 קו עם תא mitomycin C עבור 2 שעות (פרוטוקול אותו עם 3T3-J2 תאים). הוסף mitomycin C שטופלו PA317 LXSN 16E6E7 שורת תאים לתאי גזע העיקרי אפיתל, שיתוף תרבות עבור 6 ימים KCM עם EGF. חידוש KCM טרי עם EGF התקשורת כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 3T3-J2 ו PA317 LXSN 16E6E7 תא עם Versene. הוסף mitomycin-C שטופלו 3T3-J2 תאים NHP (neomycin, hygromycin, puromycin עמידים, ~ 200,000 תאים לכל היטב) לתאי גזע אפיתל. תאים נבחרים לפי 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של G418 (Gibco) עבור להוסיףitional 6 ימים. חידוש טרי KCM G418 המכיל עם EGF התקשורת כל 2 ימים. הישרדות בתאי גזע אפיתל יונצח בתאי גזע. היטב העיקרי בתאי גזע אפיתל אשר אינם שיתוף תרבותי עם תא PA317 16E6E7 LXSN צריך להיות מוגדר כביקורת לבחירה G418, כל התאים היטב זה צריך להיות נהרג על ידי G418 לאחר 6 ימים של בחירה. </li></ol> 5. נציג תוצאות מעבר מוקדם של אפיתל העור בתאי גזע הנציח בתאי גזע אפיתל טופס מושבות חזק המורכב קרטינוציטים קטן (איור 2 א) מוקפת תאים מזין. אם בתרבית תקשורת חופשית בסרום עם תוספי מוגדר, ללא שכבת מזין, בתאי גזע תתפזר לא בצורה הדוקה מושבות (הם גדלים כמו תאים בודדים ואשכולות קטנים). הונצח בתאי גזע אפיתל לשמור על הפנוטיפ יציב&gt; 12 חודשים של מעבר רציף, אבל נטה בצורה הדוקה יותר מושבות תאים ראשוניים. הם אינם יוצרים מושבות מעגן עצמאית מבחני אגר רך, המציין כי התאים האלה אינם מונצחים בעלי מאפיינים של תאים סרטניים. שניהם ראשוניים הנציח בתאי גזע אפיתל להביע זקיקי השיער גזע סמן תא cytokeratin 15 (איור 3A), והם מסוגלים להתמיין זקיק, אפידרמיס שיער שושלות החלב (איור 3 ב-D). <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. פריטה שערות. אחרי מריטת מהעור dispase שטופלו, זקיקי השיער מופיעים גם שערות מועדון telogen (A) עם כדור של תאים המקיפים את החלק התחתון של השיער, או שערות Anagen (ב &#39;) עם שרוול של האפיתל המקיפים את אורך השיער. האזור בליטה telogen צורות אזור מורפולוגיים ברורים מיקרו לנתח, ואילו את הבליטה Anagen היא ברורה פחות. נורת Anagen מכיל קרטינוציטים מטריקס, המייצגת מעבר הגברה, תאים יכולים גם להיות מבודדים תרבותי. <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור בתאי גזע תרבויות. (א) בתאי גזע אפיתל מטופס מושבות עור אפיתל הדוק (שקבע E) כאשר בתרבית KCM עם שכבה של תאים מזין (המיועד על ידי F). (ב) זקיק שיער explants להצמיח בצמחים אפיתל. באזור הבליטה telogen (שקבע T) מצורף המנה ומוקף המושבה תא אפיתל עם תאים מזין. <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. גזע התמיינות תאים. (א) בתאי גזע מושבות לשמור על ביטוי של סמנים האפיתל כגון cytokeratin 15. (ב) אפיתל עור לתאי גזע יכולים להיות מובחנים לאורך השושלת זקיק השיער כפי שנקבע על ידי ביטוי K6Hf. (ג) התאים יכול להיות מתורבת על הדרמיס דה epidermalized או מטריצות אחרים בממשק אוויר הנוזל יהוו שכבת האפידרמיס מרובדת cornified, שכבת גרגרי שכבת spinous. (ד) בתאי גזע יכול להיגרם לאורך השושלת החלב עם כדוריות שמן האדום חיובית.

