המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את המחלות הנגרמות על ידי תפקוד לקוי של מחסום אפיתל על ידי מדידת החדרות לתא האפיתל במעיים במבחנה ובביו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תפקוד מחסום המעי, כגון אלה הקשורים למחלת המעי הדלקתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי חנונית תא אפיתל המעי ניתן להעריך הן במבחנה והן במבחנה.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעת לכיוון טיפול או אבחון של מחלות במערכת העיכול, כי תפקוד לקוי של מחסום אפיתל במעיים תורם למחלות אלה. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך תפקוד מחסום המעי, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון מחקרים רעילות סמים ושלמות מחסום של סוגי תאים אחרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו כמה צעדים קשה ללמוד.
כעת ניתן להבין פעולה מדויקת של שיטה זו באמצעות תיאור טקסטואלי. כדי להתחיל, לגדל תאי Caco-2bbe בבקבוק T75 עם בינוני. להאכיל את flasks באופן קבוע, בהתאם לצפיפות התא.
כאשר התאים הם 80%confluent, להסיר את המדיום ולהשתמש 1-2 מיליליטר של PBS סטרילי ללא סידן לשטוף אותם. מוסיפים 1.5 מיליליטר של טריפסין-EDTA, ומטלטלים בעדינות את הבקבוק. לאחר מכן, מניחים אותו באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ללא נדנדה.
בעוד התאים הם trypsinizing, מוסיף מקום המכיל קרום פוליקרבונט נקבובי לתוך 24 צלחות גם. לאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של מדיום תרבות לתוך התא הבסיסי שהוא החלל התחתון של הממברנה. מוסיפים 5 מיליליטר של מדיום לבקבוקון, ומפיצים במרץ את התאים כנגד החלק הפנימי של הבקבוק 5 עד 10 פעמים, כדי להפריד את התרבות לתאים בודדים רופפים, או שניים עד שלושה גושי תאים.
צלחת 0.166 מיליליטר של התאים לתוך תא apical שהוא החלל העליון של הממברנה. ואז לה הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עד שלושה שבועות. להאכיל את התאים שלוש פעמים בשבוע, באמצעות משאבת לחץ כדי לשאוב בזהירות את המדיום מן התא הבסיסי של כל באר.
ואז בעדינות לטפטף מיליליטר אחד של מדיום לתוך התא apical של כל הכנס. עבור מחקרי ציטוקינות, יום אחד לפני התנגדות חשמלית טרנס-פיתל או מדידות TER, להחליף את המדיום הבסיסי עם בינוני, המכיל 10 ננוגרם למיליליטר של גמא אינטרפרון. ביום הניסוי, החלף את המדיום ב- HBSS המכיל 2.5 או 7.5 ננוגרם למיליליטר של TNF.
כדי לתקן את המונה, הכנס את אלקטרודה התיקון ליציאת הקלט ובחר במצב Ohm. לאחר מכן השתמש במברג כדי לכוונן את בורג R Adjust עד שהמונה יציג קריאה של 1,000 אוהם. מעקרים את האלקטרודות ב-70% אתנול למשך 15 עד 30 דקות ומאפשרים להן להתייבש באוויר למשך 15 שניות.
ואז לשטוף את האלקטרודות במדיום תרבות תא ניסיוני. לאחר מכן, הפעל את הכח ובחר מצב אום. תוך שמירה על האלקטרודות אנכיות, מניחים בזהירות את הקצוות הארוכים של גשרי האלקטרודה בתא הבסיסי, ומבטיחים שהם נוגעים בצלחת.
ואז למקם את הקצוות הקצרים לתוך תא apical, להבטיח שהם נשארים מתחת לפני השטח של המדיום, אבל מעל תרבות הרקמה מכניס. למדוד את ההתנגדות של המדגם ותוספים ריקים ב 0, 1, 2, 3 ו 4 שעות לאחר טיפול ציטוקין. אז תקליט את ההתנגדות.
כדי להשיג עקביות על פני פורמטים שונים של לוח, לחשב את המוצר של ההתנגדות ואת אזור קרום יעיל כפי שמוצג כאן. עבור 24 מוסיף היטב, שטח הממברנה האפקטיבי הוא 0.33 ס"מ רבועים. כדי לגרום קוליטיס, להוסיף DSS למים autoclaved לריכוז הסופי של 3.5% משקל לכל נפח.
לאחר מכן השתמש בתסכום DSS כדי להחליף את מי השתייה בכלובים של זכר בן 8 שבועות C57 עכברים שחורים במשך שבעה ימים בסך הכל. תן מי שתייה רגילים ללא DSS כדי לשלוט בעכברים. אחרי היום השביעי, מעבירים את מי ה-DSS למי שתייה רגילים.
