אנו מודים שכמיות-ברזיל, CNPq-ברזיל, FAP/DF עבור תמיכה כספית. אנחנו אסירי תודה ד ר הוגו קוסטה פאיס עבור תיקון כתב היד.

1. פתרונות ומדיה
<ol><li>הכנת 2 X רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), מרק דקסטרוז Sabouraud ו- Sabouraud אגר דקסטרוז לפי טבלה 1.</li>
</ol>2. תנאי הגידול Inoculum פטרייתי
<ol><li>לאחסן כל זני פטריות קפואות מניות ב- 35% גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס, עד שהוא נדרש.</li>
	<li>בצע את השלבים הבאים לפני ניסוי.<ol>
<li>עבור זנים של קנדידה אלביקנס :<ol>
<li>הפשרת בקבוקון מניות ולהעביר 200 µL מ"ל Sabouraud מרק דקסטרוז צינור פוליפרופילן סטרילי 50 מ עם מכסה, תרבות בין לילה ב 30 ° C עם עצבנות (200 סל ד). זכור שיפוע הצינור ולהשאיר את הכובע פתוחה במקצת עבור לערבב טוב יותר של התרבות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עבור זנים קריפטוקוקוס neoformans :<ol>
<li>לגרד את פני השטח הקפואים של הבקבוקון מניות. צלחת את התאים על פלטות אגר דקסטרוז Sabouraud ואת תקופת דגירה של 48 h ב- 30 ° C. לאחר הצמיחה גלוי של מושבות המבודד, לשמור את הצלחות במקרר (4 ° C) אטום עם סרט פרפין עד 15 ימים.</li>
			<li>לאסוף את מושבה מבודד בגודל בינוני מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי או לולאה לחסן סטרילי, לחסן 10 מ ל מרק דקסטרוז Sabouraud צינור חרוטי סטרילי 50 מ. תקופת דגירה של 24 h ב- 30 ° C תחת עצבנות (200 סל ד).</li>
			<li>אם תחרוג הדגירה 24 שעות ביממה. זכור שיפוע הצינור ולהשאיר את הכובע פתוחה במקצת עבור לערבב טוב יותר. . זה תמיד טוב לתקנן את שלב הצמיחה של התאים לפני כל בדיקה, מאחר וזה גורם חשוב המשפיעים על עמידות מיקרוביאלית. הערה: פטריות הן גדלו ב 30 ° C עבור הפצת מהירה בניסויים שלנו, אך ניתן לשנות את הטמפרטורה כדי לשקף את המטרות של המחקר, טיפול רפואי לדוגמה (37 מעלות צלזיוס). והכי חשוב, הפעם הדגירה הראשונית צריכה להיות הוקמה מראש עבור כל בידוד פטרייתי ומתוחזק לאורך כל הבדיקות כדי להבטיח הפארמצבטית.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר צמיחה פטרייתי, לאסוף את התאים על ידי צריך שתוציאו הצינורות חרוט ב g x 1,200 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>Resuspend את התאים ואת צנטריפוגה שוב ב- g x 1,200 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חזור על כביסה PBS ו צנטריפוגה עוד פעמיים. לאחר לשטוף את השלישי, resuspend את התאים ב 5 מ ל (לפי גודל גלולה) 2 X RPMI-1640 בינוני.</li>
	<li>להכין 1 מ"ל של בטחונות או 1:1,000 לדילול צינור microcentrifuge (בהתאם עכירות של התליה תא).</li>
	<li>Aliquot 10 µL של דילול זה, למקם אותו בתוך תא hemocytometer ולספור את המספר הכולל של תאים ברבעים פינה ארבעה מתחת למיקרוסקופ. לחשב את הריכוז באמצעות הנוסחה: (סה כ מס ' תא/4) x דילול פקטור x 104 (קאמרית דילול קבוע).<ol>
<li>שקול הכדאיות של 100% אם ספירות הכדאיות ותנאי גידול יש היה בקורלציה באופן שיטתי עבור בידוד נחקר. הערה: תקינה ובקרת איכות של ספירת הכדאיות יכול להיעשות על ידי חזרה-ציפוי בהתאם הוועדה האירופית על שיטת בדיקות רגישות מיקרוביאלית (EUCAST) מינימום מעכבות ריכוז (MIC) פטריות שמרים10 .</li>
		<li>אם המתאם צמיחה/הכדאיות לא נוצרה במשך בידוד שנבחנה, למדוד את הכדאיות פטרייתי על ידי ספירת תאים חיים ב hemocytometer בעזרת צבעי זה צבע סלקטיבי תאים מתים, כגון phloxine B11, trypan blue 12, או יאנוס ירוק13. השתמש התאים פטרייתי עבור פרוטוקול זה רק אם הכדאיות של האוכלוסייה בשלב זה הוא 90% ומעלה. הערה: צבעי המלח/חיה לא יפעלו היטב עם הפטריה של בחירה. בבקשה לבדוק אותם לפני השימוש. לדוגמה, לצבוע trypan blue לא עובד טוב עם neoformans ג.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר מכן, להכין את המתלים תא 2 X RPMI-1640 בינוני (2 X יותאמו inoculum בינוני RPMI-1640). עבור לוחות 96-ובכן לשקול אמצעי אחסון של 5 מ"ל על כל צלחת.<ol>
<li>עבור כל אלביקנס ג זנים, להכין השעיה תא מניות של 4 x 103 תאים למ"ל. זה הריכוז הוא 2 X של ריכוז התא האחרון מכל קידוח (2 x 103 תאים/mL).</li>
		<li>עבור זנים neoformans ג , להכין מלאי תרבות של תאים 2 x 104 תאים/מ ל.... זה הריכוז הוא פעמיים התא האחרון ריכוז כל היטב (1 x 104 תאים/mL).</li>
		<li>עבור פטריות אחרות, מבחן עם ידוע פטריות באיזה ריכוז יהיה אידיאלי לחקר מסוים ביחס זמן הדגירה. להתחשב בזמן חילוף החומרים ושכפול של הפטריה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. פפטידים (סוכן לא ידוע)
<ol><li>לאחסן את פפטידים lyophilized ב-20 ° C, לפזר אותם במים יונים לפני ניסוי. הפעם אחסון מרבי פעם מומס במים יהיה תלוי אופי כל פפטיד.</li>
	<li>להכין את aliquots של פעמיים את הריכוז הגבוה ביותר הסופי במקצועות וזמינותו (2 X). באופן אידיאלי, להכין מספר קטן של aliquots עם מספיק פפטיד לשימוש פעם אחת להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה. הערה: הבחירה של ריכוז צריך להיות מבוסס על ספרות והמאפיינים של פפטיד. מומלץ להתחיל את דילולים סדרתי עם-100 מיקרומטר של פפטיד, ואז להקטין או להגדיל את טווח ריכוז זה בהתאם לתוצאות שהושג.</li>
</ol>4. התייחסות תבחיני (פקדי חיובי)
<ol><li>עבור אלה מדולל במים: להכין פתרון X 2 של הריכוז הגבוה ביותר של הניתוח (ראה סעיף 5: פטריות Assay עבור הצעדים דילול).<ol>
<li>עבור זנים אלביקנס ג , להכין פתרון של µg/mL 128 של פלוקונאזול או 128 µg/mL של קספופונגין. ריכוז צלחת לשניהם יהיה 64 µg/mL.</li>
