Name: adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer at JoVE.com

ברצוננו להודות Bettine גיבס עזרה טכנית.

ללבוש חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפיים בכל עת בזמן ביצוע כל ההליכים ב פרוטוקול זה. ודא כי מכולות/צינורות המכיל הכימית isothiocyanate פנול ו guanidine נפתחים רק מוסמך הוד, ולאחר השלך פסולת פנול במיכל ייעודי. השתמש DNAse/RNAse ללא צינורות סטרילי, טיפים, ריאגנטים.
1. תרבית תאים
<ol><li>לגדול הלה תא ואת שני ההשעיה מנטל לימפומה התא שורות תאים, Granta-519 ו- Jeko-1, ב- DMEM המכיל 10% FBS ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C. לדלל 1:10 תאים ולספור באמצעות חלקיקים מונה14.</li>
	<li>לחילוץ RNA, צלחת 500,000 תאים/היטב לתוך צלחת טוב 6 (2 מ ל מדיה לכל טוב). לאחר דגירה במשך 24 שעות ביממה, לאסוף RNA התאים.</li>
</ol>2. RNA החילוץ
<ol><li>קציר תאים הערה: למעט השלב צנטריפוגה, לבצע את כל השלבים המפורטים בברדס תרביות רקמה כדי לשמור על עקרות.<ol>
<li>עבור תאים ההשעיה (Jeko-1 ו- Granta-519):<ol>
<li>להעביר את התאים (יחד עם 2 מ"ל של מדיה) צינור 15 mL, ו צנטריפוגה-1,725 g x עבור 5 דק וביופסיה התקשורת ולהשאיר בגדר תא בתחתית של הצינור.</li>
			<li>Resuspend בגדר תא ב- 50 µL 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS). להוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל מדגם בצינור microcentrifuge 1.5 mL. ערבבו היטב והמתינו בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות תוך כדי היפוך הצינור microcentrifuge לכל 1 דקות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עבור תאים חסיד (הלה):<ol>
<li>האחות התקשורת התרבות התא מכל קידוח. להוסיף 1 מ"ל של PBS כל טוב לשטוף את הלכלוך.</li>
			<li>להסיר את PBS ולהוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל טוב.</li>
			<li>תקופת דגירה-RT של 5 דקות עם נדנדה עדין. העברת צינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>פירוק התא<ol>
<li>הקפאת התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, ב-20 ° C עבור 1 h. הערה: התמהיל יכול להיות שמאל ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד הצורך.</li>
		<li>להפשיר את התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, על קרח. להוסיף 100 µL של כלורופורם הצינור microcentrifuge בשכונה ה-PCR. מערבולת המדגם עבור s 10-15 עד התערובת הוא ורוד אטום. דגירה המדגם על קרח (ב 4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות.</li>
		<li>Centrifuge המדגם למשך 15 דקות ב 20,800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את השלב העליון מימית השקופה (~ 200 µL), העברת צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA משקעים<ol>
<li>להוסיף אמצעי שווה של אלכוהול איזופרופיל כל דגימה. להוסיף 1 µL של coprecipitant (ראה טבלה של חומרים) אחד לטעום לפעול כנשא עבור הרנ א. ולעזור להמחיש את הרנ א בצעדים העוקבים. דגירה המדגם ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. לקבלת תוצאות מיטביות, דגירה בין לילה ב- 80 ° c</li>
		<li>להעביר את הדגימה צנטריפוגה מקורר. צנטריפוגה במשך 35 דקות ב 20,800 x g / 4 ° C; הרנ א תופיע כתם כחול על החלק התחתון של הצינור. הסר בזהירות את אלכוהול איזופרופיל מדגם. להוסיף 500 µL של 80% אתנול, resuspend בגדר מאת בקצרה vortexing עבור 3 s.</li>
		<li>צנטריפוגה המדגם ב g x 20,800 ב RT עבור 5 דק להסיר כל האתנול המדגם. תן הדגימה מילה נהדרת כ 10 דקות Resuspend הדגימה ב µL 35 RNAse ללא מים. מניחים על גוש חום (65 ° C) במשך 5 דקות להבטיח הרנ א יהיה מלא בפתרון, מיד במקום הצינור על קרח.</li>
		<li>לקבוע את הריכוז של RNA הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים כאמור תיאר, אלא להשתמש µL 1.5 המדגם RNA במקום 1 µL15. באופן אופציונלי, להפעיל µg 1 של RNA הכולל ג'ל agarose 1% כדי לקבוע את תקינות ה-RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase טיפול
<ol><li>לאחר כימות RNA, מבצע טיפול DNAse הרנ א הכולל כדי להשפיל את כל הדנ א. עבור כל דגימה, הוסף את ריאגנטים הבאים ערכת DNAse RNAse-חופשית כדי לגרום לתגובה הכולל 20 µL לערבב פנימה צינור microcentrifuge נפרדים:<ol>
