אנו מודים אלינה El-חליל, מרטינה Hajduskova לקבלת סיוע טכני. אנו מודים לחברים בקבוצה Tursun להערות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי ERC-StG-2014-637530 ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 והיא נתמכת על ידי מקס Delbrueck המרכז לרפואה מולקולרית באגודה הלמהולץ.

כל השיטות המתוארות כאן לגבי טיפול בבעלי חיים אושרו על-ידי LaGeSo ברלין, גרמניה
1. פתרון הכנה
<ol>
	<li>צלחות NGM-אגר (1 ליטר)
	<ol>
		<li>הוסף דור 3 של NaCl 2.5 גר' peptone מדיה (למשל, מה נשארתי-Peptone), 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/mL במלאי EtOH 95%), 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 25 מ של 1 מ' K2PO4ו- 1 מ"ל של המפוטריצין (2.5 mg/mL במלאי).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-אגר RNAi צלחות (1 ליטר)
	<ol>
		<li>הוסף דור 3 של NaCl, 2.5 g של peptone מדיה ו- 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving להוסיף, 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/mL במלאי EtOH 95%), 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ של 1 מ' CaCl2, 25 מ של 1 מ' K-2-פו-4, 1 מ"ל של המפוטריצין (מניות 2.5 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל של 1 מ' IPTG , ו- carbenicillin 1 מ"ל (50 מ"ג/מ"ל).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-אגר (1 ליטר)
	<ol>
		<li>להוסיף 10 גרם של מדיה peptone, 5 גר' שמרים לחלץ, 5 g של NaCl, 20 גר' אגר, 10 מ של 1 מ' טריס pH 8.0. להוסיף H2O 1 ל' לאחר autoclaving, מוסיפים 1 מ"ל של 50 מ"ג/מ"ל carbenicillin 2.5 מ של 5 מ"ג/מ"ל טטרציקלין.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בינוני ליברות (1 ליטר)
	<ol>
		<li>להוסיף 10 גרם של מדיה peptone, 5 גר' שמרים לחלץ, 5 g של NaCl, 10 מ של 1 מ' טריס pH 8.0. להוסיף H2O 1 ל' לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של 50 מ"ג/מ"ל carbenicillin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-buffer (1 ליטר)
	<ol>
		<li>הוסף 6.0 גר' נה2HPO4, דור 3 של2פו ח'4, 5 g של NaCl ו- 50 מ"ג של ג'לטין. לפני השימוש, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>פתרון הלבנת (10 מ"ל)
	<ol>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של NaClO ו- 2 מיליליטר 5 N NaOH. להוסיף H2O 10 מ"ל.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. הכנת לוחות RNAi
הערה: C. elegans הוא בדרך כלל תרבותי במעבדה על צלחות פטרי 6 ס מ המכיל 7.5 mL של תולעים נימיות צמיחה בינוני אגר (NGM-אגר)10,11. פרוטוקול זה ממוטב עבור תולעים שמרו ב 15 º C. כדי להכין צלחות עם NGM, להשתמש בטכניקות סטרילי סטנדרטי כדי למנוע זיהום פטרייתי, חיידקי. לפניכם פרוטוקול להכין צלחות NGM בתוספת ריאגנטים עבור RNAi.
<ol>
	<li>הכינו צלחות NGM-אגר RNAi 6 ס מ המכיל 1 מ מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ו- 50 carbenicillin µg/mL. תנו להן להתייבש במשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר האפל12.
	<ol>
		<li>שמור RNAi צלחות ב 4 ° C בחושך. אין להשתמש אם שגילן עולה על 14 ימים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בחר RNAi השיבוט חיידקים (Escherichia coli HT115) המכילה את פלסמיד L4440 עם רצף הדנ א לין-53 ג'ין מן המלאי גליצרול קפואים זמינות RNAi ספריית13 על צלחות LB-אגר המכיל 50 µg/mL carbenicillin ו- 12.5 טטרציקלין µg/mL באמצעות התבנית streaking תלת-פאזי. מגדלים את החיידקים לילה של 37 ° C12. שיבוט זה מאפשר IPTG תלוית הייצור של לין-53 dsRNA של החיידק.
