אנו מודים השותפים שלנו, סטפן ג'ונס, ניה Charrington, ד ר דיאנה Maar, ד ר קופר. סמנתה מן המרכז ביולוגיה דיגיטלית (ביו-ראד בע מ CA) בזכות העיצוב assay תמיכה; Nezar Rghei, Moemen ד ר עבדאללה (Norgen Biotek, קנדה) עצה קריטית בשעת מיטוב פרוטוקול החילוץ RNA; ובדוק שאנון קמפבל, סקוט תרסטון, ג'ף Fensterer, שאנון Martello ו Joellyn אנוס לעזרה עם דרישות וניטור מסחרי.

היצרנים ההנחיות עבור ריאגנטים המפורטות להלן, אלא אם כן שתואר אחרת. מבחני ה-PCR הם מוצרים זמינים מסחרית תוכננה לאתר fusions ROS1 ו רט.
1. עבודה עם ה-RNA כהכנה שעתוק במהופך (RT)-dPCR: מעבדה מומלצות
<ol><li>ליצור סביבה נטולת RNase בעת עבודה עם ה-RNA.<ol>
<li>השתמש תרסיסים זמינים מסחרית שנועד להשבית RNases מזהמים.</li>
		<li>שימוש מוסמך RNase ללא ריאגנטים, טיפים, וצינורות. השתמש בעצות מכשול עבור ערכות-בדיקות ביוץ למניעת החדרת RNases או זיהום צולב של דגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תמיד ללבוש מעיל מעבדה כדי למנוע נפילה בין בגדים לתוך דגימת חלקיקים. לייעד את המעיל מעבדה ספציפי לשימוש עם עיבוד RNA.</li>
	<li>ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום הדגימה מ RNases בעור. משתנים לעתים קרובות כפפות. הערה: נניח מעבדה משטחים מזוהמים עם RNase מאז הם חשופים לסביבה. כפפות לפנות העור, השיער, ידיות, ידיות מקפיא, עטים/סמנים, וכו ' הם ההנחה תהיה כבר לא נטולת RNase.</li>
	<li>Decontaminate פיפטורים, benchtops, צנטריפוגות ומשטחי עבודה אחרים עם ספריי איון RNase לכהן להשתמש.</li>
	<li>במידת האפשר, לשמור על ערכה של ציוד לשימוש עם ה-RNA בלבד.</li>
	<li>למזער שיבושים של זרימת האוויר באזורים מעבדה בעת עבודה עם דגימות RNA כדי למנוע חלקיקים מנפילה לתוך דוגמאות או מזהם את משטח העבודה.</li>
	<li>חנות טהור RNA ב-80 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>הימנע ההקפאה-thaws מרובים של דגימות ה-RNA, כמו זה יכול לגרום השפלה.</li>
</ol>2. דור של חומר ה-RNA האנליטי עבור הפקדים חיובי
<ol><li>עיצוב באמצעות DNA סינטטיים לאור רצפי mRNA גרסאות פיוז'ן של ריבית10.<ol>
<li>פיוז'ן נתון משתנה, בחר מרצף פיוז'ן mRNA הכוללת את אתר פיוז'ן בתוספת אורך מספיק איגוף מכל צד כדי לכסות את אמפליקון PCR.</li>
		<li>בחר רצפי בין 50-250 nt כדי לחקות את הגודל של מחזורי RNA שנלכדה באמצעות פלסמה מועשרת טסיות.</li>
		<li>הוספת רצף יזם T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') 5' בסוף הרצף היעד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סדר רצפים סינתטיים כמו חומצה deoxyribonucleic נטושים כפול (DNA) קטעים.</li>
	<li>לשקם דנ א סינתטי במאגר טריס-EDTA (TE) כדי ריכוז סופי של 10 ng/µL.</li>
	<li>להמיר 60 דנ א סינתטי ng באמצעות במבחנה שעתוק RNA.</li>
	<li>לטהר תעתיקים RNA באמצעות ריאגנט מבוססות-פנול/guanidine12.<ol>
<li>כוללים DNase אני, נטולת RNase כדי להסיר תבנית שרידי דנ א.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד ריכוז מטוהרים במבחנה RNA באמצעות fluorometer זמינים מסחרית עם צבעי RNA ספציפיים ותקנים. ודא שהרנ א נמצא בטווח מקובל בסטנדרטים שבחרת. דילול עשוי להידרש.</li>
	<li>לאשר תמלול מוצלחת על ידי אלקטרופורזה בג'ל באמצעות ג'ל agarose 2% מעורבב עם הכתם ג'ל RNA ומגוון גבוה בסולם הרנ א כולל 50-250 nt גודל.<ol>
<li>עומס 500 ננוגרם של כל במבחנה -RNA על גבי ג'ל.</li>
		<li>הפעל את הג'ל של 5 V/ס מ.</li>
		<li>דמיינו להקות יחיד באמצעות תאורה, ולתעד את התוצאות.</li>
		<li>אשר תעתיק הצפוי גודל עבור כל אחד גרסאות פיוז'ן (מבוסס על עיצוב בשלב 2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאשר זיהוי של כל במבחנה רנ א על ידי שימוש assay PCR הספציפי משתנה בהתאמה RT-dPCR (ראה שלבים 5-8 של פרוטוקול זה).</li>
	<li>אופציונלי: להכין תערובת equimolar של במבחנה RNA המכיל כל אחד על גרסאות פיוז'ן, הגן שליטה GUSB.</li>
	<li>אם מתבצע שלב 2.9: לאשר את זיהוי של כל אחד גרסאות פיוז'ן כלול את התערובת שליטה על-ידי dPCR באמצעות מבחני ה-PCR הספציפי משתנה (ראה שלבים 5-8 של פרוטוקול זה).</li>
	<li>לקבוע ריכוז קלט הרצוי עבור פקדים חיובי אנליטית על-ידי בדיקת ריכוזים ועד 0.25 2.5 fg10. לבחור ריכוז בהתבסס על פלט מספר העותק המבוקש.</li>
	<li>בעקבות אישור, להכין 10 µL aliquots לשימוש יחיד של RNA אנליטית לשימוש בקרה חיובית (שלב 4.4), חנות ב-80 הלעפה תרוטרפמט.</li>
</ol>3. תורם דגימות
<ol><li>איסוף דגימות דם כל אדם 10 מ ל 10 מ ל דם אוסף צינורות (BCT) המכיל כחומר משמר RNA נטול תאים. הערה: כל התורמים האנושי יהיה מחקר שימוש ומאשר לא תורם ספציפי או פרטים מזהים יהיה להיות שנאספו בשימוש במהלך הבדיקה.</li>
	<li>תהליך דגימות דם בתוך מסגרת הזמן שצוין על-ידי היצרן BCT.</li>
	<li>במאגר לפלסמה אנושית רגילה ניתן לרכוש ממקור מסחרי לשימוש בתוך הפקד חיובי אנליטית. להכין לשימוש יחיד, aliquots 1 מ"ל של במאגר לפלסמה אנושית רגילה, חנות ב-80 הלעפה תרוטרפמט לשימוש עם הפקד חיובי (שלב 4.4).</li>
</ol>4. שחזור של מחזורי RNA של פלזמה
הערה: חשוב לעבוד במהירות במהלך הליך זה.
<ol><li>צנטריפוגה צינורות דם מלא-200 g x עבור 20 דקות.</li>
	<li>לאסוף עד 4 מ"ל של פלזמה דם centrifuged אוסף שפופרת באמצעות פיפטה סרולוגית. יש להיזהר לא להפריע או תשאף השכבה המעיל באפי.</li>
	<li>לבודד במחזור RNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית כי יכול ללכוד exosomes, טסיות דם, ללא תא RNA של פלזמה. לבודד RNA מהדגימה בקרה חיובית לצד כל אצווה.</li>
	<li>
להכין את הפקד חיובי כל אצווה של דגימות קליניות כדלקמן:
	<ol>
<li>הפשרת 1 מ"ל איחדו נורמלי לפלסמה אנושית aliquot (שלב 3.3).</li>
		<li>הפשרת 10 µL אנליטית RNA aliquot (שלב 2.12).</li>
		<li>להכין בקרה חיובית על-ידי הוספת 10 µL אנליטית RNA לתוך הדגימה לפלסמה אנושית רגילה, ברגע אתנול נוספה פלזמה lysate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elute דגימות מים נטולי נוקלאז µL 100. פנה מיד עם RNA להתנקות וריכוז.<ol>
<li>דוגמאות עשויים להיות מאוחסנים על קרח רטוב, מכוסה, במשך שעה אחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתרכז RNA בשיטת עמודה מבוסס, elute ב µL 9 RNase ללא מים.<ol>
<li>מיד להמשיך בשלב 5, או לשמור דגימות על קרח רטוב במשך שעה אחת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הפוך את שעתוק RNA ל cDNA
<ol><li>המר מרוכז מדגם ה-RNA במחזור cDNA באמצעות ערכת התגובה שעתוק במהופך זמינים מסחרית, לרבות תחל אקראי (ראה טבלה 1 עבור רכיבים). הערה: גנים ספציפיים תחל אופציונלי, ניתן לעצב עבור המבחן משתנים. תחל מעוצבים בהתבסס על המטרה רצף ה-RNA. השתמש פיוז'ן רצפים משתנה מ- 2.1 צעד.<ol>
<li>כוללים לדוגמה שליטה אין רוורס טרנסקריפטאז ודגימת שליטה אין RNA (ראה טבלה 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד cDNA מתגובה שעתוק במהופך באמצעות עמודה ספין זמינים מסחרית של רכז הדנ א. הערה: שלב זה מאפשר הסרה של אנזימים, תחל deoxynucleotide חינם triphosphates (dNTPs).</li>
	<li>השתמש cDNA מיד ב- PCR תגובות או לאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט.</li>
</ol>6. PCR דיגיטלי
הערה: זו PCR היא ספציפית droplet PCR דיגיטלי (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>
PCR מערבבים אמצעי זהירות.
	<ol>
<li>ללבוש כפפות מעילו ואת nitrile המעבדה חד פעמיות.</li>
		<li>שימוש PCR מערבבים ריאגנטים באזור הכנה ריאגנט ייעודי. לא מסתדר עם cDNA באזור הכנה ריאגנט בלבד.</li>
		<li>מכסים הגששים תוך כדי עבודה כדי להגן עליהם מפני אור. אור מופרז יכול צילום להלבין את הפלורסנט מחובר המכשיר.</li>
		<li>תחבורה תערובות, מכוסה, מוגן מפני אור, לתוך אזור קדם הגברה נפרדת לפני cDNA שיתווספו.</li>
		<li>להוסיף cDNA להיבדק כדי לערבב PCR בשכונה נקי PCR ממוקם באזור קדם הגברה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו PCR mixes נפח התגובה האחרונה של 20 µL על פי בטבלה 2.</li>
	<li>להפיץ PCR mixes + cDNA ללוחות ה-PCR. הערה: שימוש במיתאר צלחת כמו מומלץ לקחת מדריך.</li>
	<li>מכסים את הצלחת באמצעות סילר לאיטום של צלחת נשלף.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחות בקצרה לאסוף דגימות בתחתית הבארות.</li>
	<li>תערובת על צלחת שאכר על קביעת ערך נמוך מ-10 s.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחות בקצרה כדי לאסוף דגימת בתחתית הבאר.</li>
	<li>הסר את לוחית סילר לאיטום. לבצע יצירת droplet עבור ה-PCR-cDNA לערבב עם גם מערכת דור droplet ידנית או אוטומטית.<ol>
<li>לדור droplet ידנית, העברה מיקס PCR µL 20 דוגמת בארות על הדיו הדור ' droplet '. הוסף µL 70 של שמן דור droplet. מכסים עם גומי אטם והעברת מחסנית לגנרטור droplet ידנית ליזום דור droplet. בעקבות יצירת droplet, להעביר טיפות צלחת PCR טריים באמצעות טיפים מומלצים על ידי היצרן. האחות, לחלק את טיפות לאט, מעל 5 עד 6 s כל אחד, בלי לגעת הפתיחה של קצה droplet מחסנית או צלחת.</li>
		<li>לדור droplet אוטומטיות, חותם את הצלחת עם כשסרט האטימה, העברת הגנרטור droplet. להבטיח כל העצות, מחסניות, צלחות במקום לפני תחילת יצירת droplet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעקבות droplet בדור העברה של טיפות על צלחת PCR טריים, חותם עם סילר לאיטום צלחת עם רדיד אלומיניום, לוחות המחזור התרמי תוך שימוש בהגדרות בטבלה3.</li>
	<li>לאחר הצנטרפוגה תרמי בניהול הושלמה, לקרוא את הצלחת שימוש בקורא droplet. ליצור פריסה צלחת עבור תוכנת קורא שמזהה את המיקום של פקדים, דגימות, וכדומה, עומס לתוך תוכנת להתחיל לקרוא.</li>
</ol>7. נתוני ניתוח, סקירה של דור של תוצאות
<ol><li>לנתח את הצלחת לקרוא את התוצאות באמצעות תוכנה זמינים מסחרית.</li>
	<li>נווטו לתפריט Analyze כדי להציג מתווה דו מימדי משרעת (2D).</li>
	<li>להעריך את האיכות הכוללת של הנתונים על-ידי בדיקת הנתונים droplet.<ol>
<li>הערכת הנתונים עבור מספרים הכוללת אירוע מקובל שימוש בתפריט Events. אם ישנם אירועים פחות מ 10,000 לכל היטב, בקפידה להעריך את הנתונים עבור בעיות נוספות.</li>
		<li>בדוק נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית סוטה amplitudes. הבדלים משמעותיים משרעת והבדלים ריכוז בין דגימות שכפל מצביעים על טיפול עניים או ערבוב של דגימות.</li>
		<li>ליצור הערות של droplet אשכולות עם דפוסים ספריי על ציר 45 מעלות, הרומז על מצבה העגום של טיפות באיכות ירודה או דגימות בעייתי.</li>
		<li>בדוק קודם בקרה חיובית, לא רוורס טרנסקריפטאז (לא RT) ונתוני בקרה RNA לא (NRC). בחר כל שליטה דוגמאות ולבחון אשכול איכות על ידי מגרש 2D. על סף תקין, הפרדה ברורה בין אשכולות droplet בלאו הכי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל משתנה assay, להגדיר את הסף מבוסס על שליטה בארות.<ol>
<li>ספי קבע על מגרשים 2D באמצעות הכלי הכוונת כדי להפריד בין האוכלוסייה droplet כפול שלילי מן האוכלוסייה ג'ין שליטה (המסומנת phosphoramidite 5'-hexachloro-fluorescein-CE בדיקה), ציר ה-y, אוכלוסיית הגן variant, אם להציג ( עם תוויות fluorescein amidite או 6-carboxyfluorescein בדיקה), ציר ה-x.</li>
		<li>סכום עותקים מכל קידוח שכפל דגימה בודדת.</li>
		<li>מבטאים את תוצאות הבדיקה כמו מספר העותקים variant זוהה. הערה: כדי לקבוע את ערך הסף אנליטית שהתקשרת דגימה חיובית או שלילית, להפעיל רגיל מדגם תורם בריא קבע (לפחות 10 דוגמאות בודדות) בתהליך גיבוש ולהקים החיתוך מעל כל אות רקע לזיהוי בשביל המוטציה של ריבית. בנוסף, להקים את מספר העותקים ג'ין שליטה נדרש לקרוא תוצאה חיובית או שלילית. ניתוק ג'ין זה שליטה מתפקד בקרת איכות (QC) כדי להעריך את כמות ואיכות כל מדגם ה-RNA שמעובד פנימי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. אימות של תנאי ריאקציה RT-dPCR באמצעות שורות תאים (אופציונלי)
<ol><li>כדי לוודא זיהוי של גרסאות פיוז'ן, השתמש שורות תאים זמינים מסחרית לבטא את פיוז'ן ROS1 או רט mRNA של עניין. פעל כדלקמן:<ol>
<li>Homogenize קפואה תאים בפתרון מבוסס-guanidinium פירוק ישירות ממצב למצב קפואים. מפשיר אפילו קצרה לפני המגון יכול לגרום RNA השפלה ואובדן.</li>
		<li>לבודד RNA תוך שימוש בעמודות ספין סיליקה-הממברנה מיועד RNA.</li>
		<li>למדוד את הריכוז של דגימות RNA באמצעות fluorometer עם ריאגנטים ספציפיים RNA ותקנים.</li>
		<li>לדלל RNA מבודד לתוך רקע של RNA פראי-סוג פלזמה או ממקור מסחרי אחר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע צעדים מן הפוך שעתוק של רנ א cDNA, PCR דיגיטלי, ניתוח נתונים, סקירה, דור של תוצאות המופיעים בפרוטוקול זה כדי לאשר גילוי של הווריאציה הרצויה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA:+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility.">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li><li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy.">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li><li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Molecular+AP+testing+in+sync+with+guidelines.">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li><li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer.">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li><li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer.">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA.">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li><li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer,+Multiclass,+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics.">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+exosome+cargo+from+plasma/bronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer.">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma.">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li><li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage.">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380 (2013).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+ALK-RET,+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer.">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS1+and+ALK+fusions+in+lung+cancer.">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li><li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer:+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion.">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li><li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma:+a+clinicopathological+and+molecular+analysis.">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li><li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li><li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer:+an+integrated+medicine+approach.">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li><li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer.">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+(AZD9291)+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma.">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li><li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial.">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+ctDNA+analysis+depicts+early-stage+lung+cancer+evolution.">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li></ol>

H.M., אל. ג'יי, כ"ע ו G.A.P. עובדים של ולהחזיק מניות ב H.M. Biodesix, inc., אל. ג'יי, G.A.P. הם ממציאים על בקשה לרישום פטנט שהגיש Biodesix, המכסה אבחון מערכת איתור של מחזורי גרסאות גנטיים שאינם קטנים התא סרטן ריאות.

Rearrangements רט ו ROS1 ביחד יוצרים ~ 3% של מוטציות הנהג בתוך האוכלוסייה NSCLC18. למרות שזה נדיר, זיהוי שינויים גנטיים אלה היא חיונית. חולי NSCLC עם שינויים אלה עשויים להפיק תועלת הרפוי יישוב זה במיוחד לעכב את פעילות קינאז aberrant הנובעת onco-חלבון13. כמה טיפולים כאלה כבר המאושרים על ידי ה-FDA לשימוש ב NSCLC חיובית ROS1, בעוד אחרים הוכחו בתמימותה נגד רט ניסויים קליניים19.
טכנולוגיית ה-PCR דיגיטלית מספקת רגישות זה אידיאלי עבור יישומים ביופסיה נוזלי20. יש כבר אימוץ משמעותית של טכנולוגיה זו לשימוש עם מחזורי תא ללא ה-DNA של המדד של מוטציות הגידול בחולים עם NSCLC4,6,21,22,23 . בנוסף cfDNA, פיתחנו פרוטוקול המיועד למדידת חזקים גרסאות פיוז'ן הנפוצות ביותר בחולים עם NSCLC מלהסתובב הגידול RNA (איור 1א')10.
פרוטוקול הוקמה שלנו מאפשר לתחום האנליטי של זיהוי עד 0.2% (איור 2). בעוד RT-dPCR הוא ספציפי ורגיש במיוחד, מבחני מוגבלות הלוח של גרסאות פיוז'ן ידוע כי הם בחרו מרובב לצורך זיהוי ב- PCR וזמינותו. לפיכך, fusions תיכלל מבחני מרובבת יש לבחור בקפידה כדי להבטיח כיסוי הולם בתוך האוכלוסייה של חולים עם NSCLC. עיצבנו בהצלחה מבחני רט ו ROS1 בו זמנית לזהות שמונה תוצאות גרסאות פיוז'ן מן rearrangements של לוקוסים RET או ROS1, לכסות 99% 88% מן האוכלוסייה חיובי רט ו- ROS1, בהתאמה (איור 1בג )17.
המבחן האחרון זרימת העבודה כפי שמתואר במחקר זה כולל בקרת אצווה כדי להבטיח עקביות של תוצאות. פקדים אלה כוללות הן ברמה האנליטית חיוביים, כמו גם שני פקדים שלילי, המבטיחים ביחד אין זיהום או עיכוב PCR המתרחשים בתוך החבילה (איור 3). כדי להבטיח את היציבות של וזמינותו, בוצע מחקר באמצעות הפקדים אצווה במשך 21 יום (איור 3יח, ח). נתונים אלה מדגימים את העקביות של תהליך ה-RNA כפי שנקבעו במסגרת פרוטוקול זה.
שיטות מעבדה של הטיפול RNA הם מרכיבי המפתח של המבטיח תוצאות חזקות ומדויקות. שטח וציוד ייעודי לשימוש עם ה-RNA, ניקוי הציוד לאחר כל שימוש, בעזרת ריאגנטים RNase ללא חומרים מתכלים והחלת של ספריי איון RNase במרחב העבודה של כל לסייע בהפחתת RNases מזהמים. טיפול מצפוני של RNA דגימות על ידי טכנאים, כולל חלוק מעבדה ייעודית, תכופות שינויים הכפפות, עובדים במהירות על התהליך החילוץ RNA, והם לשמור דגימות על קרח בעל חשיבות עליונה לשמירה על שלמות הדגימה. ברגע RNA היה הפוך עיבד כדי cDNA, הדגימה היא בצורה יציבה יותר כי הוא נוטה פחות השפלה. בנוסף לשיטות העבודה התומכים RNA שלמות, רכיבי ה-PCR ודוגמאות צריך להישמר באזורים הפרדה כדי למנוע זיהום שעלול להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות. ריאגנטים PCR מלאי והכנת mixes מאסטר PCR צריך להישמר נפרד מתבניות PCR, זהירות רבה יש לנקוט הפרדת תבנית מוגבר (post-PCR) של כל החומרים מראש מוגבר כולל ריאגנטים, רנ א cDNA דגימות. לבסוף, דור נכונה וטיפול mixes PCR emulsified לפני הגברה היא המרכזית לשמירה על תקינות droplet ותנאים אופטימליים dPCR. אמצעי זהירות כמו אלה הם קריטיים במהלך ביצוע של פרוטוקול זה כדי להשיג תוצאות עקבי ומדויק. כל הנתונים צריך להיבדק על ידי צוות מיומן לפני שחרורו של תוצאות כדי לוודא כי כל המדדים QC מולאו. במקרה של תוצאות שיוצרת (איור 4), האצווה חייב להיות נבדקו על ידי צוות טכני, מנהל המעבדה, עשוי לדרוש עיבוד מחדש.
RT-dPCR תוצאות יכול להיות מיוצר מוקדם ככל 24 שעות קבלת דגימות ו 95% של תוצאות המדגם בתוך המבחן לקבוע בשימוש במחקר זה (n = 984) דווחו לרופא ההזמנה תוך פחות מ- 72 שעות ממועד קבלת (איור 5). הפעם סיבוב מספקת לרופאים עם הרבה צריך מידע מולקולרית במסגרת זמן המאפשר חניכה של הטיפול המתאים. תוצאות אלו זמינים בדרך כלל מוקדם יותר מאלו שהושגו באמצעות ביופסיה רקמות קונבנציונלי. סמנים ביולוגיים נוספים NSCLC, סוגי סרטן אחרים ניתן לפתח באמצעות גישות מבוססות-RNA במחזור בדומה, ירוויחו באותו הזמן-כדי-תוצאות מהירות. לדוגמה, מדידה של תמליל mRNA מתוכנת מוות ליגנד 1 (PD-L1) באמצעות RT-dPCR יכול ליידע רופאים לגבי אפשרויות חיסוני. יש גם עניין הולך וגובר בכלי השירות של ביופסיה נוזלי dPCR בפיקוח על יעילות טיפולית. אינדיקציות קודמות של התחייה של הגידול באמצעות גנומית בדיקות עבור משתנים מסוימים עלולה לאפשר לרופאים להתאים משטרי הטיפול לפני המטופלים מפתחים סימפטומים על ידי תקן של אמצעי טיפול כגון הדמיה24. פרוטוקולים כמו האחד דיווחו במחקר זה הינם אידיאליים עבור ניטור שלהם הלא-invasiveness, רגישות, מהירה, סיבוב סביב הזמן וכתוצאה יחס עלות-תועלת. וזמינותו המתוארים בזאת מספק תוצאות תוך 72 שעות מעת קבלת דגימות, במחירים זיהוי חיובי-false מינימלי, אשר מקלה על החלטות לטיפול מהיר עוקף כמה מגבלות המנוסה המבוסס על רקמות ובדיקות4.
פרוטוקול ונתונים שלנו להפגין מערכת הבדיקה חזקים לזיהוי. גרסאות ה-RNA שפע נמוך, כמו גם את פוטנציאל מבוסס-דם מוטציה הבדיקה הקלינית. עבור אותם חולים אשר אין מנהל התקן שבידיך מוטציה מזוהה על ידי ביופסיה נוזלי יישוב מהיר גישות כמו זה, התוספת של הגנום מקיפה יותר, פרוטאום בדיקות רקמות והן דם עשויים לספק מידע קליני אפילו רחבה יותר כדי לתמוך תכנון טיפול.

עד 25% של סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) חולים אולי לא יש זמינות לבדיקה בעת ביצוע אבחון מספיק רקמות. אפילו במקרים בהם רקמה זמין, זה לא מספיק כמות או איכות לביצוע המומלצים בדיקות מולקולריות1,2. במקרים שבהם יש מספיק רקמה של ביופסיה עבור פרופיל מולקולרית, חולים שיש לחכות מספר שבועות או יותר לקבלת תוצאות, או להתחיל טיפול ללא תוצאות מולקולרית3,4. עם זאת, קריטי כי אבחון מולקולרי אינפורמטיבי יהיו זמינים בהתחשב כניסתו של אפשרויות טיפול ממוקד עבור חולים שאובחנו עם NSCLC. בדיקה של מחזורי ללא תא הדנ א (cfDNA) ביופסיה נוזלי הוא פתרון לאתגרים של רקמה מסורתית בדיקות4,5,6. אפשרויות הבדיקה הנוכחית מוטציות שבידיך NSCLC באמצעות cfDNA ו זרימת עבודה המבוסס על dPCR דומה ' לדור תוצאה מהירה, כוללים את קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) sensitizing מוטציות ΔE746-A750, L858R, EGFR ההתנגדות מוטציה T790M , גרסאות קראס proto-oncogene (קראס), B-Raf proto-oncogene (BRAF) משתנה V600E. אמנם לא כמו בהרחבה אומצו על-ידי השדה במחזור הגידול-derived RNA שליח (mRNA) מבודד ביופסיה נוזלי יכול גם לספק מידע קליני חשוב7,8,9. יש קודם לכן פיתחה ואנו דיווחו על שיטות זיהוי מרובבת קווצי עור Microtubule הקשורים חלבון כמו 4-אנפלסטית לימפומה קולטן טירוזין קינאז (EML4-ALK) פיוז'ן וריאנטים פלזמה דם10. במחקר זה, אנחנו האריכו שיטות אלה לכלול יעדים RNA מרובבת מסדר גבוה עבור ROS1 ורט, המכסה שמונה גרסאות פיוז'ן בתוך כל assay. המטרה הייתה לפתח טכניקה מהירה, רגיש, ספציפית, לשחזור איתור אלה גרסאות פיוז'ן של הפלזמה של חולים שאובחנו בעבר עם NSCLC.
תהליך הבדיקה מאותחלת במשרד של רופא בעזרת RNA ייצוב צינורות איסוף דם11. צינורות אלה מכילים משמרים כמו גם מעכבי RNase תא. הדגימות עדיפות שנשלחה ונישלח מרכזי המכללה של קאפ פתולוגים אמריקאי מוכר/קלינית מעבדה שיפור התיקונים (CLIA)-מעבדה מוסמכת (קליני מעבדתי) לעיבוד על-ידי כוח אדם מוכשר. ברגע שהתקבלו על-ידי מעבדה קלינית, כל שלב של עיבוד מתנהל תחת נהלי שאושרו (SOP). דם מלא הוא centrifuged לשחזר את הפלזמה, אשר משמש לאחר מכן כדי לבודד במחזור ה-RNA זה הוא או חופשי בדם או בתוך לבצע moieties, כגון exosomes וטסיות7,8,9. כדי לבודד RNA של תאים אלה, בחרנו את המערכת להתאוששות RNA המבוסס על השוואות של מספר שיטות החילוץ. הרנ א מבודד הוא מרוכז, הפוכה עיבד כדי cDNA. מספר אנזימים רוורס טרנסקריפטאז, גנים ספציפיים תחל הוערכו בזמן אופטימיזציה של שיטת סינתזה cDNA להגדיל את ROS1 ואת רט היעד התעתיק ההמרה10. . זה קריטי עבור שפע נמוך במחזור תעתיקים, כגון גרסאות פיוז'ן נגזר הגידול. בסופו של דבר, אנחנו אופטימיזציה ריכוזים פריימר ולאחר בדיקה dPCR כדי לאפשר זיהוי מרובבת של גרסאות פיוז'ן רט או ROS1, הגן בקרה, glucuronidase-β (GUSB). אנחנו ואז לשלב את התנאים הטובים ביותר מכל המחקרים אופטימיזציה פרוטוקול נעול הסופי לפני ביצוע האימות אנליטית המחקרים שתוארו בדו ח זה. פרוטוקול זה ותוצאות אלה מספקים את הבסיס עבור זרימת עבודה מהיר ורגיש איתור שגרתית גרסאות פיוז'ן נדיר במחזור.

a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction

פיתחנו שיטות הרומן בידוד ואפיון של נגזר הגידול במחזור חומצה ריבונוקלאית (קרנה) לביופסיה נוזלי מבוסס-דם. זיהוי חזקים קרנה התאוששה דם מייצג פתרון צורך קריטי בתוכנית האבחון הקליני. הבדיקה מתחילה עם האוסף של דם לתוך צינורות איסוף דם המכילים חומרים משמרים זה לייצב את קרנה. ללא תא, exosomal, ו- RNA טסיות-הקשורים מנותקת פלזמה במערכת זו הבדיקה. קרנה היא הפוכה עיבד ל- DNA משלימים (cDNA) מוגבר באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (dPCR). דוגמאות מוערכים הן את סמן יעד, כמו גם גן הבקרה. בדיקת אימות כלל מגבלה של זיהוי, דיוק חוסן מחקרים עם דגימות אנליטית. השיטה פותחה בעקבות מחקרים אלו reproducibly לזהות מספר גרסאות פיוז'ן ROS1 (C-Ros proto-oncogene גרסאות 1; 8), RET (לסידור מחדש במהלך תרביות תאים proto-oncogene; 8 גרסאות). זרימת העבודה לדוגמה עיבוד מוטבה כך ניתן להפיק תוצאות הבדיקה באופן עקבי בתוך 72 שעות מיום קבלת מדגם.

פרוטוקול זה מתאר מערכת הבדיקה שפותחה עבור הגילוי של RNA גרסאות פיוז'ן לשימוש בהמידה של מוטציות הנהג בתוך הפלזמה של חולי NSCLC (איור 1א'). פיוז'ן mRNA היו מוצרים מן הביטוי של rearrangements רט ו- ROS1 הנפוץ ביותר בקרב האוכלוסייה NSCLC מזוהה13,14,15,16,17. מבחני ה-PCR מרובבת תוכננו ואז לזהות על שמונה גרסאות התעתיק הנפוץ ביותר עבור כל מטרה NSCLC בתוך תגובה אחת. Translocations הנפוץ ביותר-מיקומה ROS1 ליצור שיוכי בחלקים 5' של CD74, SDC4, SLC34A2, EZR או TPM3 גנים (איור 1B). Translocations הנפוץ ביותר-מיקומה רט להוביל הסמיכות עם KIF5B, שעבורו assay מכסה שישה צמתים אקסון. שותפים רט נוספים מכוסים כוללים את אלה עם CCDC6 ו- TRIM33 (איור 1C). בסך הכל, מבחני מכסה כ- 88% של ROS1 ו- 99% של RET. שינויים עלולה להתרחש בתוך האוכלוסייה המטופלת NSCLC17.
ייחודה של הרכיבים assay הוערך קודם באמצעות שמונה בודדים במבחנה RNAs מכילים את רצף ה-mRNA לפי התרשימים פיוז'ן מכוסה על ידי ROS1 או רט מרובב מבחני. לכל מין RNA נבחנה נגד כל assay variant בודדים שכוללת את הגירסה מרובבת. היה לא אשיג של מבחני אלה, ובכך הפגנת 100% ירידה לפרטים אנליטית בתוך תוכנן מרובב מבחני (נתונים לא מוצג). כדי לקבוע את הגבול התחתון של זיהוי של פרוטוקול הבדיקה, הכולל RNA נגזר שורות תאים ביטוי variant פיוז'ן הכלולים וזמינותו היו מעורבבות רקע של RNA נורמלי בריכוזים 5%, 1%, 0.2% ו- 0.04%. מרובבת רט ו ROS1 variant PCR מבחני זוהה רק 0.2% פיוז'ן variant (איור 2א-ב). בנוסף, הכנה של 5% הנחה-יעד שורת התאים נגזר RNA (ביטוי של התעתיק פיוז'ן EML4-ALK) לא זוהה עם מרובבת ROS1, RET מבחני, בהמשך מדגימים ירידה לפרטים (איור 2א-ב).
דיוק בדיקה של תהליך RT-dPCR בוצע עבור שני ROS1 ומעובדים מיל' אנליטית בקרת החומר מורכב equimolar במבחנה RNAs היה בריכוזים שלוש (גבוהה, בינונית, נמוכה) דרך שעתוק במהופך, dPCR על שלוש הזדמנויות שונות בתוך באותו היום (אינטרה-יום), על שלושה ימים רצופים (inter-יום), ועם שני אופרטורים (inter-מפעיל). תוצאות בדיקות הדיוק הפגינו זיהוי מדויקת של התעתיק פיוז'ן מעניינים, כמו גם בקרת גנים, GUSB, אשר נכלל בתור מדד QC פנימי (איור 2C-D).
בנוסף בקרה פנימית של GUSB, שכל אצווה של דגימות קליניות הופעלה עם קבוצה של פקדים אצווה. פקד חיובי פותחה מתערובת של אנליטית חוץ גופית ב RNA מיוצגים כל אחד גרסאות פיוז'ן נבדק ב- RT-dPCR, כמו גם אנליטית במבחנה RNA עבור GUSB. RNA הזה נמזג לפלסמה אנושית רגילה lysate במהלך החילוץ-RNA, עובדה לצד הדגימות קליניים לאורך כל הפרוטוקול. הפקד רוורס טרנסקריפטאז (לא RT) לא היה פקד שלילי כדי לאשר את העדר של חומרים מזהמים בתהליך מיצוי העבודה RNA ומדגימים יחודיות של תחל עבור ה-RNA. הפקד RT לא נוצר באמצעות מאותו חומר כמו הפקד חיובית, אך היא אינה כוללת אנזימים בתוך התגובה סינתזה cDNA. אין RNA הפקד (NRC) הוא פקד שלילי כדי לוודא העדר מזהמות תעתיקים ברכיבי התגובה של שעתוק במהופך. פקד זה הוכנס שזרימת העבודה בשלב סינתזת cDNA, מים נוספה בהתגובה במקום תבנית ה-RNA. הפקדים לא RT ו- NRC חייב להיות שלילי בשני ערוצים, אם תוצאות מדויקות כדי להיגאל. טבלה 1 מציגה את רכיבי התגובה שעתוק במהופך עבור כל פקד. דוגמאות של החלקות 2D עבור כל אחד מהפקדים הללו מוצגים עבור ROS1 (איור 3 A-C), מבחני מולטיפלקס RET (איור 3 E-G). גרסאות פיוז'ן אותרו באמצעות בדיקה amidite (FAM) fluorescein, מיוצגים לאורך ציר ה-y, ואילו הגן בקרה, GUSB, זוהתה באמצעות בדיקה 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (הקסדצימאלי) והוא בציר ה-x. פקדים אצווה אלה היו העריכו במשך 21 ימים כדי לקבוע assay חוסן. טיפות חיובי fusion ו GUSB בקרת גנים טיפות נצפו עבור ROS1 ורט ב כל הרצפים 21 להורג במהלך המחקר (איור 3ד', H). כל הפקדים שלילית (לא RT ו- NRC) הניבו תוצאות שליליות על-פני כל 21 הימים (נתונים לא מוצג).
היכולת לפתור בעיות היא מרכיב קריטי בכל פרוטוקול הבדיקה כדי להפעיל את ההגדרה קליני מעבדתי. כאן, אנו מספקים דוגמאות מהעולם האמיתי של תוצאות תת אופטימלית באמצעות פרוטוקול RT-dPCR. הראשון הוא מגרש 2D לדוגמה הממחיש את חשיבות אין רוורס טרנסקריפטאז הפקד (איור 4א). בדוגמה זו, טיפות מוטציה חיובית נכחו למרות שלא היתה ללא המרה cDNA בשל חוסר אנזים. התוצאה הייתה ככל הנראה בגלל תחל dPCR הגברה דנ א גנומי את המטרה. במקרה זה, העיצוב של וזמינותו פורש-אינטרון תמנע הגברה של הדנ א. לחלופין, אנזים DNase נטולת RNase יכול לשמש כדי לחסל את ה-DNA מזהמים, אך זה לא מומלץ לצורך זיהוי של מטרות נדיר, כי קצת השפלה RNA עלולה להתרחש במהלך הדגירה עם האנזים. העלילה 2D הבא דוגמה היה NRC עם טיפות חיובי בשני ערוצים (איור 4B). זה הצביעו על זיהום בשלב מסוים בכיוונון RT-dPCR. במקרה זה, ההמלצה היא למחוק את כל ריאגנטים שעשויות להיות מזוהמים משמש בדיקות, ביסודיות decontaminate כל הציוד של בדיקה חוזרת עם רכיבי התגובה טריים. השלישי דוגמה 2D העלילה שהוצגו כמו תרסיס של טיפות לאורך קו 45° (איור 4C). זו נגרמת לעתים קרובות על ידי הטיית התגבשו של טיפות. זהירות droplet טיפול לפני רכיבה על אופניים תרמי חיוני, כמו טיפות הם נוטים לגרום נזק. אנו ממליצים על השימוש של דור droplet אוטומטית, כאשר היא זמינה. אם העברת ידנית שנוצר על ידי טיפות, להיות בטוח לבחור את הטיפים נשא רחב מומלץ ולהעסיק זהיר בטכניקה pipetting. העברת droplet דורש איטי והשאיפה ומקבלים, בכל מקום לקחת יותר מ 5-6 שניות, וזה חיוני כי הפתח עצה פיפטה לא לגעת הדיו droplet או טוב. כאשר מחלק, שמור על קצה פיפטה ברמת נוזלי, אעלה את זה לאט. כמו טיפות הם ויתרו (תצוגת וידאו להדגמה). הדוגמה מגרש 2D הסופי מדגים חוסר הפרדה בין האוכלוסיות droplet חיוביים ושליליים (איור 4D). זה יכול להיות מספר סיבות. מעכבי PCR חזקה, כגון דטרגנטים בשימוש פירוק מאגרי עודף של הדנ א פגום מאוד, יכול לגרום לאובדן של הפרדה. במקרה זה, שקול להוסיף צעד לנקות בין cDNA סינתזה dPCR (כגון המתוארות בתוך בשלב 5 של פרוטוקול זה). בסופו של דבר, חוסר ההפרדה ניתן גם בשל תנאי הגברה תת אופטימלית, אופטימיזציה של השלב ה-PCR צריך להיות גם נחשב.
נתונים בתוך איור 5 מייצגים 984 בעולם האמיתי החולה לטעום סיבוב פעמים ומדגים את אופי זרימת עבודה זו בדיקה מהירה. תוצאות דווחו על הרופא המטפל מוקדם כמו בתוך 48 שעות (79% מהמקרים) קבלת דגימות ו ב 95% מהמקרים, בתוך 72 שעות. לסיכום, השימוש התייצב במחזור ה-RNA דם אוסף צינורות, RNA ממוטבת מיצוי הליכים מן הדם, ו- RT-dPCR לפעול על-פי פרוטוקול ממוטבת עם המתאים פנימי ופקדי אצווה, יכול לספק מערכת בדיקה מהירה זיהוי מדויק של פיוז'ן RNA משתנים רלוונטיים ב NSCLC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> איור 1 : סקירה של דם דוגמת עיבוד השלבים לגילוי Variant היתוך באמצעות מבחני ספציפיים ביותר ונפוצים RET, גרסאות ROS1 ב NSCLC. (א) בדיקה של דגימות מתחילה כאשר דם משורטט, BCT נשלח בתוך ערכת איסוף הדגימה למעבדה קלינית. במחזור ה-RNA הוא התאושש ממקורות מרובים בתוך פלזמה מועשרת טסיות, הפוכה עיבד עם גנים ספציפיים לקרקע, מטוהרים לשימוש ב- dPCR. דוגמאות מעובדות באמצעות מערכת זמינים מסחרית, אשר מורכב של droplet דור (אמולסיה), הגברה וספירת droplet. ניתוח המידע באמצעות תוכנה זמינים מסחרית. תוצאות הבדיקה ואז מתועדים, דיווח על חזרה לרופא. מבקש בדיקה. התהליך מיועד לפעול בתוך פרק זמן של 72 שעות מעת קבלת דגימות למהדורה תוצאה. שמונה גרסאות עבור ROS1 (B) ו- (ג) RET מכוסים בתוך מבחני מרובבת. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> איור 2 : אימות אנליטית. שורות תאים לבטא (א) SDC4-ROS1 פיוז'ן ופיוז'ן CCDC6 (B)-RET היו מעורבבת עם רקע של RNA פראי-סוג האדם הכולל (WT RNA). עם כל משתנה פיוז'ן, המגבלה של זיהוי הוקמה באמצעות קריטריונים מוגדרים מראש עבור כל assay משתנה תדר משתנה של 0.2%. כל הדגימות מעל הסף הזה הכיל גם עותקים לפחות 21 של בקרת גנים. תקן EML4-ALK (ALK) 5% על רקע של RNA פראי-סוג נבחנה להדגים ירידה לפרטים assay, אשר אושר ע י תוצאה שלילית. סטנדרטים אנליטיים RNA מרובבת נמדדו ב גבוהה, בינונית, ריכוזים נמוכים עבור ROS1 (ג) ו- (ד) מיל' דיוק הוערך מעל שלושה מסלולי באותו יום (אינטרה-יום), פועל שלוש על שלוש יממות (inter-יום), ועם מפעיל עצמאי שני (inter-מפעיל). אמצעי העתקה מספר ואת סטיות תקן מוצגים. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> איור 3 : עיבוד שליטה דוגמאות ונתונים חוסן אצווה. 2D חלקת dPCR assay ROS1 מרובב תוצאות עבור שליטה חיובית (א), (B) אין רוורס טרנסקריפטאז ומערכת בקרת (C) אין שליטה תבנית הרנ א. פקדים (D) היו להפעיל על 21 ימים רצופים (למעט בסופי שבוע ובחגים). התכוונתי עותק מספר + /-סטיות תקן ROS1 חיובי הבקרה היו 439 + /-141. אין רוורס טרנסקריפטאז ופקדים תבנית לא היו גם להפעיל בכל יום, אלה היו כל שלילי (נתונים לא מוצג). 2D חלקת dPCR assay רט מרובב תוצאות עבור שליטה חיובית (E), (F) אין רוורס טרנסקריפטאז בקרה, (G) אין שליטה תבנית הרנ א. פקדים (H) היו להפעיל על 21 ימים רצופים (למעט בסופי שבוע ובחגים). התכוונתי עותקים + /-סטיות תקן רט חיובי הבקרה היו 586 + /-182. לא מוצגות אין רוורס טרנסקריפטאז ופקדים תבנית לא היו גם להפעיל בכל יום, היו שליליות. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> איור 4 : פתרון בעיות RT-dPCR. 2D מתווה וייצוג dPCR תת אופטימלית התוצאות המתקבלות כאשר יש זיהום () בתוך אין transcriptase הפוכה הפקד, זיהום (B) בתוך אין RNA הפקד, (ג) הטיה, התגבשו של טיפות, (D ) לקוי ממוטב PCR תנאים או עיכוב PCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> איור 5 : משך העבודה (TAT). תאת (בשעות) נערך עבור בדיקות מבקש של variant RNA (n = 984). נתונים לא כולל סופי שבוע, חגים וימי דגימות הוחזק > 24 שעות בשל מידע קליני לא שלם על טופסי בקשה בדיקת המעבדה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> טבלה 1: הכנה של שעתוק במהופך ריאגנטים בקרות תהליכים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
			<td>נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x dPCR supermix על הגששים (לא 2'-deoxyuridine 5'-טריפוספט)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x היעד משתנה תחל/רגשים להגדיר (450 nmol/L תחל 250 בדיקה FAM nmol/L)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x ערכת הבקרה היעד תחל/בדיקה (450 nmol/L תחל 250 בדיקה HEX nmol/L)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוקלאז ללא מים</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: הכנה של המיקס מאסטר dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רכיבה על אופניים שלב</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
			<td># מחזורים</td>
			<td>כבש שער</td>
		</tr>
<tr>
<td>הפעלת אנזים</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>חישול/הרחבה</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>ביטול הפעלה של האנזים</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>החזק (אופציונלי)</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>אינסוף</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s...</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: תנאי הרכיבה תרמי.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

זיהוי של מחזורי חומצה ריבונוקלאית (קרנה) מהדם נמצא צורך בתוכנית האבחון הקליני. כאן נתאר שיטות המאפיינות את קרנה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי רגיש וספציפי. הבדיקות בדרישות עיצוב לאתר גרסאות פיוז'ן בתוך 72 שעות.

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

a-blood-based-test-for-detection-ros1-ret-fusion-transcripts-from

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K Views.  Biodesix. זיהוי של מחזורי חומצה ריבונוקלאית (קרנה) מהדם נמצא צורך בתוכנית האבחון הקליני. כאן נתאר שיטות המאפיינות את קרנה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי רגיש וספציפי. הבדיקות בדרישות עיצוב לאתר גרסאות פיוז'ן בתוך 72 שעות.

Video: A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

מבחן הלחץ החברתי טרייר פרוטוקול גרימת לחץ פסיכולוגי

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

Endometriosis is a common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this study was to demonstrate the use of a blue dye (methylene blue) to stain peritoneal surfaces during laparoscopy (L/S) to detect the loss of peritoneal integrity in patients with pelvic pain and suspected endometriosis. Forty women with CPP and 5 women without pain were evaluated in this pilot study. During L/S, concentrated dye was sprayed onto peritoneal surfaces, then aspirated and rinsed with Lactated Ringers solution. Areas of localized dye uptake were evaluated for the presence of visible endometriotic lesions. Areas of intense peritoneal staining were resected and some fixed in 2.5% buffered gluteraldehyde and examined by scanning (SEM) electron microscopy. Blue dye uptake was more common in women with endometriosis and chronic pelvic pain than controls (85% vs. 40%). Resection of the blue stained areas revealed endometriosis by SEM and loss of peritoneal cell-cell contact compared to normal, non-staining peritoneum. Affected peritoneum was associated with visible endometriotic implants in most but not all patients. Subjective pain relief was reported in 80% of subjects. Based on scanning electron microscopy, we conclude that endometrial cells extend well beyond visible implants of endometriosis and appear to disrupt the underlying mesothelium. Subtle lesions of endometriosis could therefore cause pelvic pain by disruption of peritoneal integrity, allowing menstrual or ovulatory blood and associated pain factors access to underlying sensory nerves. Complete resection of affected peritoneum may provide a better long-term treatment for endometriosis and CPP. This simple technique appears to improve detection of subtle or near invisible endometriosis in women with CPP and minimal visual findings at L/S and may serve to elevate diagnostic accuracy for endometriosis at laparoscopy.

Loss of peritoneal integrity provides a new paradigm to understand and treat chronic pelvic pain in women with mild forms of endometriosis and can be easily detected using intraoperative instillation of dye at the time of laparoscopy.

איתור intraoperative של אנדומטריוזיס העדין: פרדיגמה חדשה לאיתור וטיפול בכאב באגן הקשורים לפגיעה בשלמות פריטונאלית

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

In molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI) are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. PET is characterized by its excellent sensitivity and quantification ability while OI is notable for non-radiation, relative low cost, short scanning time, high throughput, and wide availability to basic researchers. However, both modalities have their shortcomings as well. PET suffers from poor spatial resolution and high cost, while OI is mostly limited to preclinical applications because of its limited tissue penetration along with prominent scattering optical signals through the thickness of living tissues.
 Recently a bridge between PET and OI has emerged with the discovery of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI)4-6. CLI is a new imaging modality that harnesses Cerenkov Radiation (CR) to image radionuclides with OI instruments. Russian Nobel laureate Alekseyevich Cerenkov and his colleagues originally discovered CR in 1934. It is a form of electromagnetic radiation emitted when a charged particle travels at a superluminal speed in a dielectric medium7,8. The charged particle, whether positron or electron, perturbs the electromagnetic field of the medium by displacing the electrons in its atoms. After passing of the disruption photons are emitted as the displaced electrons return to the ground state. For instance, one 18F decay was estimated to produce an average of 3 photons in water5. 
 Since its emergence, CLI has been investigated for its use in a variety of preclinical applications including in vivo tumor imaging, reporter gene imaging, radiotracer development, multimodality imaging, among others4,5,9,10,11. The most important reason why CLI has enjoyed much success so far is that this new technology takes advantage of the low cost and wide availability of OI to image radionuclides, which used to be imaged only by more expensive and less available nuclear imaging modalities such as PET.
 Here, we present the method of using CLI to monitor cancer drug therapy. Our group has recently investigated this new application and validated its feasibility by a proof-of-concept study12. We demonstrated that CLI and PET exhibited excellent correlations across different tumor xenografts and imaging probes. This is consistent with the overarching principle of CR that CLI essentially visualizes the same radionuclides as PET. We selected Bevacizumab (Avastin; Genentech/Roche) as our therapeutic agent because it is a well-known angiogenesis inhibitor13,14. Maturation of this technology in the near future can be envisioned to have a significant impact on preclinical drug development, screening, as well as therapy monitoring of patients receiving treatments.

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Use of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for monitoring preclinical cancer treatment is described here. This method takes advantage of Cerenkov Radiation (CR) and optical imaging (OI) to visualize radiolabeled probes and thus provides an alternative to PET in preclinical therapeutic monitoring and drug screening.

Cerenkov הארת ההדמיה (CLI) לניטור ריפוי הסרטן

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used techniques require killing of the animals and postmortem recovery of the meal1,2. This approach prevents longitudinal studies to determine changes in gastric emptying with age and progression of disease. The commonly used [13C]-octanoic acid breath test for humans3 has been modified for use in mice4-6 and rats7 and we previously showed that this test is reliable and responsive to changes in gastric emptying in response to drugs and during diabetic disease progression8. In this video presentation the principle and practical implementation of this modified test is explained. As in the previous study, NOD LtJ mice are used, a model of type 1 diabetes9. A proportion of these mice develop the symptoms of gastroparesis, a complication of diabetes characterized by delayed gastric emptying without mechanical obstruction of the stomach10.
This paper demonstrates how to train the mice for testing, how to prepare the test meal and obtain 4 hr gastric emptying data and how to analyze the obtained data. The carbon isotope analyzer used in the present study is suitable for the automatic sampling of the air samples from up to 12 mice at the same time. This technique allows the longitudinal follow-up of gastric emptying from larger groups of mice with diabetes or other long-standing diseases.

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Determination of gastric emptying with a non-invasive [13C]-octanoic acid breath test for tracking gastroparesis in female NOD LtJ mice.

הערכה של ריקון קיבה בעכברים סוכרתיים ללא שימוש בשמנים [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoic בדיקת נשימת חומצה

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of arthroplasty. Infection requires complex treatment, may result in long hospitalization and causes considerable costs. Multiple surgical revisions can be necessary in these patients, with a loss in function as well as in quality of life.
The routine preoperative diagnostics include blood examination for C-reactive protein (CRP) and other biomarkers, as well as joint aspirate analysis for cell count, differentiation, and culture. Intraoperative specimens for histology and microbiology are also standard procedure. The microbiological examination of removed implants with sonication, in combination with the implementation of molecular biology techniques in microbiology, represent two novel techniques currently employed to enhance the differential diagnostics of PJI.
We present here the step-wise procedure of analyzing joint aspirate and sonication fluid, using a cartridge-based multiplex polymerase chain reaction (PCR) system. Results were matched against conventional cultures and consensus criteria for PJI. Conventional microbiological cultures from tissue biopsies, joint aspirate and sonication fluid showed a sensitivity of 66.7%, 66.7%, and 88.9%, respectively, and a specificity of 82.3%, 54.6%, and 61.5%, respectively. The PCR diagnostic of the sonication fluid and the joint fluid showed a sensitivity of 50.0% and 55.6%, respectively, and both a specificity of 100.0%. Both PCR diagnostics combined had a sensitivity of 66.7% and a specificity of 100.0%. The multiplex PCR therefore presents a rapid diagnostic tool with moderate sensitivity but high specificity in diagnosing PJI.

Differential diagnostics in painful arthroplasty is crucial for treatment success. Joint aspiration is routinely performed preoperatively. Multiplex polymerase chain reaction of the joint aspirate and the sonication fluid, a feasible tool for quick pathogen detection from these samples is described.

אבחון הרומן ב מהדורה שכיחיםהחלפת: שתל Sonication ואת תגובת שרשרת פולימראזית מולטיפלקס

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

מבחן טעימה: קצר, המאומת בדיקה

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Traditional Trail Making Test Modified into Brand-new Assessment Tools: Digital and Walking Trail Making Test

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been modified into many versions. With the development of digital technologies, TMT is now modified to a digitized version. The present study demonstrated digital TMT (dTMT) performed on a computer, and Walking TMT (WTMT) on the floor. Both revealed more information compared with the traditional version of TMT.

Here, we present a protocol to show how to perform two types of cognitive assessment tools derived from the paper-pencil version of the Trail Making Test.

מסורתי שביל עושה מבחן שונה למותג-חדש כלי הערכה: שובל דיגיטלי הליכה בדיקה

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been ...