בכל יום, לשקול את העכברים ולהעריך את הציונים הקליניים כפי שהוגדרו על פי חומרת המחלה על ידי ארבעה פרמטרים: שכיבה רקטלית, עקביות צואה, דימום, ופעילות. סכם את הציונים מתוך פרמטרים אלה עבור ציון קליני סופי. כדי לנתח את המצב ההיסטופתולוגי של רקמות המעי הגס שבעה ימים לאחר טיפול DSS, לאחר המתת דם עכברים על פי פרוטוקול הטקסט, לבודד את המעי הגס ואת cecum, ולמדוד את אורך המעי הגס.
חותכים 0.5 מקטעים סנטימטר מן המעי הגס הדיסטלי, ולתקן את הרקמה בצינור בז 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 10% פורמלין לילה. לשטוף את הרקמות הקבועות עם אתנול מדורג וקצילן. ואז להטמיע את הרקמות בפרפין לחתוך שישה מילימטר חלקים עבור המטוקסילין וכתמי אאוסין.
כדי למדוד חן מחסום אפיתל בעכברים הנגרמים על ידי DSS, שבעה ימים לאחר תחילת הממשל DSS, מהר את העכברים במשך שלוש שעות. Autoclave מחט gavage כדי להבטיח סטריליות, ולאחר מכן להשתמש 150 microliters של 80 מיליגרם למיליליטר ארבעה קילודלטון FITC dextran במים סטריליים כדי gavage את העכברים, ולשמור את דקסטרן FITC בשימוש למדוד את העקומה הסטנדרטית לאחר איסוף סרום. לאחר מכן, משקל את העכברים לחישוב חן.
ארבע שעות לאחר מכן, לאחר הרדמה של העכברים על ידי הזרקת IP, לאשר הרדמה נכונה על ידי חוסר רפלקסים ותנועת שפם. ואז למקם את העכברים על בלוק חום במשך חמש דקות. באמצעות זוג מספריים, קליפ חתיכה אחת סנטימטר של הזנב ולאסוף 100 microliters של דם מהזנב לתוך צינור איסוף סרום.
לסובב את הדם שנאסף ב 10, 000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. עם מים, לדלל את הנסיוב 1 עד 4. לאחר מכן, כדי להפוך עקומה סטנדרטית, להשתמש במים כדי להכין את הדילול של דקסטרן FITC בשימוש.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים ל-96 צלחות בארות. באמצעות קורא לוחות, לקרוא את הפלואורסצנטיות בגירוי של 485 ו פליטה של 528. חשב את ערכי ההתקרבות בהתבסס על העקומה הסטנדרטית והכפל בארבעה כדי לתקן את הדילול.
חלק את הריכוז של דקסטרן FITC לפי המשקל כדי לנרמל את הערכים. זה עוזר לנרמל את ההבדל במשלוח דקסטרן FITC אם עכברים חולים, ואיבדו משקל. תאי קאקו-2bbe המוצגים כאן תויגו בכתמי גרעינים ו- F-actin כדי להראות את ההבדל בין תאים מובחנים ומובחנים.
סיבי לחץ נראים בבירור בתאים מו מוצים. לתאים מובחנים יש נפח קטן יותר, גרעינים גדולים יותר ופחות סיבי לחץ מאשר תאים מובחנים. TNF הוא מרכזי לאובדן מחסום מעיים באמצעות ויסות צומת הדוק תלוי MLCK.
כפי שניתן לראות בנתון זה, TNF מקטין באופן משמעותי את TER של מונוליאר Caco-2bbe באופן תלוי מינון, מה שמרמז כי TNF מגביר את החדירה אפיתל. בהשוואה למשקל הגוף הראשוני שלהם, עכברים שטופלו ב- DSS מאבדים כמות משמעותית של משקל. חומרת קוליטיס הוא הבקיע על ידי שכיבה רקטלי, עקביות צואה, דימום, ופעילות.
חתכים של רקמות המעי הגס מוכתמים בהמטוקסילין ואאוסין מראים נזק לריסוס המעי הגס בעכברים שטופלו ב- DSS. בנוסף, אורך קריפטת המעי הגס, כמו גם המעי הגס עצמו, הוא ירד בעכברים שטופלו DSS. לבסוף, יש עלייה של פי שניים בערך ברמות של כתמי דקסטרן FITC בעכברים שטופלו ב- DSS, בהשוואה לעכברי בקרה.
בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור למזער את השגיאה, על-ידי סטנדרטיזציה של הליכים תפעוליים וניצול שיטות סטטיסטיות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תפקוד מחסום המעי לחקור מחלות במערכת העיכול הן באורגניזמים מודליים והן בקווי תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לקבוע את חדירת אפיתל המעי על ידי מדידת TER, gavaging FITC dextran, והתבוננות שינויים מורפולוגיים והיסטוכימיים.