	<ol>
		<li>בנוסף, לגדול חיידקים RNAi המכילים את פלסמיד L4440 ללא כל רצף גנים כמו בקרה הריק וקטור14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>למחרת, לבחור מושבה בודדת של לין-53 או צלחות ריקות וקטור LB-אגר באמצעות פיפטה 200 µL עצה לחסן כל אחד מהם לתוך צינור תרבות נפרד המכיל 2 מ ל נוזל LB בינוני14 בתוספת 50 carbenicillin µg/mL. לגדול תרבויות בין לילה ב 37 ° C עד שיגיעו של צפיפות אופטית (OD) ב 600 nm של 0.6-0.8. למדוד את יתר באמצעות ספקטרופוטומטרים15. התראה: התקשורת LB נוזלי אינו אמור להכיל טטרציקלין לעומת הלוח LB-אגר המשמש ומבטא את החיידקים מן המלאי גליצרול, מאז הכללה של טטרציקלין שהאכילה הפניות ל- יעילות RNAi ירד 12</li>
	<li>להוסיף 500 µL של כל התרבות חיידקי (לין-53 או וקטור ריק) צלחות NGM-אגר RNAi 6 ס מ באמצעות של multipipette. דגירה צלחות עם מכסה סגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך להתייבש. במהלך תקופה זו, יניעו IPTG לוחית NGM הייצור של dsRNA של החיידק.
	<ol>
		<li>להשתמש לפחות 3 צלחות לכל התרבות חיידקי לכל ניסוי. זה יספק 3 טכני משכפל עבור ניסוי.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>חנות צלחות NGM-אגר RNAi מיובשים עם חיידקים ב 4 ° C בחושך עד שבועיים.</li>
</ol>
3. הכנה של C. elegans זן BAT28
<ol>
	<li>לשמור על המתח תולעת BAT288 המכיל את transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)], ntIs1 [gcy-5prom::gfp] על חיידקים OP50 באמצעות לוחות NGM-אגר רגיל ב 15 º C. הערה: עבור פרוטוקול מפורט על תרבות נמטודות, ראה10. Rol-6(su1006) אלל דומיננטי, נפוץ פנוטיפי הזרקת סמן16 הגורמת התנועה מתגלגלת טיפוסי. הוא משמש את transgene otIs305 כדי לעקוב אחר hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>לשמור על המתח BAT28 ב 15 ° C בכל עת על מנת למנוע הפעלת precautious hsp-16.2prom::che-1 transgene. לצמצם חשיפה לטמפרטורות גבוהות יותר מאשר 15 ° C לטיפול במתח ככל האפשר.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>גיל-תולעים לסנכרן, להשתמש בטכניקה הלבנת17.
	<ol>
		<li>לשטוף צלחות 6 ס מ NGM-אגר המכיל מבוגרים וביצים של BAT28 באמצעות מאגר M9 µL 900. צניפה תולעים על ידי צריך שתוציאו ב g x 900 עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 0.5-1 מ של הלבנת פתרון ומנערים את הצינור עבור 1 דקות עד תולעים בוגרות יתחילו להתפוצץ פתוח. צג באמצעות stereomicroscope רגיל.</li>
		<li>צניפה תולעים על ידי צריך שתוציאו ב g x 900 עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>רחץ בגדר תולעת 3 פעמים על-ידי הוספת µL 800 M9 המאגר צריך שתוציאו ב 900 x g.</li>
		<li>מניחים את הביצים נקי על טרי NGM-צלחות עם חיידקים OP50. לגדול אוכלוסיה מולבן על חיידקים OP50 ב 15 ° C עד שיגיעו L4 הבמה (כ- 4 ימים). L4 הזחלים ניתן לזהות על ידי כתם לבן בערך באמצע הדרך לאורך הצד הבטני תולעת18 באמצעות stereomicroscope סטנדרטי. הערה: כדי להשיג את תא נבט נוירון פנוטיפ המרה על דלדול של לין-53, זה צריך להיות מרוקנים את הדור הורים (P0).</li></ol></li></ol>מניה על פנוטיפ ההמרה נעשה בקרב הדור הבא (שקבורה דור F1). כדי להשיג את deplete לין-53 כבר ב P0, L4. נתונים RNAi.
	