		<li>עבור זנים neoformans ג , להכין פתרון של µg/mL 32 של המפוטריצין (פתרון מסיסים במים). ריכוז צלחת יהיה 16 µg/mL. הערה: בדרך כלל המפוטריצין הוא מדולל ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), מאז זה נגד פטריות הוא מסיסות במים. עם זאת, ישנם תכשירים המפוטריצין מסיסים במים זמינים מסחרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור תבחיני מעורבבת עם הממס האורגני: להכין 100 X פתרון מניות ב דימתיל סולפוקסיד ולאחר מכן למהול אותו עד 10 X מים לשימוש. הערה: לפיכך, בבאר, הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד לא יעלה 1%. באר שבו הפטרייה יצמח בתקשורת המכיל 1% דימתיל סולפוקסיד כפקד נדרש לאור העובדה כמה פטריות לא סובלים גם בריכוז זה של הממס. זכרו דימתיל סולפוקסיד פוטוסנסיטיבית, אז כיסוי לצלחת עם נייר כסף או להניחה בחדר חשוך למשך כל תקופת הדגירה.</li>
</ol>5. פטריות Assay
הערה: במבחנה מבחני פטריות מבוצעות בהתבסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות קלינית ומכון תקנים מעבדה (CLSI) M27-A3 עם מספר שינויים.
<ol><li>להכין לדילול טורי כפולה כל פפטיד ושליטה פטריות ב 96-ובכן פוליסטירן microplates לאמצעי הסופי של 50 µL.<ol>
<li>בעזרת פיפטה להוסיף 100 µL של פטריות/פפטיד בריכוז 2 X הגבוה הרצוי הריכוז הסופי בעמודות שורה בתוך 1-3, א</li>
		<li>בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של מים סטריליים לתוך הבארות אחרים, בשורות ב' עד ה'</li>
		<li>הסר µL 50 הבארות עם הריכוז הגבוה ביותר (row A), העברה הבא טוב של ריכוז הבא (שורה B), homogenize.</li>
		<li>חזור על השלבים שלעיל עד הבאר עם הריכוז הנמוך ביותר ולמחוק 50 µL של זה הרבה (שורה H). להשאיר עמודות 11 ו- 12 (שורות A, B, C) עם המים היחידים עבור הפקד ריק או שליטה שלילי/צמיחה.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של 2 X מנוכי עונתיות inoculum בינוני RPMI-1640 מכל קידוח (עמודים 1-3 בתוספת טור 11 (פקד שלילי/צמיחה)); הריכוז הסופי עבור אלביקנס ג יהיה עונה 2 פרק 103 תאים למ"ל, וריכוז הסופי זנים neoformans ג יהיה 104 תאים למ"ל.</li>
		<li>להכין פקדים ריק (מים µL 50 + 50 µL 2 X RPMI-1640 בינונית ללא תאים) שליטה שלילי/צמיחה (מים µL 50 + 50 µL מותאמות inoculum 2 X RPMI-1640 בינוני בלי פטריות) ואת העומס המשקולת טוב כפי שתואר לעיל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על ההליך בכל מתחם להיבדק והפקד פטריות שבחרת (עמודות 4-10). הערה: טורי דילולים יכול להיעשות אנכית כפי להלן הניסוי, או אופקית בצלחת (קרי, אם המספר של דילולים של התמצית נתונה התרכובת/שצריך להיבדק הוא שמונה ומעלה).<ol>
<li>אם הפניה תרכובות, סמים, או כל מרכיביו אותםלאור, לבצע את הבדיקה באור מופחתת, לכסות את הלוחות בנייר כסף או למקם בחדר חשוך במהלך incubations.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שקול את ההמלצות הבאות אופציונלי.<ol>
<li>חותם את הצלחת עם צלחת כיסוי ברור המתיר חילוף הגזים, כמו זה מסייע להפחית את אידוי.</li>
		<li>מקם את הצלחת בחדר לחים; זה גם יעזור להפחית את אידוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה או 48 שעות עבור כל זני אלביקנס ג , ועבור 48 שעות עם סל"ד 200 רועד עבור neoformans ג. עוצמת הקול הסופי נמוך (100 µL) מבטיח כששינוי לא תתרחש. הערה: אין הבדל משמעותי נצפתה בין קריאות MIC ב 24 שעות ל- 48 שעות עבור זנים אלביקנס ג . למרות זאת, קריאות ב 48 שעות הם קל הרבה יותר לדמיין.</li>
	<li>שימו לב כל בארות, בסיוע מיקרוסקופ אופטי הפוכה, לפני תקופת הדגירה ואחרי כדי לוודא שינויים מורפולוגיה גם כדי לבדוק סימני זיהום. הערה: קריאות יכול להיות נעשה באופן חזותי, צולם בסוף הניסוי. לפני כל קריאה, homogenize מעט את הצלחת. ניתן גם לבצע את הקריאות על ידי מדידת OD שלה ב 600 nm, אם התא מתגבש או filamentation הם לא נצפו.</li>
	<li>לבצע את הניסויים לפחות שלוש פעמים על תאריכים נפרדים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+mechanisms,+epidemiology,+and+consequences+for+treatment.">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li><li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences.">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics.">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AaeAP1+and+AaeAP2:+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion,+Androctonus+aeneas:+structural+characterisation,+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities.">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li><li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts.">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).</li><li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms.">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844 (2016).</li><li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Tests+for+Thick+Walled+Fungal+Spores+(ex:+Oospores+of+Peronospora+manshurica).">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li><li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+stain+for+fungi.">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li><li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis.">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li><li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media.">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li><li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts.">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בדיקות Microdilution יכול לנתח את הפעילות נגד פטריות פוטנציאלי של מטרה מורכבים באמצעות כמויות קטנות של המתחם, באותו זמן לבחון אותה בטווח ריכוזים. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מומלץ כשלב ראשון סינון עבור פוטנציאל תרכובות חדשות נגד פטריות. פרוטוקול המובאת כאן מבוססת על פרוטוקול M27-A3, תוכנן בתחילה כדי לס?...