<ol>
	<li>Jones, P. H., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+human+epidermal+stem+cells+from+transit+amplifying+cells+on+the+basis+of+differences+in+integrin+function+and+expression.">Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression.</a> Cell. 73, 713-724 (1993).</li><li>Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C8/144B+monoclonal+antibody+recognizes+cytokeratin+15+and+defines+the+location+of+human+hair+follicle+stem+cells.">The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).</li><li>Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+the+intestinal+stem+cell+as+a+paradigm.">Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm.</a> Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).</li><li>Slac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+epithelial+tissues.">Stem cells in epithelial tissues.</a> Science. 287, 1431-1433 (2000).</li><li>It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge+contribute+to+wound+repair+but+not+to+homeostasis+of+the+epidermis.">Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis.</a> Nat Med. 11, 1351-134 (2005).</li><li>Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+find+their+niche.">Stem cells find their niche.</a> Nature. 414, 98-104 (2001).</li><li>Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+follicular+stem+cells+in+forming+not+only+the+follicle+but+also+the+epidermis.">Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis.</a> Cell. 102, 451-461 (2000).</li><li>Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+renewal+of+hair+follicles+from+adult+multipotent+stem+cells.">Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells.</a> Cell. 104, 233-245 (2001).</li><li>Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotsarelis+G+Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li><li>Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-potentiality+of+a+new+immortalized+epithelial+stem+cell+line+derived+from+human+hair+follicles.">Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles.</a> In vitro Cell. &#38; Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).</li><li>Ohyama, M., Vogel, J. C. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=delivery+to+the+hair+follicle.">delivery to the hair follicle.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 8, 204-206 (2003).</li><li>Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+stem+cell-targeted+gene+transfer+and+reconstitution+system.">Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system.</a> Gene Ther. 13, 732-737 (2006).</li><li>Stenn, K. S., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+the+hair+follicle:+fringe+benefits+of+stem+cell+technology.">Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).</li><li>Hoeller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+rapid+method+to+construct+skin+equivalents+from+human+hair+follicles+and+fibroblasts.+Exp+Dermatol+10.">An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10.</a> , 264-271 (2001).</li><li>Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reepithelialization+of+a+full-thickness+burn+from+stem+cells+of+hair+follicles+micrografted+into+a+tissue-engineered+dermal+template+(Integra).">Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra).</a> Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).</li><li>Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hair+growth+deficiency+is+linked+to+a+genetic+defect+in+the+phospholipase+gene+LIPH.">Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH.</a> Science. 314, 982-985 (2006).</li><li>Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+epidermolysis+bullosa+by+transfer+of+wild-type+bone+marrow+cells.">Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells.</a> Blood. 113, 1167-1174 (2009).</li><li>Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+transplantation+for+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa.">Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).</li><li>Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Correction+of+Type+VII+Collagen+Expression+in+Dystrophic+Epidermolysis+Bullosa.">Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa.</a> J Invest Dermatol. , (2010).</li><li>Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+with+neural+crest+characteristics+derived+from+the+bulge+region+of+cultured+human+hair+follicles.">Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).</li><li>Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+graying:+incomplete+melanocyte+stem+cell+maintenance+in+the+niche.">Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche.</a> Science. 307, 720-724 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מיצוי והתרבות תא השיטות המתוארות הן קליל במפתיע לשעתקו. יש לנו תא אפיתל שנוצר תרבויות נובעים עשרות אנשים על פני מגוון גילאים רחב, לרבות חולים עם מומים עור תורשתית 18. מומלץ להתחיל את התהליך ביום הקציר רקמות, אולם התאים יישארו קיימא בתקשורת על הקרח במשך כמה ימים, ב...

התקשורת keratinocyte (KCM) [DMEM וחם של F12 (GIBCO, 03:01), אדנין (Sigma, 180 מ&quot;מ), 10% עוברי שור בסרום (GIBCO), רעלן הכולרה (ICN, 0.1 ננומטר), פניצילין / סטרפטומיצין (GIBCO, 100 U / ml ו 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה), הידרוקורטיזון (Sigma, 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 1.1 מ&quot;מ), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, 649 nM; triiodo ו-l-thyronine, Sigma, 2 ננומטר) , אינסולין (Sigma, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 862 ננומטר), ו EGF (Sigma, 10 ng / ml, 1.6 ננומטר), pH 7.2]

isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin

הומאוסטזיס של כל רקמות עצמית חידוש תלויה בתאי גזע בוגרים. כמו בתאי גזע שלא עברו התמיינות לעבור חטיבות סימטרית, הם לייצר תאים הבת לשמור על תא גזע פנוטיפ ומעבר, הגברה תאים (תאים ת&quot;א) כי להגר מן הגומחה תא גזע, עוברים התפשטות מהירה סופני להבדיל לאכלס מחדש את הרקמה. בתאי גזע אפיתל זוהו האפידרמיס, זקיקי השיער, ובמעי כמו תאים עם פוטנציאל גבוה במבחנה שגשוג וגם איטי אופניים תווית שמירה תאים in vivo 1-3. למבוגרים, רקמה ספציפית בתאי גזע אחראים התחדשות של הרקמות שבהם הם מתגוררים במהלך מחזור פיזיולוגי תקין, כמו גם בתקופות של מתח 4-5. יתר על כן, בתאי גזע נחשבים בדרך כלל להיות רב עוצמה, בעל יכולת להצמיח סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה 6. לדוגמה, זקיק שיער מכרסם בתאי גזע יכול ליצור האפידרמיס, בלוטות החלב, ו 7-9 זקיקי שיער. הראינו כי תאי גזע באזור זקיק השיער האנושי בליטה התערוכה פוטנציאל רב 10. בתאי גזע הפכו כלי חשוב במחקר ביו, עקב השירות שלהם במערכת במבחנה לחקר הביולוגיה ההתפתחותית בידול, tumorigenesis עבור השירות הטיפולי אפשרי שלהם. סביר להניח כי בתאי גזע בוגרים אפיתל יהיה שימושי לטיפול במחלות כגון ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton תסמונת, מחלת מנקס, epidermolysis בולוזה תורשתי alopecias 11-13. בנוסף, בעיות עור אחרות כמו פצעים שורפים, פצעים כרוניים וכיבים יהנה בתאי גזע הקשורים טיפולים 14,15. לאור הפוטנציאל תכנות מחדש של תאים בוגרים למצב pluripotent (תאים iPS) 16,17, גזע נגיש להרחבה מבוגר התאים בעור האדם עשויה לספק מקור חשוב של התאים לזירוז טיפול במורד הזרם עבור מגוון רחב של מחלות כולל סוכרת ומחלת פרקינסון.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

isolation-and-culture-of-adult-epithelial-stem-cells-from-human-skin

Research

JoVE Journal

Biology

28.3K Views.  University of Massachusetts Medical School. הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

Video: Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Developmental Biology

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Neuroscience

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Bioengineering

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...