	
	<li>העברה ידנית 50 L4 הבמה תולעים לכל שכפול באמצעות חוט פלטינה כדי צלחת NGM לא מכילות כל חיידק ולתת תולעים התרחק כל חיידק OP50 שהועברו. תעזוב את התולעים לעבור על הצלחת עבור 5 דקות. שימוש חיידקים מן הלוחות NGM-אגר RNAi נזרע בעבר עם לין-53 RNAi חיידקים (או בקרה הריק וקטור) כדי להעביר הצלחות RNAi בהתאמה.
	<ol>
		<li>למנוע העברת חיידקים OP50 הלוחות RNAi בפועל. לעבוד מהר כדי למזער את זמן החשיפה של המתח לטמפרטורות גבוה יותר מאשר 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>דגירה תולעים על צלחות RNAi NGM-אגר ב 15 מעלות צלזיוס במשך כ- 7 ימים עד F1 צאצא. של התולעים מגיע L3-L4 הבמה. הם ניתן בבירור להפריד בין החיות P0 מאז הם גדולים יותר, עבה יותר הוא צאצא F1.
	<ol>
		<li>בדיקה חזותית תחת stereomicroscope סטנדרטי אם F1 רומא תולעים להראות פנוטיפ בולט של הפות (pvul), כפי שמוצג באיור1. RNAi נגד לין-53 יש תופעות pleiotropic וגורם של פנוטיפ pvul בו ניתן להשתמש כדי להעריך אם RNAi נגד לין-53 הוכתרה בהצלחה. הערה: RNAi נגד לין-53 יכול גם לגרום הקטלניות של העוברים F1. אפקט זה מגביר אם הצלחות נחשפים לתארים גבוהים מ- 15 ° C לפני בעלי חיים הגיעו L3-L4 הבמה. ניתן לזהות עוברי המת על ידי משפחה בהפרעה וחוסר הבקיעה.</li>
		<li>דגירה צלחות בחושך כיוון IPTG הוא רגיש אור.</li>
	</ol>
	</li>

4. אינדוקציה של תא הנבט התכנות
<ol>
	<li>דגירה שנבדקו צלחות RNAi המכיל לין-53 ולרוקן וקטור רומא F1 RNAi שטופלו במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך כדי להפעיל את צ'ה-1. שימוש במדגרה פרקו שכן הוא מאפשר הלם חום יעיל יותר.</li>
	<li>לאפשר בהלם-חום בעלי חיים כדי לשחזר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ואז דגירה צלחות 25 ° c בלילה בחושך.</li>
	<li>שימוש stereomicroscope סטנדרטי מצמידים מקור אור זריחה, לבחון חיות תחת מסנן ה-GFP עבור gcy-5prom::gfp-נגזר אותות באזור אמצע הגוף של התולעים, כמוצג באיור2. ערכת מיקרוסקופ עבור אותות GFP: עירור המרבי-488 ננומטר עם פליטה המרבי-509 ננומטר.</li>
	<li>להעריך את מידת תא הנבט המרה תא עצב על ידי הרכבה חיות עם GFP אותות באזור אמצע הגוף אגר המכילות pad מיקרוסקופ שקופיות19.
	<ol>
		<li>לספור את מספר בעלי החיים מציג את תא הנבט המרה נוירון לעומת החיות כהה כדי להעריך את penetrance פנוטיפ. בדרך כלל, בסביבות 30% מבעלי החיים מראים אותות בדידים GFP germline על התרוקנות לין-53 , ואילו לא יותר מ-5% של בעלי החיים להראות אותות GFP ' מאטום לשקוף ' germline על ריק וקטור RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

המחברים הכריזו כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

בעוד הפרוטוקול המתואר באמצעות הטרנסגניים של C. elegans זן BAT28, RNAi נגד לין-53 היא פשוטה, מספר צעדים חיוניים על מנת להבטיח את התוצאה המקווה של נבט התא של נוירון התכנות. חשוב כי המתח BAT28 נשמרת ב 15 ° C בכל עת לפני הניסויים. במהלך טיפול ותחזוקה של המתח, הפעם בטמפרטורות מעל 15 ° C צריך למזער ככל האפשר. מכת חום תקין תנאים חשובים מאז לא מספיקות אינדוקציה של צ'ה-1 ביטוי לא יביא תא נבט ל ASE נוירון המרה. זה ניתן להבחין באמצעות מדידה של penetrance פנוטיפ כמפורט בפרוטוקול. חום רב-הלם יכול להוביל הקטלניות של בעלי החיים. למשל, צלחות הונחו על הקרקע התחתונה של חממה אוויר סטטי או ליד הקירות הפנימיים לעיתים קרובות לחוות טיפול בחום רב. לכן, מומלץ להשתמש של חממה חום פרקו. בנוסף, העיתוי של אינדוקציה מכת חום היא קריטית מאז ביטוי יתר של צ'ה-1 במהלך שדרגות מוקדם יותר ואז L3 יכול להוביל חוץ רחמי gcy-5prom::gfp אינדוקציה באזורי גוף שונים כגון הפות (איור 3) 9. יתר על כן, ניתן להבחין מכת חום מקיף penetrance פנוטיפ בבעלי RNAi וקטור ריק אשר לא צריך להאריך 5% ו- auto-זריחה מוגברת של רקמות אחרות, כלומר המעי.
בצורה אקראית, חיידקים RNAi יכולה לאבד את הפעילות שלהם לייצר ביעילות dsRNA של הגן היעד. למרבה הצער, זה לא יכול להיות זוהה לפני הניסוי RNAi. במקרים כאלה צריך לגדול פס צח מ גליצרול כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. אם יש עדיין לא גרם RNAi pleiotropic פנוטיפ גלוי כמו למשל פנוטיפ pvul הנגרמת על ידי RNAi מוצלח נגד לין-53, ואז פלסמיד בידוד ה-DNA של החיידק בהתאמה, יש לבצעו, חיידקים HT115 טרי צריך להיות טרנספורמציה עם פלסמיד L4400 המכיל את רצף לין-53 .
חשוב, המתח BAT28 יש פנוטיפ רולר הנגרמת על ידי הזרקת סמן pRF4, אשר שימש במהלך transgenesis של החיות עם hsp-16.2prom::che-1 לבנות DNA. לעיתים, חיות לאבד את פנוטיפ מתגלגל, אשר יכולה להצביע על ההשתקה hsp-16.2prom::che-1 transgene. כדי לשמר כראוי את המתח BAT28, לבחור רולר 10, לבעלי צלחת טריים, להפיץ בחירת עבור לצלם בעלי חיים.
היישום של הפרוטוקול מוגבלת להליך F1 RNAi, מה שאומר כי חיות שהוריהם (P0 הדור) לא נחשפו ל- לין-53 RNAi לא יציג תא הנבט המרה נוירון עקב הצלה אימהי4. הליך חלופי כדי להמיר בתאי הנבט נוירונים תואר על ידי Ciosk ועמיתיו15 באמצעות RNAi דפיקה למטה של gld-1 ו- mex-3 ללא ביטוי יתר של פקטור שעתוק. אולם, הנוירונים שהושג לא שייכים לסוג מסוים של נוירונים, בתאי הנבט גם להמיר לתאי השריר כמו על מציאה RNAi בתיווך דלדול של gld-1 ו- mex-3-15. בעבר, זה כבר הוכיחה RNAi נגד לין-53 מותר המרה תא הנבט לתוך תאי נוירון דמוי GABAergic על ביטוי יתר של הגורם שעתוק homoedomain Pitx מסוג UNC-3016 שנים ולא צ'ה-14 . עבור כיוונים לעתיד, ניתן להמיר שעתוק שונים בתדר הגורל, גורמים יכול להיבדק אם לין-53 דלה בתאי הנבט סוגי תאים אחרים מאשר נוירונים ספציפיים. בהקשר זה, ביטוי של הגורם שעתוק myogenic bHLH HLH-1, homolog של יונקים אלוהים17, גורם המרה של תא הנבט השרירים על לין-53 RNAi5. הוקמה התיכנות בתאי הנבט סוג תאים סומטיים מסוים על לין-53 RNAi, ביטוי יתר של גורם שעתוק המתאים בתדר הגורל יכול לשמש עבור מספר מסכי גנטיים שונים. מסכי משתיק קול או שיפור כזה יכול לעזור לנתח מסלולים תקינה כי תפקיד במהלך ההמרה גורל התא.