זיהומים פטרייתיים הפכו הדאגה הרפואית חשובה במהלך העשורים האחרונים, נתקל גדל במידה ניכרת בעיקר בשל עלייה במספר של יחידים immunocompromised כגון אלה עוברת טיפול בסרטן, אלה החיים עם HIV/איידס או מושתלים איברים1,2. עם זאת, מערך מוגבל מאוד של תרופות נגד פטריות זמין, הגדלת מספר דיווחים על ההתנגדות פטרייתי להם לתרום הבעיות העיקריות לגבי הרפוי של mycoses מערכתית3.
מקור פוטנציאלי של תרכובות חדשות פטריות הם פפטידים מיקרוביאלית (אמפר), קטן פפטידים cationic המיוצר על ידי אורגניזמים רבים כחלק שלהם תגובה חיסונית מולדת זיהום4. למרות זאת, שיטת ההקרנה כדי לבדוק את המשחות נגד פתוגנים ופטריות אינה אחידה. הליכים שונים שימשו כדי להעריך את הפעילות פטרת של אמפר, לפעמים על אותו מודל מיקרואורגניזם5,6,7. הבדלים אלה וחוסר פרט פרוטוקולים מסוימים לסבך השוואות בין הפארמצבטית תרכובות ואת הסלים.
דרך אחת כדי לתקנן את הבדיקות למועמדים סמים חדשים היא לעקוב אחר הנחיות המשמש להגדרת הרגישות פטריות בהגדרות קליני, כגון קלינית והנחיות M27 מכון תקנים מעבדה (CLSI)-A3. עם זאת, בדיקות רגישות פטריות אלה מגבילות מדי, לא עשה שיקול וריאציה בחילוף החומרים על פני מינים, כפי שהם הוקמו רק עבור כמה סוכנים בחר. לדוגמה, הם לא לוקחים בחשבון את צרכי חילוף החומרים שאינם התססת שמרים.
פרוטוקול זה מאפשר את ההערכה של פעילות של תרכובות פטריות פוטנציאליים והוא מיושם כאן לחיפוש פטריות פפטידים. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות CLSI M27-A3 עם שינויים לייעל את ההקרנה של תרכובות חדשות8,9. שינויים אלה מאפשרים השימוש כמויות קטנות של המתחם, וריאציות של טמפרטורה או inoculum הראשונית, מדיה שונים לצמיחה pre-test אופטימלית, תוך המתקנות את התוצאות עם השימוש של הפניה תבחיני כפקדים. שיטה זו, עם השימוש של תרבות רב טוב צלחות, מאפשר למסך במהירות ובאמינות מספר רב של תרכובות.
עקב הגמישות שלה, פרוטוקול זה יכול לשמש עם מחלקות שונות הכימי של תרכובות ונגד מיקרואורגניזמים אחרים, עם כמה עיבודים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino) propane sulfonic acid&lt;em&gt; (MOPS) (o que a gente usa tem um s&amp;oacute;dio, completa o nome dele please)&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use to buffer 2X RPMI medium</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Din&amp;acirc;mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% for (solu&amp;ccedil;&amp;atilde;o de estoque? Criopreserva&amp;ccedil;&amp;atilde;o?)</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td>Para dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o das drogas na dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o seriada</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antifungal drugs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Dish petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Solution Reservoir</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment and other materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugue</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Set to 37&amp;deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Set to 37&amp;deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Cell counting chamber, Neubauer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

זיהומים פטרייתיים הפכו מצב רפואי חשוב בעשרות השנים האחרונות, אך מספר תרופות נגד פטריות זמין הוא מוגבל. בתרחיש זה, החיפוש אחר תרופות נגד פטריות חדשות הכרחי. פרוטוקול דיווח על פרטי שיטה פפטידים מסך עבור מאפייניהם נגד פטריות. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות קלינית ומכון תקנים מעבדה (CLSI) M27-A3 עם שינויים שיתאימו למחקר של פפטידים מיקרוביאלית כמו תבחיני חדשים פוטנציאליים. פרוטוקול זה מתאר assay פונקציונלי כדי להעריך את הפעילות של תרכובות נגד פטריות, ניתן לשנות בקלות כדי להתאים כל סוג מסוים של מולקולות תחת חקירה. מאז מבחני מבוצעות ב- 96-ובכן צלחות באמצעות אמצעי אחסון קטן, הקרנה בקנה מידה גדול וניתן להשלים את כמות קצרה של זמן, במיוחד אם יבוצע באווירה אוטומציה. הליך זה מדגים איך פרוטוקול קליני מתוקנן, הניתנים לשינוי יכול לעזור המרדף ספסל-עבודה של מולקולות חדשות כדי לשפר את הטיפול של מחלות פטרייתיות.