<li>לערבב 2 µL של DNase 10 X תגובת מאגר עם µg 4.4 של RNA הכולל. מביאים סכום כולל של 14 µL עם מים.</li>
		<li>להוסיף 2 µL של נטול RNase DNAse. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בנוכחות 2 µL של RNase מעכב (מתוך הערכה שעתוק לאחור).</li>
		<li>להוסיף 2 µL של פתרון להפסיק וחום על גוש חום למשך 10 דקות ב 70 ° C כדי להשבית את האנזים DNAse. הערה: DNAse הטיפול היא אופציונלית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cDNA סינתזה
עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL:
<ol><li>עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL: 22 העברת µL של DNase מטופלים RNA צינור חדש או העברה 4 µg של RNA הכולל עם מים נוסף לאמצעי סך של 22 µL על צינור. להוסיף 2 µL של הראשיים25 . dT oligo T7 מהפתרון תחל 10 מיקרומטר. הרצף עבור הראשיים25 . dT oligo T7 הוא 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>הערכה הפוכה שעתוק להוסיף 2 µL של המדכא RNase (20 U µL), µL 8 המאגר התגובה 5 x, µL 4 של 10 מ מ dNTPs ו 2 µL של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL). הערה: להגדיר תגובה בלי רוורס טרנסקריפטאז לפעול כמו פקד שלילי.</li>
	<li>דגירה ב 42 ° C עבור ה 1 העברה ישירות לקרח. מחממים את הצינור ב 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים את הצינורית על קרח.</li>
</ol>5. פריימר חיפוש של פיוז'ן ג'ין התעתיק
<ol><li>
העיצוב תחל
	<ol>
<li>הורד את רצף cDNA מהדפדפן הגנום אנסמבל (ENST00000360839.6/NM_017747) וזהה של אזור בתוך ORF של היעד תמליל (ANKHD1) במעלה הזרם של stop codon. העתקה והדבקה של האזור כולו (עד 700 נוקלאוטידים) המכיל רצפי במעלה הזרם stop codon אל אזור הזנת רצף של תוכנת עיצוב פריימר (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>בחרו באפשרות ' הצג עיצוב מותאם אישית ' ובחרו 10 עבור מספר תחל כי המערכת צריכה לייצר (תוצאות כדי להחזיר) להשאיר את כל הפרמטרים האחרים, קבע כברירת מחדל.</li>
		<li>לבחור חמישה צבעי בסיס קדמי של שני צבעי יסוד הפוך שאינם חופפים. סדר תחל, לשקם עם RNAse/DNAse ללא מים כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. פרטים נוספים על פריימר כללי עיצוב עבור ה-PCR מכוסים במקום אחר16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR לזיהוי תחל פוטנציאל לשימוש הבאים 3' המירוץ הערה: כדי לקבוע את צבעי בסיס קדמי הסופי כדי להשתמש בהתגובה, יש לבדוק את צבעי בסיס מעוצב על-ידי הגדרת שילובים שונים של צבעי יסוד ואחורה עבור PCR רגיל בשכונה ה-PCR.<ol>
<li>להעביר את cDNA (2 µL) צינור PCR טריים 0.5 מ. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים µL 1 של ומהצמיגים הפוכה (מתוך פתרון תחל 10 מ מ). להפוך µL עד 12.5 על-ידי הוספת 8.5 µL של נוקלאז ללא מים. להוסיף 12.5 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR-כדי-ג'ל.</li>
		<li>השתמש PCR תרמי אופניים בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחריו 29 מחזורים של 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 ° C עבור מינימלית 1 להגדיר את המעגל הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות.</li>
		<li>לאחר PCR, להפעיל את המוצרים agarose 1% ג'ל מוכתם אתידיום ברומיד. פרטים על אלקטרופורזה מתוארים כאמור עם שינויים מספר17.<ol>
<li>להמיס 1g של agarose ב- 100 מ של טריס-אצטט (טה) מאגר בבקבוקון 250 מ. מרתיחים במיקרוגל.</li>
			<li>להשאיר להתקרר למשך 1 דקות ולהוסיף µL 7.5 של אתידיום ברומיד פתרון (המניות 10 מ"ג/מ"ל) בברדס fume. מערבבים היטב בעזרת מתערבל את הבקבוקון ויוצקים לתוך מנגנון ג'ל אופקי. יוצאים RT בשכונה fume במשך לפחות 30 דקות לאפשר את הג'ל לגבש.</li>
			<li>לכסות את הג'ל עם מאגר x TAE 1 וטען µL 10 של המוצר PCR על גבי הג'ל agarose יחד עם 3-5 µL של הסולם משקל מולקולרי הדנ א. לרוץ במהירות 175 V עבור 10 דקות לדמיין את המוצרים באמצעות imager ולאחר אם נוספת נדרשת הפרדה של מוצרים, הפעל את ג'ל למשך דקות נוספות 5-10.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבחר תחל מקוננים על 3' המירוץ
	<ol>
<li>לנתח את התוצאות של הג'ל agarose PCR לבחירת צבעי יסוד שיש להקה PCR ברורים, חזק יחיד. להשתמש את פריימר 5'-רוב (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') יחד עם הראשיים25 oligodT T7. ב ה-PCR הראשון לרוץ.</li>
		<li>בחר את פריימר מקוננת שנמצאת במורד הזרם של מן המפתח הראשון (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 "), ולהשתמש בו עם ומהצמיגים T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') במערכה השנייה של תגובות PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ייעול 3' גזע כדי למפות את 3' UTR באמצעות שני אנזימים שונים
הערה: חלה עלייה המגוון של ה-DNA polymerases המשמש PCR; לכן, רצינו לקבוע תנאים סטנדרטיים שניתן להחיל גם כאשר באמצעות אנזימים שונים עבור 3' תגובות PCR המירוץ. צבעי יסוד הפוך כל תעתיק נשמרים קבוע; השינויים היחידים הם צבעי בסיס קדמי מקוננים ספציפיים על-ידי היעד.
<ol><li>
פרוטוקול 1:3 ' המירוץ באמצעות של פולימראז דנ א שונה מ- Pyrococcus furiosus (Pfu)
	<ol>
<li>PCR הראשון<ol>
<li>1 µL של cDNA להעביר צינור PCR ולהוסיף µL 5 10 x Pfu התגובה המאגר. להוסיף 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר25 T7 oligodT, 1 µL של dNTPs (מתוך פתרון 10 מ מ).</li>
			<li>להפוך עד 49 µL הנפח הכולל על-ידי הוספת 40 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז ומערבבים היטב. הפעל את ה-PCR שימוש בפרופיל ה-PCR בטבלה1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR השני<ol>
<li>להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR ומערבבים עם µL 5 x 10 PfuII אולטרה התגובה המאגר. הוסף µL 1 של פריימר PCR מקונן השנייה, µL 1 של ומהצמיגים T7 µL 1 של dNTPs (פתרון 10 מ מ).</li>
			<li>להפוך עד 49 µL התגובה הכולל אמצעי אחסון על-ידי הוספת 39 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פרוטוקול 2:3 ' המירוץ באמצעות פולימראז DNA chimeric המורכב של תחום איגוד ה-DNA דבוקה של Pyrococcus-כמו הגהה פולימראז PCR מיקס מאסטר
	<ol>
<li>PCR הראשון<ol>
<li>העברת µL 1 של cDNA צינור ה-PCR. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר25 oligodT T7. להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים.</li>
			<li>להוסיף 25 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR ומערבבים היטב. השתמש PCR אופניים בתנאים המתוארים בטבלה מס ' 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR השני<ol>
<li>להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR. להוסיף 1 µL של השנייה תחל PCR מקוננים יחד עם µL 1 של פריימר הפוך T7.</li>
			<li>להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים. להוסיף 25 µL של 2 X מיקס מאסטר PCR. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ודא המוצר PCR השני של 3' המירוץ.
<ol><li>µL 5-10 לקחת המוצר PCR השני (כמו גם מוצר מבית בסיבוב הראשון של מותני אם התעתיק מתבטא בשפע) ולהפעיל על agarose ג'ל. להגדיר את הג'ל ולהפעיל את אלקטרופורזה כאמור תיאר (שלבים 5.2.3.1 כדי 5.2.3.3). לדמיין את התוצאות imager.</li>
</ol>8. המוצר טיהור ורצף
<ol><li>לטהר את המוצרים באמצעות PCR ג'ל PCR השני באמצעות ג'ל PCR מקטע DNA לנקות מערכת לפי הפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>לבצע סנגר רצף (לחלופין, שלח הג'ל מטוהרים רצף המתאים תחל למעבדה רצף ודוגמאות של מוצר ה-PCR). לנתח את הנתונים רצף לאחר סנגר רצף.</li>
	<li>להוריד תוכנה-ניתוח רצף (ראה טבלה של חומרים) ולייבא בקבצי המעקב לתוך התוכנה. שימוש בודדים טהור בסיס QVs (ערכי איכות) כדי להשיג את הבסיס לקרוא מידע18. הורד את chromatogram עם איכות גבוהה עקבות לצפייה. אופציונלי: המוצר מטוהרים ג'ל יכול להיות משובטת באמצעות ערכת השכפול המתאים שיבוטים מבודד שלח סנגר רצף.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+mRNA+processing:+Molecular+mechanisms+and+implications+for+health+and+disease.">3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease.</a> EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+atlas+of+polyadenylation+in+five+mammals.">A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals.</a> Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+3&#8242;+cDNA+ends+(3&#8242;-RACE).">Rapid amplification of 3&#8242; cDNA ends (3&#8242;-RACE).