תא גורל התכנות על ידי ביטוי חוץ רחמי TF כגון אלוהים TF myogenic, אשר, כאשר overexpressed, ממיר fibroblasts ישירות לתוך תאי השריר כמו1, היה מוקד מחקר במשך עשרות שנים. עם זאת, תאים הם לעתים קרובות עקשן לתהליך זה, עקב מנגנונים לשמור על זהותם הסלולר. בתאי הנבט להראות מידה דומה של הגנה, ויש מנגנונים כבסיס לעתים קרובות לשמש מחסום כדי למנוע המרה תא הנבט לתוך סוגי תאים אחרים עם ביטוי יתר TF בתדר הגורל. בדרך כלל, רגולציה epigenetic כגון שינויים היסטון, הכרומטין כופה מכשול עבור ההמרה של התא-הגורלות-2,-3. יש קודם לכן חלה גנטיקה הפוכה באמצעות RNAi טוק-דאונס C . elegans ואנו זיהו גורמים להגן על זהויות הסלולר, ובכך לנטרל התכנות בתאי הנבט לתוך הנוירונים4. באופן ספציפי, polycomb הדיכוי מורכבים 2 (PRC2) והמלווה היסטון מאוד שנשמרת לין-53 (CAF-1/RBBP/4/7 ב בני אדם) למנוע את ההמרה ישירה בתאי הנבט סוגים תאים סומטיים מסוים כגון נוירונים טעם glutamatergic C. elegans 4 , 5. כדי לזהות אלה תא הנבט התכנות גורמים מכשול, השתמשנו חיות הטרנסגניים נושאת את החום-הלם inducible Zn-האצבע TF צ'ה-1. צ'ה-1 מתבטאת בדרך כלל שני נוירונים ראש של C. elegans, איפה זה מציין שגורלו של נוירונים טעם glutamatergic כינה ASE6. גורל נוירון ASE, ניתן לאבחן על ידי הבעת הכתב פלורסנט ASE ספציפי gcy-5prom::gfp. GCY-5 הוא chemoreceptor רק הביע ב ASE נוירון נכון7. על לין-53 דלדול ידי RNAi, אינדוקציה של ביטוי חוץ רחמי רחבה של צ'ה-1 על ידי מכת חום, בתאי הנבט יכולים להיות מומרים נוירונים ויוו4,5. חשוב לציין, תזמון הטיפול RNAi היא קריטית כמו תולעים בוגרות בלבד (P0 הדור) חשופים לין-53 RNAi להצמיח F1 רומא בעלי חיים germline זה מתירניות עבור התכנות לתוך הנוירונים4.
תא נבט שתוארו לעיל כדי נוירון הליך הגיור C . elegans ניתן ללמוד מגוון של שאלות ביולוגיות כגון במשמעויות של איתות המסלולים ב תא גורל התכנות. למשל, השתמשנו תא נבט צ'ה-1-induced התכנות לתוך הנוירונים ASE על RNAi נגד לין-53 ללימוד במשמעויות של החריץ איתות בתהליך תא הנבט התכנות8. על ידי ביצוע RNAi כפול כדי שיתוף לרוקן לין-53 והיסטון את קידוד demethylase ג'ין utx-1 הראינו כי החריץ איתות לשביל מנטרל בתיווך PRC2 ג'ין להחרשת על ידי הפעלת ביטוי של UTX-1 germline8 . ממצא זה מדגים כי ההמרה תא הנבט את הנוירונים שמתואר פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את תהליך ביולוגי מורכבים כגון הסלולר התכנות אורגניזם שלם, בהקשר של שונות התפתחותיים וסביבתיים תנאים. יתר על כן, הוא מספק את הפרספקטיבה לאתגר בתאי הנבט בהבעת יתר שונים שר הגורל בתדר ללמוד את תפקידם בהגבלה של פלסטיות הסלולר9, או כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם להשראת תכנות מחדש של תאים נבט תא שני סוגי בתוך vivo.
בעוד יונקים בתרביות רקמה גם מאפשרים ללמוד היבטים שונים של התכנות גורל התא, התאים גדלו בתרבות מוגבלת היכולת לחקות תנאי מסלול איתות לעומת אורגניזם שלם. לכן, C. elegans הוא מודל רב תכליתי לבדיקה של התפקידים של תהליכים ביולוגיים שונים כגון חריץ איתות בזמן התכנות ויוו. בנוסף, זה מודל רב עוצמה עבור מסכי גנטי זה יחסית קל לתחזוקה ולשינוי גנטית על עלויות נמוכות.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&amp;nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast extract&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incubators&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td><td>for heat-shock</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>for maintenance of worm strains at 15 &amp;deg;C or 25 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>M205 FA</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Imaging) + camera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Imaging) + camera</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli HT115&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5&lt;br/&gt; promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse&lt;br/&gt; III minus).</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli OP50&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Uracil auxotroph E. coli strain</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;BAT28:&lt;/strong&gt; &lt;em&gt;otIs305 (hsp16.2prom::che-1::&lt;br/&gt; 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi Clones&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>empty vetor: L4440</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Misc.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm pick&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td></tr></tbody></table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

בחקר התהליכים הביולוגיים תא במהלך המרת את זהותם של סוגי תאים ספציפיים מספק תובנות מנגנון חשוב זה לשמור ולהגן על זהויות הסלולר. ההמרה של תאי הנבט לתוך נוירונים ספציפיים של נמטודות Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא כלי רב עוצמה עבור ביצוע מסכי גנטית על מנת לנתח מסלולים רגולטוריים אשר מגנה על זהויות תא הוקמה. תכנות מחדש של תאים נבט לסוג מסוים של נוירונים כינה ASE דורש חיות הטרנסגניים לאפשר ביטוי יתר רחבה של שעתוק Zn-האצבע פקטור (TF) צ'ה-1. צ'ה אנדוגני-1 מתבטאת אך ורק שני נוירונים הראש והוא נדרש לציין את גורל הנוירונים glutamatergic ASE, אשר ניתן לאבחן בקלות על ידי הכתבת gcy-5prom::gfp . גן טרנס המכיל חום-הלם מונחה יזם צ'ה-1 ג'ין ביטוי הבונה מאפשר ביטוי שגויה רחבה של צ'ה-1 החיה כולו על טיפול חום-הלם. השילוב של RNAi נגד גורם מווסת כרומטין לין-53, ביטוי יתר חום-הלם-induced צ'ה-1 מוביל התכנות של תא נבט תאים דמויי נוירון ASE. נתאר כאן את הליך RNAi מסוים והתנאים המתאימים לטיפול בחום-שוק של חיות הטרנסגניים בתערובות לזירוז בהצלחה תא הנבט המרה תא עצב.

כפי שמוצג באיור1, כי התערוכה של פנוטיפ pvul F1 חיות להמחיש יישום מוצלח של לין-53 RNAi. בעלי חיים אלה נוטים לאפשר המרה של תאי נבט שלהם לתוך תאי נוירון דמוי ASE על חום-הלם אינדוקציה של צ'ה-1 ביטוי יתר כמופיע באיור2. בניגוד תולעים שגדל על הפקד ריק וקטור RNAi לין-53 RNAi טיפול תניב חיות המציגים חוץ רחמי GFP-אותות באזור אמצע הגוף לאחר מכת חום, הדגירה 25 º C למשך הלילה כפי שתואר קודם4, 8. תחת מיקרוסקופ epifluorescence של תולעים אלה מדוקדקת יותר כי התאים מציג אותות GFP גם להציג תחזיות כמו נוירון (איור 2B, החצים הלבנים) האופייניים עבור תאים עצביים. אם לא הצליחה RNAi נגד לין-53 או חום-הלם התנאים היו בלתי הולם GFP אותות ידמה לאלה בשליטה RNAi שטופלו חיות (איור 2). חשוב לציין, למנוע גרימת ביטוי יתר של צ'ה-1 על ידי חום אינדוקציה לפני בעלי חיים מגיעים באמצע שלב L3. בעלי חיים, כי היו צעירים מדי, בזמן האינדוקציה ביטוי צ'ה-1 ניתן להציג gcy חוץ רחמי - 5prom::gfp ביטוי באזורים אחרים של הגוף כמו הפות המתפתח כפי שמוצג באיור 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
איור 1: Pvul פנוטיפ הנגרמת על ידי RNAi נגד לין-53- (למעלה) DIC תמונה של L4/צעירים למבוגרים הבמה F1 רומא תולעים נגזר אמהות RNAi מטופלים פקד או לין-53 . גודל ברים = 20 מיקרומטר. (למטה) חיות שטופלו לין-53 RNAi התצוגה פנוטיפ בולט הפות (pvul) (חץ שחור-ראשי). פנוטיפ pvul מאשרת כי RNAi נגד לין-53 היה מוצלח. גודל ברים = 20 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
איור 2: תולעים עם תא הנבט בהצלחה מחדש לתוך הנוירונים. (א) BAT28 זן חיות גדל על הווקטור ריק לא מראים אותות GFP ב germline לאחר מכת חום אינדוקציה של ביטוי צ'ה-1 . קו מקווקו לבן מתווה תולעת. גודל ברים = 20 מיקרומטר. (B) בניגוד BAT28 זן חיות גדל על הפקד ריק וקטור חיות RNAi גדל על לין-53 RNAi התצוגה אותות gcy-5prom::gfp באזור אמצע הגוף. תמונות של המקטע אמצע הגוף עם אותות GFP שצולמו 63 X הגדלה לחשוף תאים GFP-חיוביות מציג בליטות (חץ לבן-ראשי). תכונה זו מורפולוגי מציין כי בתאי הנבט שעברו המרה לתוך תאי נוירון דמוי ASE. כוכביות לבן לסמן אוטומטית-זריחה נגזר המעי. כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם 20 X 63 X הגדלה הגדלה. קו מקווקו לבן מתווה תולעים. גודל ברים = 20 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
איור 3: תולעת בשלב מוקדם עם GFP חוץ רחמי- BAT28 זן חיות גדל על החיידק RNAi וקטור ריק שהיו מכת חום המושרה על צ'ה-1 ביטוי בשלבים המוקדמים זחל כגון L2 הצגת אותות GFP באזור אמצע הגוף (כוכביות לבן). אותות אלה אינם עקב תא הנבט התכנות. קו מקווקו לבן מתווה תולעת. גודל ברים = 20 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

7.6K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association. פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיו...

Video: Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

שיטות מתוקננת למדידת אינדוקציה של תגובת הלם חום באלבורבדיוטיס

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

Environment

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Biology

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Neuroscience

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Tissue-Specific RNAi Tools to Identify Components for Systemic Stress Signaling

Over the past decade there has been a transformative increase in knowledge surrounding the regulation of protein quality control processes, unveiling the importance of intercellular signaling processes in the regulation of cell-nonautonomous proteostasis. Recent studies are now beginning to uncover signaling components and pathways that coordinate protein quality control from one tissue to another. It is therefore important to identify mechanisms and components of the cell-nonautonomous proteostasis network (PN) and its relevance for aging, stress responses and protein misfolding diseases. In the laboratory, we use genetic knockdown by tissue-specific RNAi in combination with stress reporters and tissue-specific proteostasis sensors to study this. We describe methodologies to examine and to identify components of the cell-nonautonomous PN that can act in tissues perceiving a stress condition and in responding cells to activate a protective response. We first describe how to generate hairpin RNAi constructs for constitutive genetic knockdown in specific tissues and how to perform tissue-specific genetic knockdown by feeding RNAi at different life stages. Stress reporters&#160;and behavioral assays function as&#160;valuable readouts&#160;that enable&#160;the fast screening of genes and conditions modifying systemic stress signaling processes. Finally, proteostasis sensors expressed in different tissues are utilized to determine changes in the tissue-specific capacity of the PN at different stages of development and aging. Thus, these tools should help clarify and allow monitoring the capacity of PN in specific tissues, while helping to identify components that function in different tissues to mediate cell-nonautonomous PN in an organism.

<meta charset="utf8"></head><body>כלי RNAi ספציפיים לרקמות לזיהוי רכיבים לאיתות מתח מערכתי

Maintenance of organismal proteostasis requires the coordination of protein quality control responses such as chaperone expression from one tissue to another. Here, we provide tools used in C. elegans that allow monitoring of proteostasis capacity in specific tissues and determine intercellular signaling responses.

כלי RNAi ספציפיים לרקמות לזיהוי רכיבים לאיתות מתח מערכתי

Over the past decade there has been a transformative increase in knowledge surrounding the regulation of protein quality control processes, unveiling the ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

ג. אלגנס אחזקה

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

RNAi in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target gene. In the nematode, C. elegans, RNAi is particularly easy and effective because it can be delivered simply by feeding the worms bacteria that express double stranded RNA (dsRNA) that is complementary to a gene of interest. First, this video will introduce the concept of RNA interference and explain how it causes targeted gene knockdown. Then, we will demonstrate a protocol for using RNAi in C. elegans, which includes preparation of the bacteria and RNAi worm plates, culturing of the worms, and how to assess the effects of RNAi on the worms. RNAi is frequently used to perform reverse genetic screens in order to reveal which genes are important to carry out specific biological processes. Furthermore, automated reverse genetic screens allow for the efficient knockdown and analysis of a large collection of genes. Lastly, RNAi is often used to study the development of C. elegans. Since its discovery, scientists have used RNAi to make tremendous progress on the understanding of many biological phenomena.

RNA Interference RNAi in Caenorhabditis elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target ...

RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56889/application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression">Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the principles behind RNAi treatment in C. elegans and demonstrates a protocol to knockdown lin-35 in a transgenic worm strain.

ציפוי RNAi עבור C. elegans Feeding: טכניקה להשראת ביטוי dsRNA מטרה ב- E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. ...

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטות מתוקננת למדידת אינדוקציה של תגובת הלם חום באלבורבדיוטיס

הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans

כלי RNAi ספציפיים לרקמות לזיהוי רכיבים לאיתות מתח מערכתי

כלי RNAi ספציפיים לרקמות לזיהוי רכיבים לאיתות מתח מערכתי

ג. אלגנס אחזקה

RNAi in C. elegans

ציפוי RNAi עבור C. elegans Feeding: טכניקה להשראת ביטוי dsRNA מטרה ב- E. coli