המיקרופון מוגדר הריכוז הנמוך ביותר במתחם מיקרוביאלית כי לחלוטין מעכב צמיחה פטרייתי גלוי בסוף תקופת הדגירה. מאחר המטרה של פרוטוקול זה יש שיטה מהירה תבחיני פוטנציאליים מסך, כל טוב עם הדומה הבארות ריק ברור מדיה נחשבת תוצאה חיובית, ואילו בכל טוב עם עכירות מקביל הבארות שליטה ...

Watch this Scientific Journal Video about Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds at JoVE.com

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

שיטת microdilution מרק קל וישימה לסינון תרכובות פטריות ותמציות.

מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.8K Views.  University of Brasília. שיטת microdilution מרק קל וישימה לסינון תרכובות פטריות ותמציות.

Video: Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Immunology and Infection

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Bioengineering

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental stages. A specified number of spores are spread on an agar plate. This agar plate is incubated for a defined period to allow the fungi to reach the expected developmental stage, except for spores where incubation is not required. Agar plugs covered by spores, hyphae, or mycelium are next withdrawn and transferred onto agar media containing the antifungal compound to be tested either placed at a distance from the fungi or in contact. This method is applicable to test both liquid extracts and solid samples (powders). It is particularly well suited for quantifying the relative contributions of volatile and non-volatile agents in bioactive mixtures and for determining their effects, specifically on spores, early hyphae, and mycelium.
The method is highly relevant for the characterization of the antifungal activity of biocontrol products, notably plant-derived products. Indeed, for plant treatment, the results can be used to guide the choice of mode of application and to establish the trigger thresholds.

We describe a modified agar-based method designed to quantify the antifungal effects of plant-derived products. Both volatile and non-volatile contributions to the antifungal activity can be assessed through this protocol. In addition, efficacy against fungi can be measured at key developmental stages in a single experimental setup.

מדידת פעילות אנטי פטרייתית נדיפה ולא נדיפה של מוצרי ביו-בקרה

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

Environment

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin<em&gt; במבחנה</em&gt; בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקת סינון בתפוקה גבוהה עבור Mycobacterium abscessus באמצעות כתבים כפולים

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: Scalable Drug Screening Protocol for Efficient Discovery of M . abscessus Therapies

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

Summary

Explore More Videos

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

קנדידה אלביקנס biofilm צ'יפ (ע"א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

מדידת פעילות אנטי פטרייתית נדיפה ולא נדיפה של מוצרי ביו-בקרה

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה