אנו מודים ק' גיל לניהול מעבדה, תמיכה טכנית, ג'יי הוקינס, הצוות של נבחרת מכונים לבריאות (NIH) בניית מתקן בעלי חיים 50 על הסיוע עם העכבר, והטיפול ר ריד, פ Baldrey לסיוע מינהלי. תודה גם Motegi ס ו מ Udey עבור שיתוף שלהם האוזן העור לנתיחה פרוטוקול, כוויות (ש ע) עזרה העריכה, חברים של המעבדה של תאי גזע וביולוגיה נוירו-וסקולרית לקבלת עזרה טכנית ודיון מתחשב. ט יאמזאקי נתמכה על ידי החברה יפן עבור NIH-KAITOKU קידום המדע (JSPS). עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחקר מגזר של הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (HL005702-11 כדי עיון)

כל הניסויים בסעיף זה בוצעו תחת אישור מן הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI) חיה אכפת לי שימוש הוועדה.
1. בגיר העכבר האוזן העור אוסף
<ol><li>המתת חסד עכברים בוגרים על ידי חשיפה פחמן דו-חמצני (CO2) בתוך תא סגור ולאחר מכן לאשר את המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. הערה: הניסוי מלווה מנחה לאומי מכונים לבריאות (NIH) עבור שיטת המתת חסד.</li>
	<li>לנתח את האוזן מבסיס ולמקם אותו 35 x 10 מ מ2 פטרי המכילות 2 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק). בקצרה לקצץ שערות עם מספריים.</li>
	<li>לקלף את העור האחורי ועור הקדמי משם בקפידה הסחוס להתערב. הערה: סחוס מייחסת העור הקדמי.</li>
	<li>להעביר את ישבנה ואת העור הקדמי בנפרד כדי בגודל 24 טוב לוח המכיל 1 מ"ל של קרח טרי 4% paraformaldehyde (PFA) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לכל טוב. לרדד את העור האחורי ו הקדמי של ארבעה אחוזים מחברים.</li>
	<li>לתקן את העור האחורי ו הקדמי עם סחוס ב 4 ° C עבור 1 h.</li>
	<li>לשטוף את העור האחורי ו הקדמי 3 פעמים במשך 5 דקות ב- 1 מ"ל של PBS עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את העור האחורי ו הקדמי עם הסחוס התחתון של 35 x 10 מ מ2 פטרי. חתוך את אזור הבסיס, אשר הוא מקופל יש שומן ואת רקמות החיבור. לקלף את הסחוס של העור הקדמי באמצעות מלקחיים מעוקל בסדר.</li>
	<li>הסר בזהירות את השערות, רקמות adipose ואת רקמות החיבור מהחלק הפנימי של העור האחורי בעזרת פינצטה מעוקל משובחים. לשמור על עור רטוב עם PBS.</li>
</ol>2. כולה-הר נוגדן של העכבר האוזן העור
הערה: כל הניסויים בסעיפים הבאים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות מעבדה NIH.
<ol><li>הכנת המאגר חסימה. מסנן חום 10% לא פעיל עז סרום (HIGS) מדולל ב- PBS עם טריטון 0.2% מאגר חסימה X-100 (TX-100), או 10% חמור סרום (DS) מדולל ב- PBS עם 0.2% מאגר חסימה TX-100, באמצעות יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר.</li>
	<li>להעביר את הצד האחורי, העור הקדמי כדי בגודל 24 צלחת טוב המכיל 1 מ"ל של 10% HIGS מאגר חסימה או מאגר חסימה של DS 10% לכל טוב. דגירה על העור למשך 30 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להכין את הפתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול הנוגדנים הראשי (טבלה של חומרים) במאגר חסימה (או 10% HIGS או 10% DS). הערה: כל-mout immunohistochemical ניתוח של האוזן למבוגרים עור עם נוגדנים לכיתה ספציפית נוירון סמן פאן עצבית השלישי β-טובולין (Tuj1, ארנב polyclonal IgG או בעכבר monocloncal IgG2a, דילול שבערך על הריכוז הסופי של 2 µg/mL). תאי אנדותל-פאן סמן טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה 1 (PECAM-1, אוגר monoclonal איג, 1:300 דילול-הריכוז הסופי של 3.3 µg/mL), מעטפת המיאלין סמן המיאלין הבסיסי חלבון (MBP, ארנב polyclonal איג, 1:200 דילול ב הריכוז הסופי של 5 µg/mL), סמן דלקתיות התאים מיאלואידית CD11b (עכברוש IgG2b monoclonal, 1:50 דילול-הריכוז הסופי של 20 µg/mL) הוצג באיור 1 ו- 2 איור. העור, נדגרה עם נוגדנים Cy3 מצומדת על השריר החלק בכלי הדם תא סמן α שריר חלק אקטין (αSMA) יחד עם נוגדנים משניים (2.6). הנוגדנים הראשית נבדקו על-ידי עצמנו נרשמו בטבלה שלחומרים. יכול להיות מעורב מספר נוגדנים העיקרי נגזר מינים שונים בו זמנית.</li>
	<li>להעביר את עור אחורי, קדמי באר חדשה המכילה 150 µL של הפתרון העיקרי נוגדנים. דגירה העור תוך ערבוב עדין על מערבל ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת, להעביר את עור אחורי, קדמי בארות חדשות בצלחת טוב 24 או תשאף המאגר חסימה המכיל נוגדנים העיקרי. להוסיף 1 מ"ל או 2% HIGS מדולל ב- PBS עם מאגר כביסה TX-100 0.2% או 2% DS מדולל ב- PBS עם מאגר כביסה TX-100 0.2%. לשטוף את העור עם שינויים 3 המאגר כביסה בכל 15 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להכין את הפתרון נוגדנים משניים (טבלה של חומרים). לדלל נוגדנים משניים במאגר חסימה (או 10% HIGS או 10% DS) ומסנן המאגר חסימה המכיל נוגדנים משניים דרך 0.22 מיקרומטר polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנה מזרק פילטר מחובר מזרק 1 מ"ל. הערה: אלקסה 488 או מצומדת 633 עז ארנב אנטי איג (H + L) או עכבר IgG2a עבור Tuj1, אוגר נגד עז מצומדת אלקסה 647 IgG (H + L) אנטי-ארנב PECAM-1, 488 אלקסה מצומדת עז IgG (H + L) עבור MBP, ושימשו עכברוש מצומדת אלקסה 594 IgG (H + L) עבור CD11b עם דילול 1:250-הריכוז הסופי של 8 µg/mL. העור, נדגרה עם נוגדנים αSMA מצומדת Cy3 (דילול שבערך על הריכוז הסופי של 2-3 µg/mL) בשילוב עם נוגדנים משניים אלה.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון ב 13,000 g x 10 דקות להסיר חלקיקים צבורים של נוגדנים משניים מתוך המאגר חסימה. הערה: שונה פלורסנט מצומדת משני נוגדנים נגזר מינים שונים יכול להיות מעורב בו זמנית.</li>
	<li>העבר את העור האחורי ו הקדמי טוב המכיל 150 µL של הפתרון נוגדנים משניים. לעטוף את הצלחת היטב 24 בנייר אלומיניום כדי למנוע אור דגירה את העור h 1 עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את עור אחורי, קדמי בארות חדשות בצלחת טוב 24 או תשאף הפתרון נוגדנים משניים על-ידי pipet לחלוטין. להוסיף 1 מ"ל של מאגר כביסה HIGS 2% או 2% DS כביסה מאגר.</li>
	<li>לעטוף את הצלחת היטב 24 בנייר אלומיניום ולשטוף בשינויים 3 המאגר כביסה בכל 15 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>3. הרכבה את העור האוזן בשקופית
<ol><li>מקם את העור על החלק התחתון של 35 x 10 מ מ2 פטרי. הסר בזהירות את שערות רקמות adipose, רקמות החיבור, dusts, הסיבים מהחלק הפנימי של העור בעזרת מלקחיים מעוקל בסדר תחת stereomicroscope עם תאורה נמוכה כדי למזער תמונה מקיפה הלבנה. לשמור על עור רטוב עם PBS.</li>
	<li>להעביר את העור שקופיות מיקרוסקופ דבק באמצעות מלקחיים. מקם את העור האחורי ו הקדמי עם הפנימי כלפי מעלה בשקופית. לשטח העור בעזרת מלקחיים.</li>
	<li>הר העור במדיום הרכבה לדעוך אנטי נוזלית כדי להימנע photobleaching ולשמר אותות פלואורסצנט. ודא כי אין בועות אוויר הם בערך בהעור.</li>
	<li>מכסה עם coverslip על הדגימות העור בזהירות, לאחסן השקופיות לדוגמה את העור הנטען הלילה חשוך בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר את שהתקשורת הרכבה לקבל המשרד. לסגור את coverslip אל השקופית עם לק ואחסן אותו ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>4. מיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>כוונן המתאים לייזרים של fluorophores. מיקרוסקופ קונפוקלי עם שלושה מקורות לייזר (ארגון 488 ננומטר, DPSS 561 ננומטר, הנה 633 ננומטר) משמש בניסוי זה.</li>
	<li>השתמש בכלי הסריקה רציפים, אשר בו זמנית מרגש דגימות שהוכתמו שלוש פעמים, כדי למנוע ולהפחית בחפיפה. הערה: תמונות תועבר באופן רציף באמצעות מצב סריקה רציפים.</li>
	<li>תמונה תחת מטרה X 10. השתמש בכלי הסריקה אריח כדי ללכוד את העור כל אוזן. הגדר Z-מחסנית וודא כי z-המיקום מכסה את כל עובי העור האוזן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis.">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li><li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature:+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo.">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature.">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li><li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons:+looking+for+innervation+in+all+the+right+places.">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin.">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749 (2014).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Whole+Mount:+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick,+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin.">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen.">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li><li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atopic+dermatitis.">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li><li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoriasis:+what+we+have+learned+from+mouse+models.">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li><li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+challenges+of+chronic+wounds:+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity.">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li><li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models.">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את כולה-הר immunonohistochemical הדמיה של האוזן למבוגרים עור לניתוח של המבנים הנוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון. אנו מאמינים שבשיטה זו יש יתרונות רבים ניסיוני לחוקרים ללמוד מורפוגנזה מסעף ו את המתבנת של העצבים וכלי הדם, כמו גם תלת מימדי הפצה של רכיבי העור כולל תאים חיסוניים ושיער זקיק...

