עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la המשוכלל והנדיר Médicale, המרכז הלאומי דה לה המשוכלל והנדיר Scientifique, האוניברסיטה לדה שטרסבורג, Hôpital דה שטרסבורג, האגודה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le הסרטן, המכון הלאומי du הסרטן, סוכנות הידיעות Nationale de la המשוכלל והנדיר ואלזס האזור. פייטרו Laneve כבר נתמך על ידי Fondation לשפוך la המשוכלל והנדיר Médicale. נכון לעכשיו, הוא מקבל מלגת Istituto Italiano Tecnologia (IIT). עלויות פרסום נתמכות על ידי רשת Neurex (TriNeuron - תכנית Interreg IV העליון הריין)

אוסף 1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק 2 התאים של שניידר למחצה חסיד, (1-5 x 10 6 תאים בממוצע), על ידי pipetting ולמסוק אותם על ידי צנטריפוגה (1 דקות 100 XG). במקרה של במבחנה תאים חסיד תרבותיים, trypsinize אותם בתנאים סטנדרטיים או ישירות לאסוף אותם מצלחות לסכום נוח של מגיב מיצוי RNA, על ידי עזרה של מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאוסף עובר, לגדול זני דרוזופילה בכלובי זבוב ועוברים לתת להצטבר על צלחות הטלת ביצים. נגבו את העוברים על ידי מכחול במים מזוקקים (DH 2 O), להשליך פסולת על ידי סינון מסננת, לשטוף ולשחזר עוברים ב48 בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כטכניקה חלופית, לנתח באופן ידני רקמות / איברים. לבודד אשכים (מערכת מועדפת לניתוח Pirna) מבטן דרוזופילה בופר פוספט (PBS) תחת סטראו (הגדלה 20X), על ידי שימוש במחטים לנתיחה או מלקחיים כמו מולualized בסאליבן et al 49. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלי homogenize דגימות על התמכרות של 0.5 כרכים של מגיב מיצוי RNA. </li></ol> 2 הפקת RNA / ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההוראות של היצרנים הבאים לבצע בידוד RNA באמצעות חומרים כימיים מסחריים. זהירות! סוכני מיצוי RNA הם בדרך כלל רעילים ומאכל. לחלופין, להחיל פרוטוקול מבוסס K proteinase לבידוד RNA 50, כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות לתוך 400 μl של Stop מיקס ולדגור על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר רכיבי hydrosoluble ידי פנול הסטנדרטי: כלורופורם: אלכוהול isoamyl ועקירות כלורופורם ועל ידי אתנול (EtOH) ממטרים / כביסה. אוויר יבש הדגימות וresuspend לdiethylpyrocarbonate (DEPC) -treated מזוקק פעמיים (dd) H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך ריכוז RNA על ידי מדידת spectrophotometric UV. כמו כן להבטיח את טוהר RNA הוא גבוה, קרוב ל2.0, basעורך על 260 / קריאה 280. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הכנת RNA על denaturing agarose ג&#39;ל כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכוס נקייה, לפזר 1.2 גרם Agarose ב82 מ&quot;ל של DEPC-DDH 2 O, תחת בחישה מתמדת. מרתיחים עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון ג&#39;ל להתקרר; כאשר הטמפרטורה מגיעה 60 ° C להוסיף 10 מ&quot;ל של 10X חומצה 4-morpholinepropanesulfonic (מגבים) חיץ לריכוז סופי 1X (FC), ו -8 מ&quot;ל של 37% פורמלדהיד עד 3% FC. זהירות! פורמלדהיד הוא חומר מסרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל לתוך תא אלקטרופורזה אופקי. לאפשר את הג&#39;ל לביסוס מתחת למכסת מנוע לשעה לפחות 1. בעקבות מיצוק, להטביע את הג&#39;ל לתוך מגבים 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 2 מיקרוגרם של מדגם RNA ו1 מיקרוגרם של סולם (השתמש סמן RNA כאשר הערכה מדויקת היא רצויה). הוסף 3 כרכים של צבע agarose טעינה (ALD) לרנ&quot;א ולסולם. מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וקרירות באופן מיידי על קרח. CAUTION! תוכן של ALD (רומיד ethidium ופוראמיד, ראה חומרים) הוא mutagen ומאכל, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות ולהפעיל את הג&#39;ל על 50 V כ 1 שעות עם מחזור חיץ מדי פעם. בדוק את דפוס חלוקה RNA על ידי ההדמיה UV או הדמיה ג&#39;ל. להכיר להקות דיסקרטיות המתאימות ל28S ו18S rRNAs ולtRNAs (ראה איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך צפון Assay או RNA חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> .3 Denaturing Acrylamide ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במנגנון קטן אנכי electrophoretic לצעד חלוקה זו (גודל צלחת על 8 סנטימטר x 9 סנטימטר, מ&quot;מ 0.75 עובי מסרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב משקפיים נקיים יחד במסגרת ליהוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 10 acrylamide% / bis-acrylamide (19: 1) פתרון במגבי 1X, 7 מ אוריאה. מייד לפני המזיגה, להוסיף 10% persulfate אמוניום 100 μl ו10 μl של TEMED ומהירות לערבב הפתרון. זהירות! Acrylamide הוא רעיל למערכת עצבים וקרצינוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל בין לוחות זכוכית והכנס את המסרק היטב בזהירות כדי למנוע בועות. בואו ג&#39;ל לפלמר ב RT לפחות 45 דקות לפני השימוש. לחלופין, לאחסן O ג&#39;ל / N, עטוף בניירות מסנן ספוג מים ואטומים בניילון נצמד. </li></ol> הכנת .4 דוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot .5-20 מיקרוגרם של RNA הכולל לכל דגימה. אם הנפח עולה על 3-4 μl, ואקום לייבש את המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקביעת גודל, לרוץ aliquot (20-30 CPS) של סולם נמוך לטווח radiolabeled במקביל לדגימות, כסמן (ראה סעיף 4.3 ו4.4 להכנה). פנקו אותו במקביל לדגימות, כפי שמתואר בשלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סולם: להגדיר תגובה קדימה פוספט באמצעות 0.1 מיקרוגרם של סולם 10 נ&quot;ב צעד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולעצור את התגובה על ידי הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל20 מ&quot;מ FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר על ידי משקעים EtOH / כביסה, ייבוש באוויר וresuspend DDH 2 O (כ -100 μl). זהירות! 32 P הוא מקור רדיואקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל דגימה להוסיף נפח שווה של צבע acrylamide הכחול (ABD). לפגל על ידי חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומגניבות על קרח עד טעינה. זהירות! פוראמיד (תוכן בABD) הוא מאכל. </li></ol> .5 Electrophoretic פלזמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את לוחות זכוכית מתמיכת הליהוק וכראוי להרכיב אותם בתא אלקטרופורזה. מלא את שני החדר הפנימי וחיצוני עם מספיק מאגר פועל (RB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את המסרק ומראש להפעיל את הג&#39;ל על 200 V עבור 10 דקות. לפני דגימות טעינה, לשטוף את פיקדונות אוריאה מהבארות על ידי התזה כמה RB באמצעות מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות שטוחות לזהירות דגימות רבד מצעד 4.5 בחלק התחתון של כל טוב. בדקו את חיבורי האנודה וקתודה, כדי למנוע ריצה הפוכה. לאחר הדגימות להיכנס לג&#39;ל ב100 V למשך 5 דקות, אניncrease המתח 200 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך חלוקה של כ 7 סנטימטר, 45 דקות-טווח ארוך מספיק. הימנע bromophenol כחול (פיגמנט מעקב בABD) לעלות על גדותיו את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו בג&#39;ל RNAs הארוך המופרד על ידי רומיד ethidium מכתים (EtBr), כצעד אופציונאלי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 2 סנטימטר מהחלק העליון של ג&#39;ל ובקצרה לשטוף את הפרוסה בDDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה ג&#39;ל ב RT ל15 דקות עם רועד עדין בRB, EtBr 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain ג&#39;ל ל15 דקות בRB, לדמיין rRNAs ארוך על ידי קרינת UV או הדמיה ג&#39;ל. הגעה לטעינת RNA ואיכות (ראה תרשים 1, לוח 7). זהירות! Ethidium ברומיד הוא mutagen. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להמשיך סופג את החלק התחתון של ג&#39;ל המכיל מיני RNA קטנים. </li></ol> .6 ג&#39;ל סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 6 חתיכות של נייר סופג כדי שיתאים לשטח הסופג וחתיכת uncharge שווה ערךקרום ניילון ד. לחלח גיליונות נייר, קרום ו2 רפידות סופגות בRB. הקפד לספוג לחלוטין את הרפידות על ידי סחיטתם שוב ושוב בRB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הג&#39;ל מהמכשירים ולפתוח את המשקפיים על ידי ממוצע של מרית. השתמש בחותך נקי כדי להסיר את הבארות. הנח גיליון נייר Whatman הרטוב על הג&#39;ל בעדינות להרים את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום הניילון על פניו חופשיות של ג&#39;ל. סמן פינה כדי לכוון את המסנן בהתאם לטעינת מדגם. השלם את &quot;הכריך&quot; (חתיכות 3 נייר בכל צד). מרדדים מוט פלסטיק על פני השטח הכתם, כדי להסיר כל בועות אוויר אפשריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכתם בין שתי רפידות סופגות ולאחר מכן בקלטת הסופג. להרכיב את הקלטת במודול הסופג, למלא את התא עם RB ולבדוק את הכיוון הנכון (קרום הניילון חייב להישאר בין ג&#39;ל והתחנה הסופי החיובית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ב20 V עבור 20 דקות. הערה: על מנת להבטיח תנאים הומוגנית, לאחר 10 דקות לפתוח את המודול וr הסופגסוב הכריך ידי 180 ° לפני השלמת ההעברה. </li></ol> .7 ממברנה Crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 6 מ&quot;ל של תמיסה הטרי Crosslinking (XLS). להרוות 10 סנטימטר x 10 סנטימטר (גדול מקרום ניילון) פיסת נייר סופג עם XLS. זהירות! HCl (מרכיב של XLS) הוא מאכל מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את הכתם ולמקם את הקרום על נייר סינון 3MM הרטוב. הערה: RNA לא חייב להיות במגע ישיר עם הנייר הרווי. הנח את המסנן ונייר בין שני לוחות זכוכית ולעטוף בניילון נצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הקרום ב60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ואחריו DDH 2 O כביסה. אחסן ב-20 ° C או להמשיך לכלאה. </li></ol> .8 ממברנה Prehybridization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם טעינת RNA נבדקה (צעד אופציונאלי 5.5), ישירות להמשיך לכלאה. או אחר, לחתוך 1 סנטימטר לחלק העליון של מסנן הניילון, כדי למנוע hybridizatio צולב בדיקהns לRNAs הארוך המופרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 10 מ&quot;ל של הכלאה פתרון (HS) על 37 מעלות צלזיוס. לפגל 1 מ&quot;ג של זרע סלמון על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המסנן בHS ב37 ˚ C במשך שעה לפחות 1, תחת סיבוב בתנור הכלאה. בדוק שRNA-הצד של המסנן עומד בפני HS. </li></ol> .9 Probe סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובה קדימה פוספט ב10 pmol של מולקולת אנטיסנס קצרה ספציפית, כפי שמתואר ב4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 כרכים של טריס-EDTA-NaCl (TEN) חיץ לתגובה ולטהר פריימר שכותרתו מנוקלאוטידים מאוגדים על ידי כרומטוגרפיה הדרת ג&#39;ל על עמודי G-25 Sephadex (או גם על ידי המשקעים EtOH). פעילות בדיקה ניתן להעריך על ידי נוזל נצנץ מתפרצות. </li></ol> 10. ממברנה הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את HS מותש עם טרי 10 מ&quot;ל aliquot (שהוכן והושלם כפי שתואר לעיל). מחממים את הבדיקה בC 95 מעלות עבור 10 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS רומן. דגירה המסנן על 37 מעלות צלזיוס ON. </li></ol> כביסה 11. ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את פתרון ההכלאה ולאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס בתיבת מיגון רדיואקטיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המסנן בכביסה חוצץ (WB) ולשטוף אותו ביסודיות ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גייגר מילר גלאי לבדיקת רדיואקטיביות שיורית בפינות המסנן. כאשר פליטת רקע היא סביב 5 CPS, להמשיך קרום אקספוזיציה. </li></ol> 12. גילוי אותות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את המסנן על סרטי autoradiography או על גבי מסך תרמי מולקולרי. לחשוף אותות על ידי עיבוד צילום או המרה דיגיטלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנה ייעודית כימות (ImageJ או Optiquant). </li></ol> 13. ממברנה חישוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אותות עיקריים, להטביע את הקרום ב500 מ&quot;ל רותח פתרון חישוף, אז לדגור על RT דקות 1. המשך לרומן הכלאה (מראש) או לאחסן את המסנן ב-20 מעלות צלזיוס. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

למרות ההערכה של המתוחכם משתרג דרכו RNA מסדיר נוירוגנזה שלנו עולה בהתמדה, ההשלכות מכניסטית של circuitries מבוסס RNA המשפיע על ביולוגיה של תאי גזע עצבי, הבחנה עצבית / אינטגרציה פונקציונלית, פיתוח של פתולוגיות וסוגי הסרטן עצביים להישאר שלא נחקרו. התחזוקה של רשתות כגון דרך הממלכות עושה את הפוטנציאל של מערכות גנטיות כתסיסנית סייעה לפענח מסלולים סלולריים שלא נחקרו, שבו RNAs noncoding הקצר וגורמי שעתוק נחשבים שחקנים מולקולריים גדולים. בתצוגה זו, הפרופיל של רמות ביטוי RNA הקטנות מועמד הוא propaedeutic לניתוחים תפקודיים מדויקים: דוגמא מגיעה מההפגנה האחרונה שלנו שDmel-miR279 מודולציה הקובע גורל GCM / דאיית in vivo, נעשתה באמצעות גרסה משופרת של assay הצפון סופג כ כלי לניתוח ביטוי. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; מאז הפיתוח הראשוני שלה בשינה 1977 51, NB כבר נחשב שיטת התייחסות לניתוח RNA. למרות כמה מגבלות פנימיות של assay זה, כמרה קשה זמנית שגיאות פורמט או אפשרי עם כימות אות, פריצות הדרך האחרונות בתחום הביולוגיה מולקולרית RNA גילו מחדש טכניקה קונבנציונלית זו כמערכת &quot;מהירה ונקיה&quot; למנסה לאמוד ביטוי אנדוגני של ריבונוקלאית קטנים חומצות או לאימות האפקטיביות של gain- או גישות אובדן של הפונקציה. כדוגמה פרדיגמטי, ניתוח צפון מניח בבסיס התגלית המקורית של מייקרו RNA, ואילו הגישה נשארה בחוד החנית להרלוונטיות שלה באפיון של נכסים הולכים וחדשים של RNAs הרגולציה 52. הגרסה המתוארת כאן מבוססת על רגישות מוגברת בשל crosslinking כימי של RNA. אנו believethe שיטה עדיין מועסקים בצורה גרועה בדרוזופילה, ב<html> ut כאשר ניצלו הוביל לתגליות משמעותיות 52, שכן הוא הופך את ביטוי RNA פרופיל אפשרי מדגימות קטנות (מיקרוגרם פחות מ 1), עם שיפור של פי 10-30 ממוצע של גילוי מטרת RNA 41,43, כפי שהשגנו בתנאים שלנו (דמויות 2 ו -3). שלמות RNA מהווה נושא קריטי על מנת להשיג תוצאות עקביות ולשעתק. מניפולציות RNA דורשות דיוק ומהירות להגביל השפלה מדגם אפשרית המתרחשת בין החילוץ וטעינה. במטרה זו, כל הפתרונות צריכים להיות diethylpyrocarbonate- (DEPC) שטופל לפני השימוש (הדגירה שעה 2 בנוכחות DEPC 0.1% על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן autoclaved) לעקוף פעילות RNase. טיפול פתרון מבטיח כבוד תוצאות טוב יותר לשימוש במי DEPC כממס. כל הציוד יהיה שטוף באותה מידה בDEPC ddH20, לאחר הניקוי על ידי decontaminant משטח RNase הספציפי. &gt; בידוד RNA: פרוטוקולים שונים ניתן להשתמש כדי לבודד RNA ללא פגע. כל מגיב thiocyanate-פנול, כלורופורם המסחרי guanidinium יכול להיות מועסק בהצלחה: הם מומלצים ביותר, כאשר הביטוי קטן RNA הוא נמוך במיוחד (למשל, rasi4, Figure2) או כאשר טיהור RNA לא מבוצעת על דגימות טריות (למשל, השתמר לאחסון רקמות ריאגנטים). מניסיון, בידוד RNA מן הדגימות התייצבו הביא חמור יותר באופן משמעותי ונדרש תנאי חילוץ דרסטיים יותר. בתנאים סטנדרטיים, שיטה המבוססת על K proteinase תיארה מבטיחה הכנות באיכות טובה, כמו גם, (דוגמא משמעותית מיוצגת בFigure1) אבל זה לא הבחירה האופטימלית עבור דגימות נשמרו בריאגנטים אחסון. לבסוף, מאז הליך זה נועד לגילוי ספציפי RNA קטן, יכולות להיות מועסקות ערכות המבוססת על טיהור טור מוקדש לבידוד RNA קטן ישיר, למרות הכלומר הופך קשה יותר כדי לאמת את שלמות RNA. בחלופה להליך המבוסס על ג&#39;ל הקלאסי לבקרת שלמות RNA שתוארה לעיל, ניתן להעריך איכות RNA על ידי מכשירים לניתוח זעיר על השבב של דפוסי חומצות גרעין. מאגר בחירה: מגבים-NaOH חיץ (pH 7) הוצעה כחיץ מועדף עבור שתי אלקטרופורזה משופרת צפון ג&#39;ל וסופג. אנחנו גם באופן משביע רצון בשימוש טריס- borate EDTA-חיץ (TBE) בניסויים שלנו. במקרה זה, שכן הנוכחות של קבוצות האמינים nucleophile של טריס aminomethane (hydroxymethyl) הייתה hydrolyze ולהשבית DEPC במהלך הטיפול עצמו, מומלץ המסת טריס למים DEPC שטופל במקום חיץ TBE טיפול כבר מוכן. Electrophoretic הפעלה וסופג: טרום ריצת ג&#39;ל היא חיונית להסרת persulfate העודף וביטול מיקוד יתר. פרמטרים טרום ריצה יש לשמור גם במהלך חלוקה, הימנעות electropho מהר מדיretic ריצה. לפני הטעינה, הקפד להסיר משקעי אוריאה אפשריים מבארות, על ידי התזת חיץ בתוך. זה יגביל את המדגם לשפוך מעל וערבויות ריבוד RNA מדויק, הפקת להקות autoradiographic נפתרו במהלך איתור אותות. כל קרום ניילון ניטראלי יכול לשמש כתמיכה להעברת חומצות גרעין. אל תמחה RNA ליותר מ 20-30 דקות בתנאים שצוינו. Crosslinking: crosslinking כימי מבוסס EDC מייצג מראש מתודולוגית הביקורתיים של גרסת כתם זה משופר צפון. האפשרות לcrosslink מיני RNA הקצר למשטחים ניטרליים על ידי גבולות קוולנטיים בין קבוצת RNA 5&#39;mono פוספט ואמינים ראשוניים ניילון משאיר את רוב הבסיסים זמינים להכלאה. זה משפר את הרגישות על ידי 10-20xrespect לcrosslinking מסורתי. זה חיוני כדי להכין כמות טריות של פתרון crosslinking לכל סופג, בכמות מספקת לרווית קרום נכונה. <html> הכלאה וכביסה: בדיקות רצוי להיות מתויגות טרי. לחקור פעילות ספציפית (תלוי בפעילות הספציפית וסכום של נוקלאוטיד radiolabeled התאגד וגם על הסכום של בדיקה זמינה להכלאה) קובע את הרגישות של זיהוי היעד. כאשר [γ- 32 P] ATP עם פעילות ספציפית של 3,000 Ci / mmol משמש, 10 6 עותקים לדקה / pmol לתיוג 100% מ5 &#39;מסתיים צפוי. פתרון ההכלאה ניתן לשחזר ומנוצל מחדש, בהתחשב בכך ש, בשל 32 ריקבון P, חצאים פעילות בדיקה בכ 14 ימים. בשל ניטרליות קרום, רעש רקע נמוך צפוי על הכלאה. אם תנאי כביסה מחמירים יותר נדרשים, בהדרגה להפחית את הכוח יוני חיץ הכביסה (עד 0.2X SSPE) או להוסיף כמויות גדלות והולכות של חומרי ניקוי יוניים (עד 0.5% SDS) או להעלות את טמפרטורת כביסה ל37 C °. = &quot;Jove_content&quot;&gt; כדי להימנע מחפיפת אותות עם הכלאה הבאה, מומלץ לוודא מחדש על ידי חשיפה שהבדיקה הראשונית הוסרה לחלוטין מהמסנן על הפשטה. עם זאת, בשל אובדן הדרגתי של RNA מהמסנן יש להימנע יותר מ 3-4 מחזורים של הפשטה ומחדש חיטוט. ניתוח כתם צפון הוא חיוני כאשר נדרש מדידת גודל RNA. למרות assay זה ייתכן חוסר הדיוק של qPCR הקרינה מבוססת גישות להערכת RNAs הזעיר, יתרון נובע משימוש בחלוקת denaturing / סופג והכלאת בדיקה תלויה כצעדים ייחודיים לפני הגילוי של RNAs היעד. כתוצאה מכך, ההתגלות של אותות ספציפיים מהמדגם היא ישירה ואינה דורשת כל צעד נוסף של טיפול / המרה / הגברה אנזימטית, שפירושה השימוש בערכות מסחריות ייעודיות. ניתן לכמת רמות RNA והשוואה בין דגימות מרובות על קרומים יחידים. כך Northeכתם rn מועסק בכינויו אימות מחמירה לנתונים qPCR. דרבן על ידי דרישות ניסוי ספציפיות, השיטה שופרה גם בשנים האחרונות, הן ברמת הרגישות ורזולוציה כך שכמות מוגבלת של RNAs (ראה איורים 2 ו -3) נדרשות לניתוח מוצלח. הפרוטוקול שהצגנו יכול להיות מותאם למגוון רחב של יישומים במיוחד שבו חומר זמין בכמויות מוגבלות. המקור הביולוגי של דגימות RNA יכול להיות הטרוגנית: ככל דרוזופילה היא מודאגת, עוברים או שלבי התפתחות אחרים הם מתאימים, אלא גם ניתחו באופן ידני רקמות או איברים, cytotypes מבודד מיון תאים בודדים או בתרביות תאים. יתר על כן, למרות שמייקרו RNA הוא בכיתה הנפוצה ביותר של RNAs רגולציה הקצר בתא והנושא העיקרי של חקירה בתחום בקרת ביטוי גנים בתיווך RNA, הם לא חסרונותtitute המשפחה היחידה של RNAs noncoding הסלולרי. אשכולות של RNAs הזעיר רבים לתפקד על פני ממלכות (למשל, siRNAs אנדוגני, piRNAs, snoRNAs, צמח tasiRNAs) ורובם מתאפיינים מתחנה סופית חופשית 5 &#39;(ללא שינוי), בדרך כלל נובעים מעיבוד אנדו-ribonucleolytic של מולקולות מבשרים. תכונה זו מהווה התנאי מוקדם מבני הייחודי הנדרש אך ורק ליישום מתודולוגיה המשופרת הספציפית המבוססת על crosslinking כימי, למרות שגודל RNA יש לקחת בחשבון, כמו גם, כאשר RNAs יותר מנותחים. באיור 2 אנו מדווחים ניתוח צפון כתם יחסית איתור הרמות של rasi4 54 חבר כיתה של RNA הקטן נבט אונליין ספציפי (Piwi אינטראקצית RNA או piRNAs.) בתנאים של רמות ביטוי עניות וספציפיות, הרגישות המשופרת בשיטה זו יכולה להכשיר תוצאות מוצלחות, במיוחד בהתחשב בכך שהפרוטוקול שדווח ניתן לשפר עוד יותר על ידי מסרקining אותו עם יישומים מעשיים אחרים שכבר תוארו בספרות 55,56.

ביוכימיה RNA חוותה התקדמות מרהיבה בשנים האחרונות 1. ההבנה שלנו של פוטנציאל RNA בבקרת ביטוי גנים כבר פרצה על ידי זיהוי של ribo-רגולטורי noncoding החזקים 2, על ידי הגילוי של מנגנונים מבוססי RNA רומן הרגולציה 3,4 ועל ידי אפיון מעמיק יותר של אירועים שלאחר התעתיק כבר ידועים 5. כל הביולוגיה RNA יחד מחקרים אלה אפשרו לעשות באופן דרמטי את הסצנה, הפך נושא המחקר מרכזי בנוף המדעי הנוכחי. בפרט, בשנים האחרונות אנחנו מקבלים תחושה של ההשפעה המתפשטת של &quot;עולם RNA&quot; בנוירוביולוגיה המולקולרית 6, אחד מתחומי המחקר הדינמיים ביותר במדעי החיים מודרניים. בעשור האחרון של המאה שעברה, התרחיש המדעי הכולל כבר מהפכה על ידי הגילוי של התערבות RNA 7,8 ושל RNAs הרגולציה הקטן 9,10ביחס מסוים ל11 מייקרו RNA, באופן אנדוגני הביע RNAs noncoding הקטן מעורב בשליטה כמעט את כל הפונקציות הסלולריות כרגולטורי pleiotropic וקומבינטורית של ביטוי גנים. כמעט 10 שנים לאחר הגילוי ראשוני מירנה בelegans Caenorhabditis ידי אמברוס והמעבדות של Ruvkun, תשומת לב מחודשת הפכה לשדה כאשר מספרים גבוהים של miRNAs זוהו בדרוזופילה ובתאים אנושיים, כמו גם 12-15. מאז, הודות לגישות מהונדסים תכליתיות, melanogaster דרוזופילה יש התבלט כהקשר ביולוגי יקר ערך עבור להתעמק ביוסינתזה ופעילות מירנה. דרוזופילה miRNAs חשפו פונקציות שונות בתהליכי חרקים ספציפיים או אבולוציונית משומרת, פורש מהזדקנות לחילוף חומרים, מסלולי איתות , התנהגות, וכמובן, נוירוגנזה. לאורך כיוון זה, אנו חשפו לאחרונה קישור רומן 16 בשיתוף המסקרןrrelation מתרחש בין GCM / דאיית גן האדון ומסלול RNA. גורם שעתוק זבוב GCM / Glide 17-19 מהווה דוגמא ייחודית של הקובע גורל תא, אשר מכתיב את בחירת הגורל העצבית גליה לעומת בmultipotent לטוס מבשרים עצביים 20. עשרים שנה מחקר ארוך בנושא זה באופן ברור הדגיש את התרחשותם של מספר רב של תשומות והחופפות של רגולציה ביטוי גנים מתכנסת על GCM / להחליק 21-28 להקים את רמות הסף הנדרשות לאיזון היחס העדין בין עמיתים עצביים וגליה במהלך התפתחות עצבית. גילינו כי רגולציה, באמצעות מיקוד לפי Dmel-miR279 מייצגת רמת שליטה נוספת שתרמה לכוונון עדין שלאחר תעתיק של GCM / להחליק ביטוי 16. שיפורים מתודולוגיים ספציפיים בעולם, קווי מחקר אלה נדרשים: לאורך שנים, במספר טכנולוגיות שפותחו במקור כדי לנתח מסורתיתRNAs itional הוסב לכימות RNAs לא קטן קידוד, כמו כמבחני הגנה RNAse, מערכי cDNA 29-31, שיטות PCR בזמן אמת 32-35 ורצף 36,37. בצד השני, כיול של גישות טכניות טפח התקדמות רציפה בתחום. צפון הכתם assay (NB, או assay כתם ג&#39;ל RNA) מהווה דוגמא מייצגת: הוא מועסק במידה רבה לפרופיל הצטברות RNA, שכן הוא מבטיח שני quantitation רמת הביטוי, כמו גם קביעת גודל. עם זאת, רגישות העניים המהותית של השיטה היא להגביל כאשר הוא שיחול על מקלטי קנס ביטוי גנים נמוכים בשפע, כמו RNAs הקצר. תוצאה מזיקה היא הדרישה של כמויות גדולות של רנ&quot;א הכל, מה שהופך את היישום שלה קשה לדגימות ביולוגיות ספציפיות. מסיבות כאלה, וריאנטים NB ספציפיים לגילוי RNA קטן פותחו 38-40: אנו ניצלנו proc NB השתפרedure 41 (ENB, משופר צפון כתם), ואילו הבהרת הגומלין הנ&quot;ל בין Dmel-miR279 וGCM / דאייה. שיטה זו מסתמכת על צעד כימי crosslinking מבוסס על הפעילות של נגזר Carbodiimide [1-אתיל 3-carbodiimide (3-dimethylaminopropyl), EDC] לתקן חומצות גרעין על תמיכה מוצקה. Carbodiimide הוא מקשר צלב צדדי הידוע לזרז את הקמתה של אגרות חוב אמיד בין קבוצות carboxyl או פוספט מופעלות וקבוצות האמינים 42. מאפיין זה יכול להיות מנוצל לזוג קוולנטית RNA הקטן באמצעות קבוצת 5&#39;-הידרוקסיל מונו פוספורילציה לאמין קבוצות על פני השטח של קרום ניילון. תצורת הקובץ המצורף וכתוצאה מכך מגדילה את הנגישות של חומצות גרעין המשותקים ו, בתורו, את היעילות של הכלאת בדיקה-יעד, וכתוצאה מכך שיפור גילוי מדהים 43. הטכניקה מניחה relevanc מסויםדואר במחקרים מולקולריים דרוזופילה, שבו ההתרחשות של כיתות רומן וייחודיות של RNAs noncoding הקטן מתגלה 44. בין אלה, rasiRNAs 45,46 מהווים תת סוג ספציפי של RNAs אינטראקציה-piwi (piRNAs 47), מעורב בהשתקת גני רצף ספציפי. פרטים אופרטיביים של שיטה זו מתוארים באופן מלא ומדמיינים להלן, ביחס לניתוח של מייקרו RNA Dmel-miR279 וDmel-miR286 ו, בפעם הראשונה, של אחד rasiRNA, rasi4. אנחנו דחפתי למצבים קיצוניים ששיטה זו, אשר אפשרה לנו לחשוף את המטרות הביעו גרוע מכמויות מינימליות של RNA (מיקרוגרם פחות מ 1).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

העשורים האחרונים היינו עדים לפיצוץ של כ מנגנוני בקרת ביטוי גני עניין מדעי ברמת RNA. ענף זה של ביולוגיה מולקולרית כבר מתודלק באופן משמעותי כתוצאה מגילוי noncoding RNAs כשחקנים מרכזיים בויסות לאחר תעתיק. כגון פרספקטיבה מהפכנית כבר מלווה ומופעלת על ידי הפיתוח של טכנולוגיות רבות עוצמה לאפיון ביטוי RNAs קצר, הן ברמת התפוקה הגבוהה (זיהוי הגנום) או כניתוח בודד מועמד (הצטברות מצב יציבה של מינים ספציפיים). למרות שכמה אסטרטגיות המדינה של אמנות זמינות כעת למינון או חזותי מולקולות שברחו כזה, assay צפון הכתם נשאר הגישה זכאית בביולוגיה מולקולרית להערכה מיידית ומדויקת של ביטוי RNA. זה מהווה צעד ראשון בדרך ליישום של, וטכנולוגיות יקרות יותר מתוחכמות, במקרים רבים, נותר שיטה מועדפת לתובנה בקלותלביולוגית RNA. כאן אנו סקירה כללית של פרוטוקול יעיל (Enhanced צפון כתם) לאיתור מייקרו RNA מתבטא בחולשה (או מיני RNA קטנים אחרים רגולטורים) מתסיסנית כל עוברים, גזורים באופן ידני רקמות / מבוגר זחל או בתאים בתרבית מבחנה. כמות מוגבלת מאוד של RNA נדרש והשימוש בחומר מתאי הזרימה cytometry-מבודדים יכולים להיות גם בחזונו.

<html> על ידי ביצוע ההליך הכולל המתואר בטקסט ואופן סכמטי המיוצג באיור 1, אנו הערכנו ביטוי RNA הקטן מדוגמאות RNA מורכבות של מקורות שונים. בניסוי שהוצג באיור 1, RNA היה מבודד מ2 התאים של דרוזופילה שניידר על ידי מיצוי proteinase K, בדיקת תקינות ב( שלב אופציונאלי: denaturing חלוקה agarose ג&#39;ל) ועמוס בכפול. מחצית אחת של ג&#39;ל הייתה מחקה על קרום ניטראלי וכימי צולבים על ידי EDC; המחצית השנייה הועברה על מסנן ניילון במטען חיובי, אז UV צולב (1.2 x 10 5 μJ / 2 סנטימטר). הביטוי אנדוגני של שני מייקרו RNA השייך למשפחת Dmel-miR279 (Dmel-miR279 עצמו ו15 Dmel-miR286) אומת בשני התנאים. ההליך המשופר (ENB) מבטיח כבוד רגישות גבוה יותר לסטנדרטי אחד (SNB). s = &quot;jove_content&quot;&gt; היעילות שונה בין שתי השיטות היא אפילו טוב יותר מודגש באיורים 2 ו -3. רציונל הניסוי הוא כנ&quot;ל: כאן אנו מדווחים על תוצאת הנציג של איתור autoradiographic צפון כתם של rasi4 Pirna לאורך טיטרציה של רנ&quot;א הכל חולץ ממבוגרים לטוס אשכים. ENB כבר מאפשר גילוי להקה ספציפית כאשר 0.5 מיקרוגרם של רנ&quot;א נטען. הכימות בצד מראה כיצד האות יחסי עולה עם כמות הרנ&quot;א מופרד, מצביע על כך שיחס מינון / תגובה נמצא בטווח ליניארי של זיהוי. הפנל מתחת מאשרר את הרגישות המשופרת של שיטה זו בהשוואה לSNB. במקרה זה, אות לזיהוי מתקבלת על חלוקה electrophoretic של 10 מיקרוגרם של רנ&quot;א לפחות עבור הבנק המרכזי של שוויץ. תוצאות דומות הושגו עם מיני RNA noncoding שונים, למשל, rRNA 5s, כפי שדווחו באיור 3 &lt;/ Strong&gt;. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 ייצוג סכמטי של הליך צפון הכתם הכולל. צעדים פרוצדורליים ראשיהם מופיעים וממוספרים בהדרגה. תוצאות הן בהשוואה בין הכתם משופר הצפון (ENB) ורגיל צפון הכתם (SNB), שבוצע באותם תנאים: בידוד RNA מן 2 התאים של דרוזופילה שניידר (לוח 1), אלקטרופורזה (לוח 2), העברה (לוח 3) וכלאה ( לוח 5). ENB מתייחס להליך השיפור שתואר בדוח זה, אשר דורש מסנן ניטראלי (לוח 3, מחצית השמאלית של הקרום) וcrosslinking (לוח 4) המבוסס על EDC הקובעת קשר הקוולנטי בין RNA היעד 5&#39;-end וקרום ( נקודות ורודות בלוח 4). בבנק המרכזי של שוויץ, crosslinking RNA מתקבל על ידי טיפול UV (לוח 4) במטען חשמלי חיובי nylon קרום (לוח 3, מחצית ימנית של הקרום). אות ספציפית 5S RNA היא לא כיל בתנאים השוואתיים, כי זה גם מגיב להבדלים בין SNB והליך ENB. לפיכך, סכום (המקביל ל 10 CPS) של כותרת 5&#39;(ראה נקודות 4.3 ו4.4 לפרוטוקול), 50 oligonucleotide NT המקושקשת ארוך התווסף לכל דגימה לפני אלקטרופורזה, לתפקד כ&quot; עלייה חדה ב&quot; התייחסות ( לוח 7). טוען יכול להיות גם שהוערך על ידי מכתים EtBr בג&#39;ל של rRNAs הארוך (ראה נקודה 5.5 לפרוטוקול). L = סולם. FV = פרונטאלית צפה ב, LV = רוחב צפה ב, HV = צפה אופקי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51814/51814fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 Comparניתוח יצירתי צפון כתם ביטוי rasi4. רמות אנדוגני של rasi4 Pirna האשך ספציפי מתגלים על ידי משופר (ENB) או סטנדרטי (SNB) צפון כתם, שבוצע על הגדלת כמויות של רנ&quot;א הכל (שצוין לעיל כל מסלול) שחולץ מן האשכים דרוזופילה מבוגרות , או מכל בטן (עבד). עבור כל מתודולוגיה, היסטוגרמות הצידה לדווח כמויות היחסית של כבוד rasi4 לאותה כמות של &quot;עלייה חדה ב&quot; שליטת טעינה. Quantifications משתי השיטות משולבים בגרף חותך ממוקם מתחת לג&#39;לי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51814/51814fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig3highres.jpg" width="500" /> איור ניתוח .3 השוואתי צפון כתם של r 5SRNA ביטוי. כביקורת חיובית וכיול ניסיוני, ניתוח קודם הוארך עד rRNA 5s. פרטים כמו באיור 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51814/51814fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב<em&gt; תסיסנית</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.9K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים. 

Video: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

תחזוקה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; אוכלוסיית קייג

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em&gt; תסיסנית</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...