עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי R & D תוכנית של בפרובינצית גואנג-דונג (סין) (2016A050503028).

כל ההליכים לרבות איסוף דם אנושי אושרו על ידי ועדת האתיקה סון יאט-סן אוניברסיטת.
1. GPC3-S-Fab דיזיין
<ol><li>עיצוב GPC3-S-Fab על-ידי קישור של Fab של אנטי-GPC3 (humanized GC3313) עם אנטי-CD16 VHH14 (איור 1).</li>
	<li>לסנתז, לשכפל את VH-CH1-CD16-VHH ו- VL-CL לתוך הווקטורים pET26b ו- pET21a כמו שדווחה בעבר12.</li>
</ol>2. שינוי, תרבות
<ol><li>להוסיף 100 ננוגרם של pET26b המכילה VH-CH1-CD16 (איור 1 א') ל- 100 ננוגרם של pET21a המכילה VL-קלרנית (איור 1 א') לתוך µL 100 של BL21 המוסמכת תאים (DE3). מערבבים היטב ו דגירה על קרח במשך 30 דקות Incubate באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45-90 s, העברה, דגירה על קרח למשך 3-5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 500 µL בינוני מרק (ליברות) lysogeny לתוך צינור המכילים BL21 (DE3) תאים, ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 150 סל ד במשך 45-60 דק 100 להפיץ את µL של BL21 (DE3) תאים על LB-אגר צלחות המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 של אמפיצילין , ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.<ol>
<li>להכין lysogeny מרק (LB) בינוני: טריפטון wt/vol 1%, תמצית שמרים wt/כרך 0.5%, 1% wt/כרך NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחסן תאים שמושבה בודדת לתוך מ ל מרק סופר (SB) בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין, והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד, בין לילה. לאחר מכן, לחסן 1 מ"ל של תרבות לתוך 100 מ של SB בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד במשך 4 שעות. לאחר מכן, להעביר 10 מ"ל של התרבות 1 ליטר של SB בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד.<ol>
<li>להכין מרק סופר בינוני: 3.2% wt/כרך טריפטון, תמצית שמרים 2% wt/vol, 0.5% wt/כרך NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר ה OD600 מגיע 0.6 - 0.8, להוסיף איזופרופיל-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ריכוז סופי של 0.2 מ מ. תרבות-16 ° C, סל ד 180 במשך 36-48 שעות עבור ביטוי periplasmic.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab טיהור Periplasmic
<ol><li>שבר periplasmic הכנה<ol>
<li>איסוף תאים על ידי צריך שתוציאו ב g 4,000 x, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, למחוק את המדיום, שוקל את התאים.</li>
		<li>Resuspend התאים ביסודיות 4 מ"ל של פתרון סוכרוז כקרח (20 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 25% (wt/כרך) סוכרוז ו- 1 מ מ EDTA) לגרם של תאים, דגירה על קרח למשך 15 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g 8,500 x (צנטריפוגה מלמעלה בטבלה, זווית קבועה רוטור), 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות להסיר את תגובת שיקוע (השבר סוכרוז), שמור את זה על קרח.</li>
		<li>Resuspend כדורי תערובת של קרח 5 מ"מ של MgCl2 ו- 1 מ מ PMSF (4 מ"ל לכל התאים גרם). הוסף µL 40 של המניה ליזוזים (15 מ"ג/מ"ל) לגרם, דגירה על קרח למשך 30 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g 8,500 x (מלמעלה בטבלה צנטריפוגה, קבוע זווית רוטור), 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות להעביר תגובת שיקוע (השבר periplasmic) ולשמור אותו בקרח.</li>
		<li>לשלב סוכרוז שבר על שבר periplasmic, צנטריפוגה ב g 30,000 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להסיר את תגובת שיקוע, שמור את זה 50 מ ל צינור חרוט על קרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיהור זיקה Ni-נ<ol>
<li>Resuspend 1 מ"ל של ני-נ agarose על ידי ערבוב ביסודיות כדי להשיג השעיה הומוגנית, להסיר 1 מ"ל של ני-נ agarose על צינור חרוטי טריים 15 מ"ל ולהוסיף 10 טור אמצעי אחסון (CV) equilibration מאגר (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 1 מ' של NaCl) כדי equilibrate.</li>
		<li>צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות והסר את תגובת שיקוע בקפידה. לאחר מכן, להוסיף את agarose Ni-נ לתוך הצינור 50 מ ל המכיל סוכרוז שבר על שבר periplasmic. רוק ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
		<li>Centrifuge את התערובת ב 400 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק הסר בזהירות את תגובת שיקוע אחר צניעותו כקרח טריים כמו השבר לא מאוגד. להעביר את agarose Ni-נ לעמודה הכבידה.</li>
		<li>להוסיף 10 שטיפה מאגר קורות חיים (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 1 מ' של NaCl; 20 מ מ, מ מ 30 או 40 מ מ של imidazole) טור ו לאסוף elute כמו השבר כביסה. הערה: יש להוסיף הפתרונות הבאים לפי סדר של ריכוז imidazole.</li>
		<li>להוסיף 3 קורות חיים • תנאי מאגר (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 300 מ מ NaCl; 100 מ מ, 200 מ מ, מ מ 300 או 400 מ מ imidazole) אל העמודה ולאסוף את elute כמו שבר • תנאי 1, 2, 3 ו- 4. הערה: יש להוסיף הפתרונות הבאים לפי סדר של ריכוז imidazole.</li>
		<li>דיאליזה שברים eluted ב 2 ל' ל- PBS (137 מ מ של NaCl, 2.7 מ"מ של אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, 2 מ מ של2פו ח'4, pH 7.4) באמצעות דיאליזה אבובים (12.4 kDa) ב 4 ° C עבור ה 2 לבדוק הנוכחות של GPC3-S-Fab ב-12 אחוז מרחביות-דף ולאחר מכן לפי Coomassie כחול מכתים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CH1 אג זיקה טיהור<ol>
<li>העברת 1 מ"ל של IgG-CH1 זיקה שרף לתוך צינור חרוטי 50 מ ל, לשטוף את החרוזים עם PBS קודם. לאחר מכן, הוסף את הפתרון dialyzed המכיל GPC3-S-Fab לאחר שלב 3.2.6. רוק ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע עוד טרי צניעותו קר כקרח, ולהעביר השרף עמודה הכבידה.</li>
		<li>להוסיף 10 קורות חיים של כביסה מאגר (PBS) לעמודה, ולאסוף • על תנאי כמו השבר לשטוף.</li>
		<li>הכינו את צינורות איסוף על-ידי הוספת 1 מ' של טריס pH 9.0 (0.1 מ"ל לכל מיליליטר כל שבר eluted). Elute עם קורות חיים 3 • תנאי מאגר (0.1 M של גליצין-HCl, pH 2.7), ולאסוף את השבר eluted; חזור על 3 פעמים.</li>
		<li>דיאליזה שברים eluted ב 2 ל' ל- PBS באמצעות דיאליזה אבובים (12.4 kDa) ב 4 ° C עבור ה 2 חוזר פעמיים.</li>
		<li>לקבוע ריכוז החלבון על ידי ultramicrospectrophotometer (הכחדה טוחנת מקדם: 91105. א 1280 = 0.69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מרחביות-דף וניתוח סופג-ווסטרן
<ol><li>לקחת את µL 10 המדגם 5 x מרחביות טעינת מאגר ומערבבים היטב. מרתיחים את התערובת חלבון ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.<ol>
<li>להכין 5 x מרחביות טעינת מאגר: 250 מ מ של טריס-HCl, pH 6.8, 10% wt/כרך מרחביות, 0.5% wt/כרך bromophenol כחול, גליצרול vol/כרך 50%, 5% vol/כרך בטא-mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן של ג'ל מרחביות-דף עם טעינת ג'ל (5%), ההפרדה ג'ל (12%) כפי שתואר לעיל26,27,28.</li>
	<li>טען µL 10 של תערובת חלבונים מבושלים, סמן חלבון, והשתמש מרחביות-הדף.</li>
	<li>כתם הג'ל ע י ניעור כעשרים דקות עם פתרון כחול מבריק Coomassie, ולאחר מכן לבצע destaining.</li>
	<li>עבור סופג המערבי, לאחר העברת קרום PVDF, לחסום את הקרום עם TBST (20 מ מ של טריס-HCl, 150 מ מ של NaCl, 0.1% vol/כרך Tween 20) + 5% wt/vol. וקפה לשעה בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול.</li>
	<li>דגירה הקרום עם נוגדנים הראשי (אנטי-שלו או אנטי-דגל) מדולל 1:2,000 TBST + 5% חלב רזה לשעה.</li>
	<li>לשטוף עם TBST למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וחזור על 3 פעמים.</li>
	<li>דגירה הקרום של נוגדנים משניים (מקושר HRP העכבר אנטי Fc נוגדנים) מדולל 1:2,000 TBST + 5% חלב רזה לשעה.</li>
	<li>לשטוף עם TBST למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וחזור על 3 פעמים.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של מצע HPR לכל הסרט, ולפתח תמונות.</li>
</ol>5. ג'ל סינון ניתוח
<ol><li>להשתמש בעמודה הבאה: עמודה נפח של 24 mL; Equilibration מאגר של PBS pH 7.4; קצב הזרימה של 0.5 mL/min בחדר ממוזג; נפח דגימה של 200 µL.</li>
	<li>השתמש ריכוז ונפח חלבון הבאים: 500 µL של 1.2 מ"ג/מ"ל GPC3-S-Fab. צנטריפוגה ב g 20,000 x למשך 30 דקות, ולקחת µL 200 כדי לטעון.</li>
	<li>החלבון הסמן ריכוז ונפח, סעו µL 100 של ציטוכרום C (2 מ"ג/מ"ל, 12.4 kDa), 140 µL של אנהידראז (3 מ"ג/מ"ל, 29 kDa), 140 µL של אלבומין (10 מ"ג/מ"ל, 66 kDa) µL 200 של אלכוהול דהידרוגנאז (5 מ"ג/מ"ל, 150 kDa) לתוך שפופרת אחת. צנטריפוגה ב g 20,000 x למשך 30 דקות, ולקחת µL 200 כדי לטעון.</li>
	<li>לפני כל הפעלה, לשטוף עם פחות 2 קורות חיים של מים מזוקקים בספיקה של 0.5 mL/min.</li>
	<li>Equilibrate את העמודה עם פחות 2 קורות חיים equilibration מאגר (PBS, pH 7.4) בספיקה של 0.5 mL/min.</li>
	<li>באופן אוטומטי להזריק את הדגימה ב- 0.5 מ ל/דקה כדי לטעון את הדגימה.</li>
	<li>Elute עם equilibration מאגר ב 0.5 mL/min ולגלות -280, 215 ננומטר.</li>
</ol>6. לזרום Cytometry ניתוח
<ol><li>תרבות של HepG2 (GPC3 חיובי), Hep3B (GPC3 חיובי), Huh7 (GPC3 חיובי), ותאים MHCC - 97H (GPC3 שלילי) במנות פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ המכיל DMEM בינוני עם 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>תרבות צ'ו (GPC3 שלילי) תאים ותאים צ'ו/GPC3 מסתירים את באורך מלא האנושי GPC3 cDNA (GPC3 חיובי) במנות פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ המכיל RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>תרבות NK92/CD16 מחסה באורך מלא של האדם CD16 cDNA (CD16 חיובי) ב 25 ס מ2 בקבוק המכיל RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>כאשר התאים confluent 70-90%, ביטול המדיום ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל ל- PBS. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות (או עד התאים נתחיל לנתק מעל פני השטח). להוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול מלאה כדי לנטרל את טריפסין והשהה מחדש את התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>לספור את מספרי הטלפון הנייד באמצעות hemocytometer נויבאואר ולגלות את הכדאיות תא על-ידי Trypan Blue.</li>
	<li>לאסוף 3 x 106 תאים עבור כל קו תא. להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר פעמיים.</li>
	<li>הוסף mL 0.3 של PBS + 0.2% BSA להשעות מחדש את התאים, להעביר כל שפופרת סיבוב המדרגה פוליסטירן מ ל 100 µL (כ 1 מיליון). הערה: נא ודא כי בכל הצעדים מכאן הצינורות צריכים להישמר קר על קרח. כאשר הנוגדן הוא איגוד אנטיגן פני שטח התא, המתחם יתחילו להפנים. על ידי שמירה זה קר, התהליך הוא האט באופן משמעותי.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של נוגדנים הראשי (GPC3-S-Fab או IgG1 אנושי, ריכוז סופי 5 µg/mL) כל שפופרת, דגירה על קרח לשעה.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA כדי לשטוף, צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר שלוש פעמים.</li>
	<li>להשעות מחדש ב- 100 µL של PBS + 0.2% BSA, ואז להוסיף 0.5 µL של נוגדנים משניים (אנטי-האדם ריכוז IgG(H+L)-488, גמר 10 µg/mL), דגירה על קרח על ה 1 הערה: מהשלב הזה, בבקשה להשאיר את התאים מן האור.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA כדי לשטוף, צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר שלוש פעמים.</li>
	<li>לנתח את התאים על ידי זרימת cytometer על פי הנוהל המקובל29. רוכשים תאים עם 488 ננומטר לייזר עבור עירור.</li>
</ol>7. מבחני ציטוטוקסיות
<ol><li>להכין תאים סרטניים.<ol>
<li>תרבות HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H וצ'ו תא קווים כמתואר בצעדים 6.1-6.5.</li>
		<li>לדלל לתאים 0.5 × 105/mL, לוחית רישוי תאים µL 100 (5,000 תאים לכל טוב) על צלחות 96-ובכן. תרבות 6-8 h כדי לאפשר את התאים לצרף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את תאי תאי דם היקפיים אנושי (PBMCs).<ol>
<li>לדלל דם טרי מוכן עם אמצעי אחסון שווה ל- PBS צינור חרוטי 50 מ. לדוגמה, לדלל 10 מ"ל של דם עם 10 מ"ל ל- PBS.</li>
		<li>לקחת 15 מ"ל של לימפוציטים הפרדה בינוני לתוך צינור חרוטי מ"ל. להעביר את הדם מדולל על המדיום ההפרדה לימפוציט לאורך הצד צינור לאט. הערה: לשמור את הצינור אנכי. אינם מפרים את פני השטח של המדיום ההפרדה לימפוציטים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 400 x g למשך 35 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם חופש.</li>
		<li>אט-אט להסיר את השכבה העליונה פלזמה, ולקחת את שכבת דם לבן המכיל PBMCs-הממשק בינונית של ההפרדה פלזמה-לימפוציטים.</li>
		<li>לדלל את PBMCs עם נפח כפול של PBS + 2% FBS. צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות.</li>
		<li>לשטוף את התאים פעמיים עם PBS + 2% FBS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דק ספירת המספרים תא כפי שמתואר בשלב 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את תאי NK.<ol>
<li>המתלה PBMCs-ריכוז של 5 x 107 תאים למ"ל PBS + 2% FBS, ובמקום להכין אותם פנימה צינור עגול-התחתון פוליסטירן מ ל.</li>
		<li>להוסיף לתא NK האנושי העשרה קוקטייל µL 50/mL של תאים. מערבבים היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		<li>Resuspend החלקיקים המגנטיים מן התא NK העשרה קיט, לערבב היטב כדי להבטיח שהם מושעים בצורה אחידה על-ידי pipetting למעלה ולמטה נמרצות יותר מ 5 פעמים. להעביר את החלקיקים מגנטי resuspended-100 µL/mL התליה תא. מערבבים היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>להביא התליה תא עד הנפח הכולל של 2.5 מ על-ידי הוספת PBS + 2% FBS. לערבב את התאים בצינור על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים. מקם את הצינור (ללא כובע) לתוך המגנט. תן beads מגנטי את תירגע 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את המגנט. בתנועה רציפה אחת, היפוך ברכבת התחתית, לשפוך את התליה תא מועשר לתוך צינור חדש.</li>
		<li>ספירת המספרים תא כפי שמתואר בשלב 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להגדיר את התגובה ציטוטוקסיות.<ol>
<li>לדלל תאי NK כדי 5 × 105 תאים למ"ל תוך שימוש באמצעי תרבות המתאים. להוסיף 100 µL של השעיה התא NK לתאי הגידול מצופה על צלחת 96-ובכן.</li>
		<li>להוסיף 10 µL של GPC3-S-Fab בריכוזים שונים, עם המינון הגבוה ביותר-ריכוז סופי של 30 µg/mL, דילול 3-fold, נקודה 9 (שלושה משכפל).</li>
		<li>דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ב 72 h.</li>
		<li>לאחר 72 h של דגירה, להסיר את המדיום, להוסיף 100 µL בינוני DMEM המכיל 10 µL של ריאגנט CCK8 כדי מכל קידוח ב 96-ובכן צלחות ואני ואז דגירה ב 37 º C.</li>
		<li>לקרוא את הצלחת ב 450 nm ב 1, 2, 3 ו- 4 שעות לאחר הוספת הכימית CCK8.</li>
		<li>לנתח את הנתונים. לחשב את שיעור ההישרדות (OD450 GPC3-S-Fab + אפקטור + גידול - OD450 בינוני) / (OD450 הגידול - OD450 בינוני) × 100% ו (OD450 GPC3-S-Fab + גידול - OD450 בינוני) / (OD450 הגידול - OD450 בינוני) × 100%. התאים אפקטור הם תאי NK.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs.">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).</li><li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment.">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li><li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+therapeutics,+antibody+engineering,+and+the+merits+of+protein+stability.">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li><li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+bispecific+antibodies:+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles.">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li><li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+interactions+in+the+Fab+fragment:+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability.">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li><li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors.">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications.">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).</li><li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention,+Detection,+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases.">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bispecific+antibody,+S-Fab,+induces+potent+cancer+cell+killing.">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells.">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32 (2016).