העור מורכב משלוש שכבות: אפידרמיס, דרמיס ובהיפודרמיס. זה שימש כמערכת מודל לחקר תאי גזע תחזוקה, בידול, מורפוגנזה פיתוח וכן התחדשות, tumorigenesis, וכן דלקת למבוגרים. העור הוא בעושר vascularized, innervated כך ההתפתחות של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת כלי הדם היא מתואמת היטב.
בעבר הראו טכניקת דימות של העור מתחלקים כולה-הר עם תיוג מרובים ללמוד העצבים ההיקפיים שלמים וכלי הדם כולל את מרכיבי התא1,2,3, 4: אקסונים סנסוריים אקסונים סימפטי, שוואן תאי העצבים, תאי אנדותל, pericytes, תאי השריר החלק בכלי הדם (VSMCs) בכלי הדם. במהלך האנגיוגנזה, רשת נימי הראשי עובר שיפוץ כלי הדם אינטנסיבית ומפתחת היררכי לרשת מסתעפים כלי הדם. פיתוח הדרמיס/ובהיפודרמיס, העורקים הסניף לצד העצבים החישה היקפיים וורידים מכן יוצרים הסמוכים העורקים. אחרי היררכי לרשת כלי הדם יהיה מכוסה היטב עם VSMCs, העצבים הסימפתטית להאריך לאורך, innervate כלי דם גדולים בקוטר1,5,6. למרות החשיבות של האגודה קרוב בין מערכות עצבים וכלי פיתוח, שאלה גדולה כבר להתייחס מה יקרה הרשתות נוירו-וסקולרית במצבים פתולוגיים שונים אצל מבוגרים. דימות ברזולוציה תלת מימדי יש צורך להעריך בפתוגנזה, מורפוגנזה מסעף לזיהוי אנטומית ו המתבנת.
מורפוגנזה עצביים ואת כלי הדם בעור עכבר מבוגרים בדרך כלל ניתוח על ידי רקמת סעיף מכתים. מחקרים אחרים השתמשו כולה-הר הדמיה של העור כדי להמחיש את העצבים וכלי הדם, בנוסף זקיקי שיער, בלוטות החלב, arrector pili השרירים7,8,9. עם זאת, עובי העור למבוגרים הפכה אותו קשה לנתח את העור מעל כל העומק שלה.
במחקר הנוכחי, פיתחנו הרומן דימות כולה-הר ברזולוציה של האוזן למבוגרים עור כדי להתגבר על האתגרים הללו. האוזן העור הוא נגיש עבור ניתוח והדמיה כולה-הר עוקבות של העור מעל כל העומק שלה. לכן שיטה פשוטה מאוד לשחזור שניתן להחיל כדי להשוות בין ארכיטקטורה תלת מימדי של מערכות היקפיות לחוץ ואת כלי הדם של העור, עם מדידות כימות מקיף. להדגים היישור של העצבים ההיקפיים חושית ואוהד עם כלי דם גדולים בקוטר נשמרת בעור מבוגר. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג באופן חזותי מורפוגנזה מסעף, את המתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם את התפלגות תא החיסון ברמה התאית במודלים של העכבר מבוגרים בתנאים שונים כגון דלקת ו התחדשות.

<table><tbody><tr><td>10 x Phosphate Buffered Saline</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Curved fine tweezers</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>Syringe filter Unit 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Anti-fade mounting medium</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>For sealing</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;SMA antibody conjugated with cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Class III &amp;#946;-tubulin (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP antibody</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Peripherin antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, immune cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Chicken polyclonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;-gal antibody</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Rabbit polyclonal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Rat polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250</td></tr></tbody></table>

whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של עור האוזן למבוגרים כולה-הר של הדמיה טכניקה ללמוד מקיף תלת מימדי מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית ו המתבנת, וכן חלוקת תא החיסון ברמה התאית. הניתוח של היקפי עצבים, כלי דם מבנים אנטומיים של רקמות בוגרות מספק כמה תובנות להבנת חיווט נוירו-וסקולרית פונקציונלי והתנוונות נוירו-וסקולרית במצבים פתולוגיים כגון ריפוי הפצע. כמערכת מודל מאוד אינפורמטיבי, אנחנו התמקדו המחקרים שלנו בעור האוזן למבוגרים, אשר נגיש עבור ניתוח. פרוטוקול לשחזור ופשוט שלנו מספק תיאור מדויק של הרכיבים הסלולר של העור כולו, כגון העצבים ההיקפיים (אקסונים סנסוריים, סימפטי אקסונים ו תאי שוואן), כלי הדם (תאי אנדותל ותאים השריר החלק בכלי הדם ), ותאים דלקתיים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יסלול את הדרך לחקור ליקויים מורפולוגי של העצבים וכלי הדם, כמו גם הדלקת בעור האוזן למבוגרים תחת מצבים פתולוגיים שונים.

עור אחורי האוזן העכבר למבוגרים (איור 1 א') והעור באוזן קדמית (איור 1B) היו immunostained עם נוגדנים αSMA (אדום), Tuj1 (ירוק), ו- PECAM-1 (כחול). העור האחורי היה immunostained ללמוד נוירו-החיסון הפצה באמצעות נוגדנים CD11b (אדום) ו MBP (ירוק), יחד עם Tuj1 (כחול) (איור ...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution at JoVE.com

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

כאן נתאר שיטת הדמיה כולה-הר ברזולוציה גבוהה בעור האוזן והעכבר כולו למבוגרים, אשר מאפשרת לנו לדמיין מורפוגנזה מסעף והמתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם התפלגות תא החיסון.

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

whole-mount-confocal-microscopy-for-adult-ear-skin-model-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.1K Views.  National Institutes of Health. כאן נתאר שיטת הדמיה כולה-הר ברזולוציה גבוהה בעור האוזן והעכבר כולו למבוגרים, אשר מאפשרת לנו לדמיין מורפוגנזה מסעף והמתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם התפלגות תא החיסון.

Video: Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Neuroscience

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Immunology and Infection

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biology

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

פגיעה איסכמיה reperfusion התרמה בעור האוזן עכבר Intravital multiphoton הדמיה של המערכת החיסונית

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Medicine

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Stria Vascularis Microdissection עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

מחבר זרקור: דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST