Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

우리 기술 지원에 대 한 알리 나 엘-칼 릴리, 그리고 마 르 티 나 Hajduskova 감사합니다. 우리 원고에 의견에 대 한 Tursun 그룹의 회원을 감사합니다. 이 작품은 ERC-StG-2014-637530 ERC CIG PCIG12-가-2012-333922에 의해 후원 되었다 하 고 헬름홀츠 협회에 분자 의학에 대 한 최대 Delbrueck 센터에 의해 지원 됩니다.

동물 보호에 관하여 여기에서 설명한 모든 방법 LaGeSo 베를린, 독일에 의해 승인 되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol>
	<li>NGM-한 천 배지 (1 L)
	<ol>
		<li>NaCl의 3 세대, 펩 미디어 (예: Bacto-펩), 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독, 후 추가 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고), 콜레스테롤의 1 mL 1 mL의 1 M MgSO4, 1 mL의 1 M CaCl2, 25 mL의 1 M K2PO4, 고 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM Agar RNAi 접시 (1 L)
	<ol>
		<li>NaCl의 3 세대, 펩 미디어의 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독 후 추가, 콜레스테롤 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고)의 1 mL 1 M MgSO4의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl2, 1 M K2가4의 25 mL, 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL, 1 M IPTG의 1 mL 고 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>파운드-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>효 모 5 g 추출, 5 g의 NaCl, 한 천, 10 mL의 1 M Tris pH 8.0의 20 g, 펩 미디어의 10 g를 추가 합니다. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL와 5 mg/mL 항생물질의 2.5 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 매체 (1 L)
	<ol>
		<li>펩 미디어의 10 g을 추가, 효 모 5 g, NaCl의 5 g 및 10 mL 1 M Tris pH 8.0의 추출. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-버퍼 (1 L)
	<ol>
		<li>나2HPO4의 6.0 g, KH2포4의 3 세대, 5 g의 NaCl, 그리고 젤라틴의 50 밀리 그램을 추가 합니다. 사용 하기 전에 1 M MgSO4의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>표백 솔루션 (10 mL)
	<ol>
		<li>1 mL NaClO와 5 N NaOH의 2 개 mL를 추가 합니다. 10 mL에 H2O를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2입니다. RNAi 접시의 준비
참고: C. 선 충 은 선 충 류 성장 매체 한 천 (Agar NGM)10,11의 7.5 mL를 포함 하는 6 cm 배양 접시에 실험실에서 일반적으로 경작 된다. 이 프로토콜은 15 ° c.에서 보관 하는 벌레에 대 한 최적화 NGM 접시를 준비 하려면 곰 팡이 및 세균 오염을 방지 하기 위해 표준 무 균 기법을 사용 합니다. 다음은 RNAi에 대 한 시 약으로 보충 NGM 접시를 준비 하는 프로토콜입니다.
<ol>
	<li>1mm 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 및 50 µ g/mL carbenicillin 6 cm NGM Agar RNAi 접시를 준비 합니다. 그들은 어두운12실 온에서 24-48 h 동안 건조 하자.
	<ol>
		<li>어둠 속에서 4 ° C에서 RNAi 번호판을 유지. 14 일 보다 오래 된 경우 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>50 µ g/mL를 포함 하는 파운드-한 천 배지에서 사용 가능한 RNAi 도서관13 에서 냉동된 글리세롤 주식에서 린-53 유전자 DNA 시퀀스와 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 (대장균 HT115) 클론 선택 carbenicillin와 3 상 줄이 패턴을 사용 하 여 12.5 µ g/mL 항생물질. 37 ° C 하룻밤12에서 박테리아 성장. 이 복제는 박테리아에 린-53 dsRNA의 IPTG 종속 생산을 수 있습니다.
	<ol>
		<li>또한, 빈 벡터 제어14유전자 시퀀스 없이 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 성장.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>다음 날, 린-53 에서 단일 식민지 나 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 빈 벡터 파운드-한 천 격판덮개 팁과 액체 LB 중간14 50 µ g/mL carbenicillin 보충의 2 개 mL를 포함 하는 별도 문화 관으로 그들의 각각을 예방. 성장 37 ° C에서 하룻밤 문화 광학 밀도 (OD)를 도달할 때까지 600 nm의 0.6-0.8. 외경15분 광 광도 계 사용 하 여 측정 합니다. 주의: 액체 LB 미디어 없어야 감소 RNAi 효율 12 리드를 먹이 동안 항생물질의 포함부터 박테리아 글리세롤 주식에서 질주 사용 파운드-한 천 배지와 달리 항생물질</li>
	<li>6 cm NGM Agar RNAi 번호판은 multipipette를 사용 하 여 각 세균성 문화 (린-53 또는 빈 벡터)의 500 µ L를 추가 합니다. 건조를 어둠 속에서 실 온에서 하룻밤 닫힌된 뚜껑 접시를 품 어. 이 기간 동안, NGM 접시에서 IPTG dsRNA 박테리아에서의 생산을 유발 한다.
	<ol>
		<li>실험 당 세균성 문화 당 3 접시를 사용 합니다. 이 기술 3 각 실험에 대 한 복제를 제공할 것입니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 박테리아와 말린된 NGM agar RNAi 접시를 저장.</li>
</ol>
3. 선 충 C. 변형 BAT28의 준비
<ol>
	<li>웜 변형 transgenes otIs305 를 포함 하는 BAT288 유지 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] 및 ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 표준 NGM-한 천 배지를 사용 하 여 15 ° c.에 OP50 박테리아에 참고: 선 충 문화에 자세한 프로토콜에 대 한10를 참조 하십시오. Rol-6(su1006) 는 지배적인 대립 유전자 이며, 일반적으로 사용 하는 phenotypic 주입 마커16 일반적인 회전 이동 시키는. 그것은 otIs305 transgene에서 추적을 사용 hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>15 ° C에서 BAT28 긴장의 precautious 활성화를 방지 하기 위해 항상 유지는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. 가능한 만큼 많이 긴장을 처리 하는 동안 15 ° C 보다 높은 온도에 노출 줄일.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>나이-동기화 웜, 표백 기술17을 사용 합니다.
	<ol>
		<li>성인과 900 µ L M9 버퍼를 사용 하 여 BAT28의 계란을 포함 하 6 cm NGM Agar 접시를 씻어. 펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>0.5-솔루션을 표백의 1 mL을 추가 하 고 어른 벌레 버스트 오픈 시작 때까지 대략 1 분 동안 튜브를 흔들어. 모니터는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여입니다.</li>
		<li>펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>M9 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 900 x g에서 centrifuging 여 웜 펠 릿 3 번을 씻어.</li>
		<li>청소 계란 OP50 박테리아와 시드 신선한 NGM 접시에 놓습니다. 성장 15 ° C에 OP50 박테리아에 표백된 인구 L4 단계 (약 4 일)에 도달할 때까지. 표준 stereomicroscope를 사용 하 여 웜18 의 복 부 측에 따라서 대략 중간 흰색 패치 L4 애벌레를 인식할 수 있습니다. 참고: 세균 셀 린-53의 고갈에 따라 신경 변환 형을 달성 하기 위해, 그것은 부모의 세대 (P0)에 고갈 될 필요가 있다.</li></ol></li></ol>변환 형에 대 한 점수는 다음 세대 (자식 세대 f 1)에 착수 된다. 달성 하기 위하여는 P0에 이미 파괴 린-53 , L4 동물 RNAi를 받게 됩니다.
	
	
	<li>수동으로 전송 50 L4 단계 웜 NGM 접시에 백 금 철사를 사용 하 여 복제 당 그 어떤 박테리아를 포함 하지 않으며 모든 전송된 OP50 박테리아에서 벌레를 하자. 벌레에 약 5 분 동안 이동 하자. NGM Agar RNAi 격판덮개에서 사용 박테리아는 이전 린 53 RNAi 박테리아 (또는 빈 벡터 제어) 각각 RNAi 번호판을 시드.
	<ol>
		<li>실제 RNAi 번호판 OP50 박테리아를 전송 하지 마십시오. 온도 15 ° c. 보다 높은 긴장의 노출 시간을 최소화 하기 위해 빠른 작업</li>
	</ol>
	</li>
	<li>벌레의 F1 자손 L3-L4 단계에 도달할 때까지 약 7 일에 대 한 15 ° C에서 NGM Agar RNAi 접시에 벌레를 품 어. 그들은 수 있다 명확 하 게 구분 P0 동물에서 크고 F1 자손 보다 두꺼운 이기 때문.
	<ol>
		<li>시각적으로 확인 하십시오 표준 stereomicroscope 아래 그림 1에서 보듯이 F1 자손 웜 튀어나온 음부 (pvul) 표현 형을 표시 하는지 여부. 린-53 에 대 한 RNAi는 다 면 발현 성 효과 고 RNAi 린-53 에 대 한 성공 여부를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다 pvul 표현 형. 참고: 린-53 에 대 한 RNAi는 F1 배아의 치 사 율을 일으킬 수 있습니다. 이 효과 동물 L3-L4 단계에 도달 하기 전에 접시 15 ° C 보다 더 높은 학위에 노출 되는 경우 증가 합니다. 죽은 태아 체포 개발 및 해칭의 부족에 의해 인식 될 수 있다.</li>
		<li>IPTG 이기 때문에 빛에 민감한 접시 어둠 속에 품 어.</li>
	</ol>
	</li>

4입니다. 생식 세포 프로그래밍의 유도
<ol>
	<li>품 어 시험된 RNAi 판 린-53 를 포함 하 고 빈 체 1을 활성화 하기 위해 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 벡터 RNAi 대우 F1 자손. 발명된 인큐베이터를 사용 하 여 보다 효율적인 열-충격에 대 한 수 있기 때문.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 30 분 동안 복구 하 고 어둠 속에서 하룻밤 25 ° C에서 번호판을 품 어에 열 충격을 동물 허용.</li>
	<li>Gcy-5prom::gfp의 GFP 필터 동물 검사 형광 광원에 결합 하는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여- 그림 2와 같이 벌레의 중간 본문 영역에서 신호를 파생. GFP 신호에 대 한 설정된 현미경: 여기 488에서 최대 방출 최대 509에서 nm nm.</li>
	<li>천 패드 포함 된 현미경 슬라이드19중순 신체 영역에 GFP 신호와 장착 동물에 의해 생식 세포 신경 변환의 정도 평가 합니다.
	<ol>
		<li>평가 형 penetrance 어두운 동물 대 신경 변환 세균 셀을 보여주는 동물의 수를 계산 합니다. 일반적으로, 약 동물의 30% 표시 개별 GFP 신호 린 53 고갈에 따라 생식에 반면 동물의 5% 이상 빈 벡터 RNAi 시 생식에 확산 GFP 신호.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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저자는 아무 경쟁 관심사 존재 선언.

유전자 변형 C. 선 충 을 사용 하 여 설명된 프로토콜 동안 BAT28 변형 및 린-53 에 대 한 RNAi는 간단, 단계 수는 중요 한 순서에 신경 프로그래밍을 생식 세포의 예상된 결과 보장 하기 위해. 그것은 중요 한 실험 전에 항상 긴장 BAT28 15 ° C에서 유지 됩니다. 처리 및 긴장의 유지 보수, 동안 15 ° C 이상의 온도에서 시간 필요가 최소화 가능 한 한 많이 있다. 적절 한 열 충격 조건을 체 1 overexpression의 부족 한 유도 하지 ASE 신경 변환 생식 세포 귀 착될 것 이다 때문에 중요 하다. 이 프로토콜에 설명 된 대로 형 penetrance를 측정 하 여 검출 될 수 있다. 광범위 한 열-충격 동물의 치 명도 될 수 있습니다. 예를 들어, 배치 된 안 벽 근처 또는 정적 공기 인큐베이터의 하단 바닥에 종종 접시 광범위 한 열 처리 경험. 따라서, 배기 열 인큐베이터를 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 열-충격 유도의 타이밍은 애벌레 단계 이전 체 1 의 오버 식 이후 중요 L3 소성 gcy 5prom::gfp 유도 (그림 3) 외 음부 등의 다른 지역에서 발생할 수 있습니다 다음 9. 또한, 광범위 한 열-충격 형 penetrance 5% 그리고 다른 조직, 즉 내장의 증가 자동 형광을 확장 해야 하는 빈 벡터 RNAi 동물에 의해 검출 될 수 있다.
산발적으로, RNAi 박테리아는 그들의 활동을 효율적으로 대상 유전자의 dsRNA를 생산을 잃을 수 있습니다. 불행히도,이 RNAi 실험 검색된 사전 수 없습니다. 이러한 경우에는 글리세롤에서 신선한 행진 프로토콜의 섹션 2에 설명 된 대로 성장 한다. 경우 아직 아무 RNAi 발생 다 면 발현 성 형 pvul 표현 형 린-53, 다음 플라스 미드에 대 한 성공적인 RNAi 기인한 각각 박테리아에서 DNA 격리와 같은 표시를 수행 해야 하 고 신선한 HT115 박테리아가 될 필요가 린-53 시퀀스가 포함 된 L4400 플라스 미드와 변형.
중요 한 것은, BAT28 긴장은 한 사출 마커 pRF4와 동물의 transgenesis 동안에 사용 되었다에 의해 발생 하는 롤러 형은 hsp-16.2prom::che-1 DNA 구조. 때때로, 동물의 입을 수 있습니다 나타내는 롤링 형을 잃고는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. BAT28 긴장을 제대로 유지 하려면 신선한 접시 10 롤러 동물을 선택 하 고 전파 동물을 압 연에 대 한 선택.
응용 프로그램 프로토콜의 동물 부모 (P0 세대)는 린-53 RNAi에 노출 되지 생식 세포 신경 변환 모성 구조4때문에 표시 되지 것입니다 즉 F1 RNAi 절차로 제한 됩니다. 세균 세포 뉴런으로 변환 하는 다른 절차 Ciosk와 동료15 RNAi 노크 다운 gld-1 의 녹음 방송 요인의 이상의 식 없이 mex-3 를 사용 하 여 설명 하고있다. 그러나, 얻은 뉴런 뉴런의 특정 종류에 속하지 않는 및 생식 세포는 또한 gld-1 및 mex-315의 RNAi 중재 고갈 시 근육 처럼 세포로 변환. 이전에, 그것은 입증 되었습니다 RNAi 린-53 에 대 한 허용-표현의 Pitx 형 homoedomain 녹음 방송 요인 체-14 대신 UNC-3016 시 GABAergic 신경-같은 세포로 생식 세포 변환 . 미래 방향에 대 한 다른 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인 린-53 고갈 세균 세포 여부를 테스트할 수 있습니다 특정 뉴런 보다 다른 셀 형식으로 변환할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 조직적 bHLH 녹음 방송 요인 HLH-1, 포유류 MyoD17체의 overexpression 린-53 RNAi5 시 근육에 생식 세포의 전환을 유도합니다. 다른 유전 스크린의 숫자에 대 한 세균 셀 린-53 RNAi 시 특정 신체 세포 유형 및 적절 한 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인의 과다 식 설립 프로그래밍을 사용할 수 있습니다. 이러한 억압 또는 증강 화면 셀 운명 변환 하는 동안 역할 규정 경로 해 부 수 있습니다.

세포 운명 조직적 TF MyoD 같은 소성 TF 식으로 프로그래밍을 때 overexpressed, 근육 같은 셀1에 직접 변환 fibroblasts 수십 년 동안 연구 집중 되었습니다. 그러나, 차별화 된 셀이이 과정, 그들의 세포질 신원을 보호 메커니즘 때문에 내 화 많습니다. 세균 세포 보호의 유사한 정도 보여 고 종종 운명을 유도 TF의 이상의 표현 시 다른 세포 유형으로 생식 세포 변환 방지 하기 위해 방 벽으로 작동 하는 기본 메커니즘이 있습니다. 일반적으로, 히스톤 수정 및 chromatin 구조 같은 후 성적인 규칙 세포 운명을2,3의 변환에 대 한 장애를 부과 한다. 우리 이전 반전 유전학 C. 선 충 에 RNAi 노크-다운을 사용 하 여 적용 하 고 셀룰러 정체성을 보호 하 고 그로 인하여 세균 세포의 신경4로 프로그래밍을 중화 하는 요인 확인. 특히, polycomb 억압 적인 복잡 한 2 (PRC2) 및 높은 보존된 히스톤 보호자 린-53 (CAF-1/RBBP/4/7 인간의) C. 선 충에서 glutamatergic 맛 신경 세포 등 특정 신체 세포 유형으로 생식 세포의 직접 변환 방지 4 , 5. 장벽 요소 프로그래밍이 세균 세포를 식별 하기 위해 사용 하는 열 충격 유도할 수 있는 Zn 손가락 TF 체-1을 운반 하는 유전자 변형 동물. C. 선 충, glutamatergic 맛 신경 세포의 운명을 ASE6라고 지정의 두 머리 신경 체-1 일반적으로 표현 된다. ASE 신경 운명 ASE 특정 형광 기자 gcy 5prom::gfp의 표현에 의해 구상 될 수 있다. GCY-5 chemoreceptor ASE 오른쪽 신경7만 표현 이다. RNAi에 의해 린 53 소모 및 열 충격에 의해 체 1의 광범위 한 소성 식의 유도, 생식 세포는4,5 생체 내에서뉴런으로 변환할 수 있습니다. 중요 한 것은, RNAi 치료의 타이밍은 린-53 RNAi에 노출만 어른 벌레 (P0 세대) F1 자손 동물 신경4에 프로그래밍에 대 한 허용은 생식을 일으키로 중요 합니다.
C. 선 충 에서 신경 변환 절차를 위에 설명 된 생식 세포 생물학 질문 셀 운명 프로그래밍에 경로 신호의 의미 등의 다양 한 연구를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 노치 신호 전달 경로 생식 세포8프로그래밍 과정의 의미를 공부 하기 위하여 린-53 에 대 한 RNAi 따라 ASE 뉴런으로 재프로그래밍 체 1 유발 세균 셀을 사용 합니다. 린-53 와 demethylase 인코딩 히스톤 공동 고갈에 더블 RNAi를 수행 하 여 우리 노치 신호 통로 중화 PRC2 중재 유전자 표현의 UTX-1 생식8에서에서 활성화 하 여 입을 보여주는 유전자 utx-1 . 이 생식 세포 변환할이이 프로토콜에서 설명 하는 신경 세포 프로그래밍의 컨텍스트에서 다른 발달 및 환경 그대로 유기 체에와 같은 복잡 한 생물 학적 과정을 공부 하 사용 될 수 보여 줍니다. 조건입니다. 또한, 그것은 과도 다른 운명을 유도 TFs 셀룰러 소성9의 금지에서 그들의 역할을 연구 하거나 유도 하는 세균 세포의 프로그래밍에 대 한 그들의 잠재력을 평가 표현 하 여 생식 세포를 도전 하는 관점을 제공 한다 다른 셀에 비보를 입력합니다.
포유류 조직 문화는 또한 세포 운명 프로그래밍의 다양 한 측면을 공부 허용, 문화에서 성장 하는 세포 신호 경로 조건 그대로 체에 비해 모방 하는 능력을 제한 했다. 따라서, C. 선 충 검사 vivo에서프로그래밍 하는 동안 노치 신호 등 다양 한 생물 학적 과정의 역할에 대 한 다재 다능 한 모델 이다. 또한, 상대적으로 쉽게 유지 하 고 낮은 비용에 대 한 유전자 수정 유전 스크린에 대 한 강력한 모델입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&amp;nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast extract&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incubators&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td><td>for heat-shock</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>for maintenance of worm strains at 15 &amp;deg;C or 25 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>M205 FA</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Imaging) + camera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Imaging) + camera</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli HT115&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5&lt;br/&gt; promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse&lt;br/&gt; III minus).</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli OP50&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Uracil auxotroph E. coli strain</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;BAT28:&lt;/strong&gt; &lt;em&gt;otIs305 (hsp16.2prom::che-1::&lt;br/&gt; 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi Clones&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>empty vetor: L4440</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Misc.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm pick&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td></tr></tbody></table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

세포 생물학 과정을 공부 하 고 특정 종류의 id를 변환 하는 동안 유지 하 고 세포 정체성 보호 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 합니다. 선 충 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 있는 특정 신경 세포로 생식 세포의 전환 설립된 셀 정체성 보호 규정 경로 해 부 하기 위해 유전 스크린을 수행 하기 위한 강력한 도구입니다. 특정 유형의 신경 ASE 라고 세균 세포의 프로그래밍 아연 손가락 녹음 방송의 광범위 한 이상 식 허용 하는 유전자 변형 동물 요인 (TF) 체-1 필요 합니다. 생 체-1은 두 개의 머리 뉴런에 독점적으로 표현 되며 gcy 5prom::gfp 기자에 의해 쉽게 구상 될 수 있다 glutamatergic ASE 신경 세포 운명을 지정 하는 데 필요한. 열 충격 발기인 구동 체 1 유전자 식 구조를 포함 하는 횡단 유전자 열 충격 처리 시 전체 동물에 체 1의 광범위 한 잘못 표현 수 있습니다. Chromatin 규제 요소 린-53와 열 충격 유발 체 1 -식에 대 한 RNAi의 조합을 ASE 신경-같은 세포로 생식 세포의 프로그래밍 이끌어 낸다. 우리 기술 여기 유전자 변형 동물의 열 충격 처리에 대 한 적절 한 조건과 특정 RNAi 절차 성공적으로 신경 변환 생식 세포를 유도 하기 위하여.

그림 1에서 보듯이, F1 동물 pvul 표현 형을 전시 하는 린-53 RNAi의 성공적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 이 동물 들은 그림 2에서 볼 수 있듯이 체 1 -식의 열 충격 유도 따라 ASE 신경-같은 세포로 그들의 생식 세포의 변환을 허용 하는 경향이 있다. 빈 컨트롤에 자란 벌레는 달리 RNAi 린-53 RNAi 치료 기술된 이전4, 으로 하룻밤 사이 열 충격 및 25 ° C 부 화 후 중간 본문 영역에서 소성 GFP 신호를 표시 하는 동물을 얻을 것입니다 벡터 8.이 벌레의 epifluorescence 현미경 가까이 시험 드러내 보여주는 GFP 신호 또한 세포는 신경 세포에 대 한 전형적인 신경 같은 계획 (그림 2B, 흰색 화살표) 표시. 린-53 에 대 한 RNAi 실패 했다 또는 열 충격 조건을 적절 한 되지 않은 경우 치료 동물 (그림 2) GFP 신호 제어 RNAi에 닮은 것 이다. 중요 한 것은, 동물 중반 L3 단계에 도달 하기 전에 체 1 의 오버 식 열 유도 의해 유도 하지 마십시오. 체 1 overexpression 유도 시간에 너무 젊은 했다 동물 그림 313에서 같이 개발 외 음부 같은 본문의 다른 지역에서 소성 gcy 5prom::gfp 식을 표시할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
그림 1: 린-53에 대 한 RNAi에 의해 발생 하는 Pvul 형. (맨 위) L4/젊은 성인 단계 F1 자손 벌레의 DIC 그림 컨트롤이 나 린-53 RNAi 대우 어머니에서 파생. 바 규모 = 20 µ m. (하단) 동물 린-53 RNAi 디스플레이 튀어나온 음부 (pvul) 형 (검정 화살표 머리)로 치료. Pvul 형 린-53 에 대 한 RNAi 되었는지 확인 합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
그림 2: 웜 성공적으로 재설정된 생식 세포와 신경에. (A) 빈 벡터에 성장 하는 BAT28 변형 동물 체 1 overexpression의 열 충격 유도 후 GFP 신호는 생식에 표시 하지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. (B) BAT28 변형 동물 성장 빈 벡터 제어에 린-53 에 RNAi 디스플레이 gcy 5prom::gfp 신호 중간 몸 지역에 성장 하는 RNAi 동물 달리. 그림 63 X 배율에서 GFP 신호와 중반 바디 섹션의 GFP-긍정적인 세포 돌출 (흰색 화살표 머리)을 보여주는 공개. 이 형태학 기능 세균 세포 ASE 같은 신경 세포로 변환 받았습니다 나타냅니다. 화이트 별표 소장 파생 된 자동 형광 표시합니다. 모든 사진 확대 및 63 X 배율 X 20 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 흰색 파선 웜 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
그림 3: 소성 GFP와 초기 단계 웜. BAT28 변형 동물 열-충격 체 1 overexpression L2 등 초기 애벌레 단계에 대 한 유도 했다 빈 벡터 RNAi 박테리아에 성장 중순 신체 영역 (흰색 별표)에서 GFP 신호를 표시 합니다. 이러한 신호는 생식 세포 프로그래밍으로 인해 되지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

7.6K 조회수.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association. 이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서. 

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Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

연구

환경과학

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

의 삼투 회피 Caenorhabditis 엘레간스 : 두 유전자의 시냅틱 기능, 인간의 Orthologues NRXN1과 NLGN1</em자폐증을위한>로 후보

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

생물학

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

신경과학

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

발생학

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Tissue-Specific RNAi Tools to Identify Components for Systemic Stress Signaling

Over the past decade there has been a transformative increase in knowledge surrounding the regulation of protein quality control processes, unveiling the importance of intercellular signaling processes in the regulation of cell-nonautonomous proteostasis. Recent studies are now beginning to uncover signaling components and pathways that coordinate protein quality control from one tissue to another. It is therefore important to identify mechanisms and components of the cell-nonautonomous proteostasis network (PN) and its relevance for aging, stress responses and protein misfolding diseases. In the laboratory, we use genetic knockdown by tissue-specific RNAi in combination with stress reporters and tissue-specific proteostasis sensors to study this. We describe methodologies to examine and to identify components of the cell-nonautonomous PN that can act in tissues perceiving a stress condition and in responding cells to activate a protective response. We first describe how to generate hairpin RNAi constructs for constitutive genetic knockdown in specific tissues and how to perform tissue-specific genetic knockdown by feeding RNAi at different life stages. Stress reporters&#160;and behavioral assays function as&#160;valuable readouts&#160;that enable&#160;the fast screening of genes and conditions modifying systemic stress signaling processes. Finally, proteostasis sensors expressed in different tissues are utilized to determine changes in the tissue-specific capacity of the PN at different stages of development and aging. Thus, these tools should help clarify and allow monitoring the capacity of PN in specific tissues, while helping to identify components that function in different tissues to mediate cell-nonautonomous PN in an organism.

<meta charset="utf8"></head><body>전신 스트레스 신호전달을 위한 구성 요소를 식별하기 위한 조직 특이적 RNAi 도구

Maintenance of organismal proteostasis requires the coordination of protein quality control responses such as chaperone expression from one tissue to another. Here, we provide tools used in C. elegans that allow monitoring of proteostasis capacity in specific tissues and determine intercellular signaling responses.

전신 스트레스 신호전달을 위한 구성 요소를 식별하기 위한 조직 특이적 RNAi 도구

Over the past decade there has been a transformative increase in knowledge surrounding the regulation of protein quality control processes, unveiling the ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

예쁜 꼬마 선충 유지

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

교육

JoVE Science Education

기초 생물학

생물학 I : 효모, 초파리, 예쁜 꼬마 선충

RNAi in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target gene. In the nematode, C. elegans, RNAi is particularly easy and effective because it can be delivered simply by feeding the worms bacteria that express double stranded RNA (dsRNA) that is complementary to a gene of interest. First, this video will introduce the concept of RNA interference and explain how it causes targeted gene knockdown. Then, we will demonstrate a protocol for using RNAi in C. elegans, which includes preparation of the bacteria and RNAi worm plates, culturing of the worms, and how to assess the effects of RNAi on the worms. RNAi is frequently used to perform reverse genetic screens in order to reveal which genes are important to carry out specific biological processes. Furthermore, automated reverse genetic screens allow for the efficient knockdown and analysis of a large collection of genes. Lastly, RNAi is often used to study the development of C. elegans. Since its discovery, scientists have used RNAi to make tremendous progress on the understanding of many biological phenomena.

RNA Interference RNAi in Caenorhabditis elegans

예쁜 꼬마 선충에 RNAi의 적용

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target ...

RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56889/application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression">Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the principles behind RNAi treatment in C. elegans and demonstrates a protocol to knockdown lin-35 in a transgenic worm strain.

예쁜꼬마선충 공급을 위한 RNAi 도금: 대장균에서 표적 dsRNA 발현을 유도하는 기술

Source: Kolundzic, E., et al. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. ...

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

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예쁜 꼬마 선충 유지

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