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Masamha, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFIm25+regulates+glutaminase+alternative+terminal+exon+definition+to+modulate+miR-23+function.">CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function.</a> RNA. 22 (6), 830-838 (2016).</li><li>Rodu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Biology+in+Medicine:+The+polymerase+chain+reaction:+the+revolution+within.">Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within.</a> Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).</li><li>Bertioli, D., White, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+cDNA+ends.">Rapid amplification of cDNA ends.</a> PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).</li><li>Freeman, L. A., Freeman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+full-length+transcripts+and+transcript+variants+using+5'+and+3'+RACE.">Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE.</a> Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).</li><li>Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+novel+CCND1/MRCK+gene+fusion+in+mantle+cell+lymphoma.">Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma.</a> J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).</li><li>Parker, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumorigenic+FGFR3-TACC3+gene+fusion+escapes+miR-99a+regulation+in+glioblastoma.">The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma.</a> J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).</li><li>Prakash, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+conjoined+genes:+Another+mechanism+for+gene+regulation+in+eukaryotes.">Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes.</a> PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).</li><li>Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+complexity+of+gene+fusions+in+cancer.">The emerging complexity of gene fusions in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>International Committee For Standardization In, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+evaluation+of+automated+blood+cell+counters.">Protocol for evaluation of automated blood cell counters.</a> Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+primer+specific+filter+metrics+for+the+assessment+of+mitochondrial+DNA+sequence+data.">Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data.</a> Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).</li><li>Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+better+probes:+Effect+of+probe+size,+mismatch+position+and+number+on+hybridization+in+DNA+oligonucleotide+microarrays.">Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays.</a> J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).</li><li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays.">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li><li>Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hairpin+structure+on+PCR+amplification+efficiency.">The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency.</a> Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).</li><li>Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-template+polymerase+chain+reaction.">Multi-template polymerase chain reaction.</a> Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nat Commun. 5, 4846 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות הופעתו של טכנולוגיות רצף מקביל מסיבית, על בסיס ג'ין-מאת-גן, 3' המירוץ נשאר עדיין השיטה הקלה ביותר וחסכוני ביותר לזהות את PAS נוקלאוטידים סמוכים ועד הזנב poly(A). הסתגלות שתוארו כאן מרחיב באמצעות 3' גזע כדי להגביר והן מפת רצפים הכוללים חלק של ORF על stop codon, את כולה 3' UTR של תמליל mRNA ANKHD1 . היתרו?...

היווצרות של הקצה 3' הוא שלב קריטי ב- mRNA ההבשלה שכוללת את המחשוף של pre-mRNA במורד הזרם של פאס ואחריו התוספת של ~ 250 untemplated adenines, אשר מרכיבים את הזנב poly(A)1,2. החלבון איגוד poly(A) (PABP) נקשר הזנב poly(A), זה מגן על התעתיק mRNA מפני השפלה, ומקלה על תרגום1.
הערכות הנוכחי מראים כי 70% של גנים אנושיים יש מסירה מרובים, ובכך עוברים פוליאדנילציה חלופיים, וכתוצאה מכך מספר 3' קצוות3. לכן, חשוב לזהות איפה הזנב poly(A) מייחסת שארית 3' UTR, כמו גם לזהות את PAS בשימוש על ידי כל תעתיק נתון. כניסתו של הדור הבא רצפי הביא זיהוי בו זמנית של 3' UTRs ואת המעבר של אלפי גנים. עלייה זו יכולת רצף דרש הפיתוח של bioinformatic אלגוריתמים לניתוח נתונים מעורבים פוליאדנילציה חלופית של הסוף 3'. עבור זיהוי דה נובו או אימות של מלון פאס, ומכאן מיפוי של 3' סוף גנים יחידניים מנתונים רצף בקנה מידה גדול, 3' המירוץ נשאר לשיטת הבחירה4,5. רצפי הכלולים במוצרי cDNA של 3' המירוץ בדרך כלל כוללים רק חלק מתוכן 3' UTR המכיל את הזנב poly(A), האתר המחשוף, מלון פאס, רצפי במעלה הזרם PAS. בניגוד PCR, הדורש שימוש של גן מסוים ואחורה תחל ועיצוב, 3' המירוץ רק דורש שני גנים ספציפיים מקוננים קדימה תחל. לפיכך, PCR דורש ידע מפורט יותר של הרצף נוקלאוטיד של אזור גדול של הגן להיות מוגבר4,6. מאז 3' המירוץ משתמשת אותו הפוך פריימר כי מטרות poly(A) זנב עבור כל התרשימים polyadenylated RNA, רק תחל קדימה צריך להיות גנים ספציפיים, לפיכך, רק הדורשים ידע של אזור הקטנה משמעותית mRNA. פעולה זו מאפשרת ההגברה של אזורים רצפים של מי אינם במלואו מאופיין4,7. זו אפשרה 3' גזע כדי לשמש לא רק כדי לקבוע את הקצה 3' של הגן, אבל גם לקבוע לאפיין אזורים גדולים במעלה הזרם של מלון פאס המהווים חלק ניכר 3' UTR. על ידי שילוב 5' המירוץ עם ששונה 3' המירוץ הכולל חלקים גדולים יותר 3' UTR ואזורים איגוף, זה אפשרי לחלוטין רצף או לשכפל התעתיק mRNA כולו מקצה 5' שלה 3' סוף8.
דוגמה של יישום זה של ששונה 3' המירוץ הוא זיהוי האחרונות רומן CCND1-MRCK פיוז'ן ג'ין תעתיק של שורות תאים לימפומה המעטפת התא, חולי סרטן. 3' UTR כללה רצף של גנים הן CCND1 והן MRCK , היה הסרבן miRNA תקנה9. שני מקוננים CCND1 ספציפי לפנים תחל היו משלימים באזור הסמוך מיידי של הזרם של codon להפסיק CCND1 . למרות transcriptome כל רצף יחד עם כלים bioinformatic ספציפי יכול לשמש כדי לזהות גנים fusions בתוך 3' UTR10, מעבדות רבות ייתכן שיחסרו את המשאבים הכספיים או מומחיות bioinformatic לעשות שימוש בטכנולוגיה זו. ומכאן, 3' המירוץ הוא חלופה עבור דה נובו זיהוי ואימות של פיוז'ן הרומן גנים מעורבים של 3' UTR. בהתחשב בכך דרסטי להגדיל את מספר גנים פיוז'ן שדווחה וכן לקרוא דרך תעתיקים, 3' המירוץ הפך להיות כלי רב עוצמה באפיון ג'ין-רצפים-11,-12. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכי רצפים שונים בטווח 3' UTR, כמו גם את אורך 3' UTR יכול להשפיע mRNA התעתיק יציבות, לוקליזציה, translatability, הפונקציה13. בחלקו בשל עניין מוגבר במיפוי של transcriptome, חלה עלייה במספר polymerases דנ א שונים שפותחו לשימוש במעבדה. חשוב לקבוע מה סוגי שינויים יכולים להתבצע 3' פרוטוקול המירוץ ב כדי לנצל את הרפרטואר הזמינים של דנ א polymerases.
עבודה זו דוחות התאמה 3' גזע כדי למפות את כל 3' UTR, מלון פאס, ואתר 3' סוף המחשוף של התעתיק ANKHD1 באמצעות מקונן תחל בתוך המקטע ANKHD1 של התעתיק, שני polymerases דנ א שונים.

<table><tbody><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervical cancer cell line.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Granta-519 cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal bovine serum for cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic and antimycotic.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease Free-Water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&amp;nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&amp;nbsp; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment kit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Used for&amp;nbsp; reverse transcription of mRNA into&amp;nbsp; cDNA synthesis. Kit includes&amp;nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect size 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrophotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&amp;nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Power supply for gel electrophoresis.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&amp;nbsp; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood dedicated to PCR work.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Fume hood.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&amp;nbsp;Particle&amp;nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Particle counter. For counting cells before plating&amp;nbsp; for RNA extraction.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td></tr></tbody></table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

ההבשלה של mRNAs האיקריוטים כרוך 3' הקצה למערך, הכוללת התוספת של זנב poly(A). על מנת למפות את קצה 3' של גנים, השיטה המסורתית להתמקד יש 3' הגברה מהירה קצות cDNA (3' גזע). פרוטוקולים עבור 3' המירוץ דורשים תכנון זהיר ומבחר תחל מקוננים בתוך 3' האזור לא מתורגם (3' UTR) של הגן היעד עניין. עם זאת, עם מספר שינויים בפרוטוקול יכול לשמש כדי לכלול את כל 3' UTR רצפים בתוך מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מתן תמונה מקיפה יותר של הקשר בין של ORF את 3' UTR. זאת, בנוסף זיהוי של הסימן פוליאדנילציה (PAS), כמו גם המחשוף ואתר פוליאדנילציה שסופקו על-ידי קונבנציונלי 3' המירוץ. המורחב 3' גזע יכולים לזהות יוצא דופן 3' UTRs, כולל גנים fusions בטווח 3' UTR, ואת המידע רצף יכול לשמש כדי לחזות אתרי קישור miRNA פוטנציאליים, כמו גם AU עשיר יציב אלמנטים שעשויים להשפיע על היציבות של התעתיק.

חיפוש מקוננים פריימר לפנים:
הג'ל agarose מ איור 1 מציג שני ברורים PCR ג'ל מוצרים (מסלולים 1 ו- 2) אשר השתמש אותו קדימה פריימר אלא תחל הפוכה שונים. 3 ליין יש מוצר ה-PCR ברורים ויש פריימר ואחורה ברורים. צבעי בסיס אידיאלי לשימוש עב...

Watch this Scientific Journal Video about Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer at JoVE.com

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Research

JoVE Journal

Genetics

12.3K Views.  Butler University. שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

Video: Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Cancer Research

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Neuroscience

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biology

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Medicine

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Rapid Amplification of cDNA Ends

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3 
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research 
2Department of Cell and Tissue Biology,&#160; 
3Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA&#160; &#160;&#160;
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique that allows amplification of full-length cDNA from mRNA by extending to the 3&#8217; or 5&#8217; end, even without prior knowledge of the sequence (Frohman et al., 1988). In contrast to regular PCR, it uses only one specific PCR primer and a second non-specific primer that will indiscriminately bind to most mRNAs. Depending on whether the area to be amplified is on the 3&#8217; or 5&#8217; end of the mRNA, the second primer is chosen to bind the polyA tail (3&#8217; end) or a synthetic linker added to all transcripts (5&#8217; end). These primer combinations are known to yield &#8220;one-sided&#8221; or &#8220;anchored&#8221; PCR due to PCR amplification using the known sequence of one side- 3&#8217; or 5&#8217;(Ohara et al., 1989). The approach allows the capture of gene-specific rare mRNAs that otherwise would be hard to detect, e.g. because of their relatively low expression or unknown complete sequence (Frohman et al., 1988).
RACE is initiated with a reverse transcription step (RT) to synthetize single stranded complimentary DNA (cDNA) from mRNA. This is followed by two consecutive PCRs that amplify the cDNA fragments from a gene of interest. To perform RACE, the sequence of the gene of interest must be at least partially known, as it is needed to design the gene-specific primers (GSPs; Frohman, 1994; Liu and Gorovsky, 1993). As the second primer pair is a generic primer that will anneal to all transcripts present in the sample, the specificity of the PCR reactions is reduced. RACE is therefore ideally performed with two nested PCRs to lower the chances of amplifying non-specific transcripts (Figure 1). Depending on the direction of amplification relative to the GSP, the technique is categorized as 5&#8217; or 3&#8217; RACE (Figure 1).&#160;
3&#8217; RACE (Figure 1A) takes advantage of the poly(A) tail present in mRNAs as a generic binding site for the non-specific primer. This simplifies the technique, as one can synthetize cDNA by using oligo (dT) primers. GSPs are located in the 5&#8217; region of the transcripts. This RACE variant allows the detection of transcript variants and different 3&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5&#8217; RACE (Figure 1B), GSPs are located in the 3&#8217; region of the gene. To be able to use a non-specific primer that binds to all transcripts, an adapter that serves as generic primer binding site is attached to the 5&#8217; RNA ends. To attach the adapter to the mRNA, the 5&#8217; cap that protects mRNAs against exonucleases and promotes translation must be removed (Bird et al., 2016). Opposed to 3&#8217; RACE, 5&#8217; RACE helps finding differential 5&#8217; splice variants and alternative 5&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007b).
Here we will perform 3&#8217; RACE to identify and isolate different transcript variants using the known 5&#8217; sequence (Figure 2A) encoded by the Drosophila dSmad2 (Smox) gene. dSmad2, a fly Smad protein, is an important transducer of Activin-&#946; signaling, a pathway of the TGF-&#946; superfamily. dSmad2 regulates multiple cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis and differentiation (Upadhyay et al., 2017). As differentially spliced transcripts of dSmad2 may have different functions in the adult fly, a first step in exploring these potential functions is to assess all transcript variants of dSmad2 at this developmental stage.

הגברה מהירה של קצות cDNA

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
...