המחברים רוצה להודות ד"ר סטפני Spohn, באזל Abuaita לדיונים שימושיים רבים על microinjection תא צורב. JRS נתמך על ידי ה מעיים תאי גזע Consortium (U01DK103141), פרויקט מחקר שיתופי שמומנו על ידי המכון הלאומי של הסוכרת העיכול, מחלות כליה (NIDDK), המכון הלאומי לאלרגיה ואת ומחלות זיהומיות (NIAID). JRS VBY נתמכים על ידי הרומן NIAID, מערכות מודל אלטרנטיבי קונסורציום המעית מחלות (NAMSED) (U19AI116482). DRH נתמכת מנגנוני פתוגנזה מיקרוביאלי הכשרה המענק של המכון הלאומי של אלרגיה ומחלה זיהומית (NIAID, T32AI007528) את פרס קלינית ומדעי Translational למכון מישיגן קלינית ובריאות מחקר (UL1TR000433).
קבצי נתונים וקוד ניתוח נתונים המשמשים כתב יד זה הינם זמינים https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol>
	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה יוצר שיטה כללית של microinjection של HIOs hPSC, נגזר, רקמות, נגזר organoids מעיים, המדד של מחסום האפיתל חדירות בזמן אמת. הראו גם גישת ניתוח ופרשנות של נתונים שנוצר באמצעות שיטות אלה. בהתחשב אימוץ הגוברת של organoids מעיים דגם מערכות16,20,21,28 , האינטרס מכשול מעיים חדירות כרלוונטיים פיזיולוגית פונקציונלי ארוכת שנים תוצאה3,4,5,6, אנו צופים כי אחרים העובדים בתחום זה יוכלו להחיל ולבנות על שיטות אלה.
ישנם מספר שלבים אשר הם קריטיים ליישום של טכניקה זו. גישה hPSC באיכות גבוהה - או רקמות רקמות HIO נגזר גלובאלים לפני ניסויים נרחבים עם microinjection. HIO למפלגות עשויים להיות heterogenous, עם וריאציה הן בגודל וצורה, למרות רקמות זהות ועל מורפולוגיה הסלולר הוא מאוד לשחזור כאשר ניצול הוקמה מתודולוגיה ליצירת HIOs24. כדורי HIOs המורכב לומן שקופה למחצה יחיד ומדידת כ- 1 מ מ קוטר הינם אידיאליים עבור microinjection ומדידה של זריחה luminal בזמן אמת. במקרים מסוימים, microinjection ייכשל, וכתוצאה מכך התמוטטות HIO או ברור דליפה של חומר מוזרק. ניתן להסיר HIOs שנכשל מתרבות גם שיקול של המשתמש באמצעות micropipette סטנדרטי. שקול את העדשות המטרה זמין על פלטפורמת הדמיה בעת בחירת HIOs עבור microinjection ודימות. באופן כללי, 2-4 X המטרה עדשות הינם אידיאליים עבור לכידת את האות מלאה HIO פלורסנט, למרות מטרה X 10 עשוי לשמש אם עדשות צריכת חשמל נמוכה אינם זמינים או אם HIOs זמין &#60; 1 מ מ קוטר. תוכנות ליצירת תמונות לאפשר עבור לכידת תמונות פלורסנט בנקודות מוגדרות אוטומטית לאורך זמן.
מספר שינויים של פרוטוקול זה אפשריות על מנת להתאים את הדרישות ניסיוני. לדוגמה, התוצאות של בדיקות תפקוד המחסום עשוי להיות תלוי בגודל מולקולרי של תרכובות של שימוש43 , אפשר יהיה לבחון את ההכנות לתוספי של משקל מולקולרי בדרגות שונות. בנוסף, ניתן לבצע הדמיה brightfield בנוסף זריחה הדמיה כמחוון של שלמות המבנה הכולל של רקמות25. בעת ביצוע microinjection של חיידקים לחיות25,28,31,32,33,44, זה ייתכן שיהיה צורך להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין או גנטמיצין HIO תרבות לתקשורת לפני או לאחר microinjection. החלק החיצוני של microcapillary תזדהם במהלך מילוי עם המתלה התרבות חיידקי, זה עשוי להיות מועבר בתקשורת HIO. לחלופין, ניתן לבצע microinjection HIOs מושעה בתוך מטריצה חוץ-תאית (למשל, Matrigel) ללא מדיה, הוספת המדיה לאחר השלמת את microinjection. זה עלול להגביל את זיהום מטריצה חוץ-תאית, הפנים החיצוניים של HIO. בעת תכנון מבחני צמיחת חיידקים, ייתכן צורך להסיר אנטיביוטיקה בתקשורת לאחר 1-2 h כדי למנוע האטה או מניעת התפתחותם של אורגניזמים microinjected.
לבסוף, מתוך הכרה כי לא כל החוקרים תהיה גישה מיקרוסקופ ציוד מתאים במבחנה הדמיה, זה חשוב לציין כי ניתן להחיל את ההליכים המתוארים פרוטוקול זה לאיסוף נתוני קרינה פלואורסצנטית מתמונות שצולמו ב timepoints קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל ללא לכידת התמונה האוטומטי או פקדים איכות הסביבה. דוגמאות של גישה זו ניתן למצוא בדו ' ' חות מאת לסלי ווונג. et al. 25, שבדקו difficile ג פעילות הרעלן organoids מעיים נגזר hPSC,. Karve, Pradan et al. 44, שבדקו מחסום האפיתל חדירות ב דומה נגזר hPSC המעי organoids microinjected עם חיה e. coli. פעולה ידנית של ציוד הדימות עלול לגרום גדול וריאציה ולקשיי נרמול האות פלורסנט. כאשר ביצוע הדמיה ידנית של FITC-לתוספי מזריקים HIOs זה חיוני כדי לשמור על הגדלה קבועה, עירור פלורסנט בעוצמה ושעות חשיפה לאורך כל הניסוי כדי להימנע מעיוות המדידות פלורסנט בעוצמה.

האפיתל במעי יוצרת מחסום סלקטיבי המעביר התעבורה כיוונית של חומרים מזינים,2O H, יונים, ו הפסולת תוך מזעור ספציפי exchange בתיווך דיפוזיה של חלקיקים אחרים בין לומן ו mesenchymal רקמות או דם אספקה1,2. החדירות לא ספציפית של המכשול אפיתל המעי מזמן נחשב פרמטר פונקציונלי מפתח מחלה ובריאות3,4,5,6, המשקפת שיעור פעפוע של מולקולות קטנות על פני האפיתל דרך החלל paracellular. מדידה של חדירות מחסום האפיתל יכול להתבצע בחיה מודלים7 , בני אדם חולים8 באמצעות הבליעה של לקטולוז, אשר יש אין טרנספורטר ספציפי של מערכת העיכול, ואת האוסף עוקבות מדידת ריכוזים לקטולוז בדם ההיקפי. סמנים בלע חלופי של פונקציית מכשול כגון פחמימות fluorescently שכותרתו הינם גם זמינים9,10. גישה זו היה מותאם תרביות תאים אפיתל המעי גדל תומך Transwell11, בגישה פשוטה מאפשר בקרה ניסויית גדול יותר, אך גם ביקורת כמו מנבא המסכן של vivo חדירות בשל היעדר תת אפיתל הבדיל ו- מבנה רקמות12. באמצעות לשכות מייצג גישה אחרת ובכל זאת ולאפשר לשקילת מחסום האפיתל פונקציה mucosa מעיים כל לשעבר vivo13. היישום של טכניקה זו לעתים קרובות מוגבל על ידי רקמת זמינות ותנאי13,14. לכן שיטות חדשות אשר לאזן הפארמצבטית ותפוקת עם רלוונטיות הפיזיולוגיות נחוצים.
התפתחויות במבחנה organogenesis הובילו האימוץ של תרביות רקמה 3D דגם מערכות כפלטפורמה מתוחכמים recapitulating את הדינמיקה של רקמות מורכבות15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. בפרט, אנושי pluripotent תאי גזע (hPSC) נגזר organoids מעיים אנושיים (HIOs)19,24 הופיעו כמערכת מודל השפעול צייתן הדירים לצורך המחקר של אינטראקציות מיקרוביאליים המארח ו מחסום האפיתל dynamics25,26,27,28. באופן דומה, organoids נגזר רקמה אנושית (הידוע גם בשם enteroids) הנגזרות הליך הביופסיה פשוטה והוא יכול לשמש כמערכת צייתן ללמוד פיזיולוגיה אנושית ו מחלת15,29,30. Microinjection של organoids מעיים אנושיים מאפשרת למסירה של תרכובות ניסיוני25 או לחיות חיידקים25,31,32,33 הפסגה אפיתל פני השטח של לומן תא צורב. . לסלי ווונג et al. 25 הותאם לאחרונה בטכניקה זו כדי למדוד את מחסום חדירות ב- HIOs microinjected עם fluorescein isothiocyanate (FITC) עם התווית לתוספי בעקבות חשיפה ל: רעלנים חיידקי.
פרוטוקול זה מיועד כמדריך לשקילת מחסום האפיתל חדירות נגזר hPSC HIOs, HIOs, נגזר רקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם שינויים מזעריים, זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של HIOs עם תרכובות ניסיוני. משתמשים ייתכן שנשלים פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופית לאחר microinjection.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

ההתקדמות בתרבות תלת-ממד של רקמות מעיים מושגת באמצעות ביופסיה או שנוצר מתאי גזע pluripotent באמצעות בידול מכוונת, גרמו מודלים מתוחכמים במבחנה של רירית המעי. מינוף מערכות אלה-דגם המתעוררים ידרוש עיבוד של כלים וטכניקות שפותחו עבור מערכות התרבות 2D של בעלי חיים. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת מחסום האפיתל חדירות ב organoids מעיים אנושיים בזמן אמת. זו מושגת על-ידי microinjection של fluorescently-ידי לתוספי, הדמיה-מיקרוסקופ הפוכה מצויד מסננים פלורסנטי. מדידת בזמן אמת החדירות מכשול ב organoids מעיים מקלה על הדור של נתונים זמני ברזולוציה גבוהה ברקמת האפיתל במעי האדם, למרות טכניקה זו ניתן גם ליישם קבוע timepoint הדמיה גישות. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות לשקילת חדירות מחסום האפיתל בעקבות חשיפה סוכנים תרופתי, מוצרים חיידקי או רעלנים או אורגניזמים חיים. עם שינויים מזעריים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של organoids מעיים, משתמשים עשויים לבחור תוספת פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופיים בעקבות microinjection.

HIOs היו הבדיל מתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית בפתרון מטריקס תא כמו בעבר תיאר19,24. לאחר 4 שבועות בתרבות, HIOs היה להרחיב במידה מספקת כדי לאפשר microinjection. HIOs היו microinjected עם 4 kDa FITC מצומדת לתוספי מושעה PBS או PBS המכיל Clostridium difficile רעלן TcdA. ג difficile הוא פתוגן במערכת העיכול הזדמנותית זה מוצגים בתיווך הרעלן רעילות אפיתל HIOs25. כפקד חיובית, EGTA נוספה HIO תרבות המדיה של תת-קבוצה של HIOs מוזרק עם PBS ו FITC-לתוספי. EGTA הוא chelator סידן הגורמת מהירה והתבקשתי פלמור של שלד התא אקטין42. זריחה FITC היה פיקוח בזמן אמת על מיקרוסקופ הדמיה חיה בתוך תא הסביבה מבוקרת, תמונות נלקחו בשבי במרווחים של-10 דקות.
פוסט-הוק ניתוח של נתונים הדמיה גילה הבדלים ניכרים השמירה של זריחה FITC (איור 5). HIOs מוזרק עם PBS נשמר כמעט את כל האות פלורסנט נוכח t = 0, אולם HIOs זה גם הוזרקו TcdA של מטופלים עם EGTA הציג ירידה משמעותית בעוצמת פלורסנט לפי 8 שעות פוסט-microinjection (איור 5A)-נתוני הדמיה היו לכמת עבור כל HIOs בנקודות זמן כל לייצר dataset ברזולוציה גבוהה המייצג את השינוי היחסי בעוצמתם פלורסנט לאורך זמן במצב כל ניסיוני (איור 5B). הבדלים חדירות אפיתל הוערכו על ידי חישוב חיסול אכזרי הזמן (t1/2 ) של FITC עבור כל קבוצת הטיפול (טבלה 1) השוואת הבדלים t t1/2 בין קבוצות באמצעות הסטודנט t-מבחן. HIOs שטופלו שליטה נשמרים רוב FITC אות ניאון יותר מ 16 שעות (t1/2 = ± 17 0.3 h). טיפול עם EGTA הקטינה באופן משמעותי זמן ביעור FITC-לתוספי יחסי שליטה HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0.2 שעות; P = 1.3 x 10-8). בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו בעבר25, microinjection של TcdA גדל באופן משמעותי מחסום האפיתל חדירות יחסי שליטה טיפול (t1/2 = ± 7.6 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). לפיכך, חיצוני (EGTA) והן microinjected (TcdA) תרכובות המסוגלים גרימת שינויים משמעותיים במחסום האפיתל חדירות ב- HIOs. תוצאות אלו מראים כי ההשפעות של מגוון רחב של סוכנים תרופתי מטבוליטים, מוצרים חיידקי, ציטוקינים, גורמי גדילה, תרכובות אחרות על מחסום האפיתל פונקציה עשויים להעריך באמצעות גישה זו.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>טיפול</td>
			<td>Half-life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>להוריד את 95% CI (h)</td>
			<td>העליון 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>שליטה</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>השקיעו 5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: זאת אומרת זמן ביעור (t1/2) עבור FITC-לתוספי ב HIOs שטופלו EGTA או TcdA. יחידות הינן microinjection שלאחר שעות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
איור 1: שהעיצוב הבסיסי של microinjector ו- micromanipulator עבור HIO microinjection. תמונה זו מציגה את המשלים מלאה של ציוד המשמש לביצוע microinjection של HIOs. רכיבי מפתח מסומנות, פרטי הזמנה ניתן למצוא בטבלת חומרים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
איור 2: פולר Micropipette. הנחושת חימום סליל hc, מהדק העליון c1, קלאמפ התחתון (c2), זרוע פולר (הרשות), חום הנבחר דו-מצבי (ht) מזוהים באמצעות החצים. ההגדרה הנכונה של חום 1 ולמשוך מסומנים בטקסט אדום. שיבוץ מראה של פילמנט זכוכית נטענים כהלכה מוכן לחימום. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
איור 3: להחליפן בתמונות של רקמות-derived HIO הזריק FITC-לתוספי. תמונה (A) הממחיש את מיקום microcapillary זכוכית בדיוק לפני הכניסה לתוך HIO ו microinjection. (B) Brightfield דימוי רקמות-derived האנושי מעיים organoids לאחר microinjection של FITC-לתוספי. שימו לב כי האות זריחה נראית לעין אפילו ללא השימוש של ערכת מסנן ספציפי. הגיוון הזה מסייע דיוק microinjection. 3 X הגדלה <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
איור 4: חיים זרימת הדמיה- (א) מסך הממחישות את השלבים הנחוצים להפיכת קבע את הפרמטרים מיקרוסקופ, למצוא את HIOs על השקופית ולשמור את המיקום של הבמה עבור כל HIO לדימות. (B) הדמיה מראש הגדרות עבור לכידת בערוץ FITC במרווחי זמן קבועים בכל התנוחות שצוינו א (ג) הדמיה לאחר ייצוא של נתונים בפורמט DV קבצים כתמונות TIFF עם תמונה TIFF אחת לכל HIO לכל נקודת זמן.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
איור 5: תוצאות נציג. תאי גזע (A) נגזר organoids האנושי מעיים (HIO) microinjected עם 2 מ"ג/מ"ל FITC-לתוספי עם תמונה (4 kDa) במשך 20 שעות. HIOs היו microinjected גם עם PBS (בקרה) או Clostridium difficile הרעלן TcdA (12.8 ng/µL) או מטופלים עם 2 מ מ EGTA הוסיף למדיה תרבות חיצוניים. 4 X הגדלה. (B) מגרש בעוצמה אומר מנורמל FITC לאורך זמן, HIOs שטופלו PBS (בקרה), TcdA או EGTA. קווי שגיאה מייצגים S.E.M. ו- n = 11 HIOs (בקרה), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K Views.  University of Michigan. פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

Video: Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development and biology is scarce. In particular, not much is known about the tooth's epithelial stem cells and their function. We succeeded in developing a novel organoid model starting from human tooth tissue (i.e., dental follicle, isolated from extracted wisdom teeth). The organoids are robustly and long-term expandable and recapitulate the proposed human tooth epithelial stem cell compartment in terms of marker expression as well as functional activity. In particular, the organoids are capable to unfold an ameloblast differentiation process as occurring in vivo during amelogenesis. This unique organoid model will provide a powerful tool to study not only human tooth development but also dental pathology, and may pave the way toward tooth-regenerative therapy. Replacing lost teeth with a biological tooth based on this new organoid model could be an appealing alternative to the current standard implantation of synthetic materials.

We present a protocol to develop epithelial organoid cultures starting from human tooth. The organoids are robustly expandable and recapitulate the tooth's epithelial stem cells, including their ameloblast differentiation capacity. The unique organoid model provides a promising tool to study human dental (stem cell) biology with perspectives for tooth-regenerative approaches.

ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...