</li><li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells.">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li><li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+(CD16)+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells.">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li><li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+single-domain+antibodies+in+bacterial+systems.">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li><li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+expression+of+antibodies.">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li><li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies.">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li><li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypicans:+proteoglycans+with+a+surprise.">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li><li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic,+preneoplastic,+and+neoplastic+tissues:+a+tissue+microarray+analysis+of+4,387+tissue+samples.">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li><li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis.">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders.">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li><li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma:+biological+significance+and+temporospatial+distribution.">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li><li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+(FcgammaRIII)+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice.">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li><li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans.">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CD16a,+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells,+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells.">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes.">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma.">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

במחקר זה, אנו מציגים אסטרטגיה לבנות פורמט חדש של bsAbs, GPC3-S-Fab, אשר יכול לגייס תאי NK מיקוד תאי גידול חיובי GPC3. S-Fab מבוסס על Fab טבעי תבנית על-ידי הוספת11,VHH anti-CD1612. לעומת אזור Fc המכיל bsAbs, GPC3-S-Fab יכול בקלות להיות מיוצר את periplasm של חיידקים בקנה מידה גדול.
בא...

נוגדנים חד-שבטיים המשמשים כיום בהרחבה עבור סרטן טיפול1. בשל הגמישות של נוגדנים, בפורמטים שונים נוגדן מבוססי נחקרו באופן פעיל. לעומת נוגדנים חד-שבטיים, bsAbs יש שני מודולים איגוד אנטיגן שונים, המאפשרים להם לזהות שתי מטרות שונות בו זמנית וביעילות לעורר הגיוס של תאים חיסוניים אפקטור למטרה ולהרוג תאים סרטניים2.
תבניות bsAb רקומביננטי הנוכחי ניתן להקצות באופן כללי שתי מחלקות: bsAbs המכילים Fc ו- bsAbs ללא אזור Fc. בהשוואה לתבניות Fc המכילים בעיקר המיוצרים בתאי יונקים, bsAbs ללא אזור Fc יש היתרונות בגדלים קטנים יותר, בקלות רבה יותר מיוצרים במערכות ביטוי מיקרואורגניזם, והוא יכול לחדור רקמות הגידול ביעילות רבה יותר 3.
bsAbs ללא אזור Fc נוצרות בדרך כלל על-ידי קישור moieties איגוד בודדים, כגון שברים משתנה יחיד-שרשרת (scFvs) או פאבס3. ללא ייצוב התחומים, bsAbs מבוסס על שברי scFv לעיתים קרובות חשף יציבות תרמית, המסיסות נמוכה או הפוטנציאל מוגברת של צבירת4,5. לעומת זאת, מבוססת-חיובי bsAbs יציבים יותר בשל heterodimerization של CH1 ו- CL ב4,moiety Fab יליד6.
תחום משתנה של נוגדנים כבד שרשרת-בלבד (VHHs, המכונה גם נוגדנים מחשבים בודדת) הם הרסיס אנטיגן מחייב פעיל של נוגדנים טבעיים שרשרת כבדה7. VHHs יש את המאפיינים של זיקה גבוהה, ירידה לפרטים של IgGs המקובלת8, immunogenicity נמוך, תפוקה גבוהה חיידקי הביטוי9. לעומת Fv שברי, VHHs יש יציבות תרמית גבוהה10 לעומת Fab moieties, VHHs יש בגדלים קטנים יותר בשל היעדר CH1 ו- CL. לפיכך, S-Fab, התבנית bsAb שהושגו על-ידי קישור של Fab עם נוגדן מחשבים בודדת, VHH, היה מתוכנן ולמד אפקטים אנטי הגידול שלה,11,12.
במחקר זה, תוארה הקמת GPC3-S-Fab על-ידי קישור של Fab של hGC3313 עם VHH anti-CD16a14 . GPC3-S-Fab יכול להיות מיוצר באופן יעיל על-ידי periplasmic ביטוי Escherichia coli (e. coli). מחקרים פונקציונלי של GPC3-S-Fab הציע כי GPC3-S-Fab היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בסרטן הכבד. לפיכך, היתרונות של GPC3-S-Fab על טכניקות חלופיות בנתונים החלים על מחקרים קודמים כוללים ייצור קל טיהור, ואת bsAbs יציב יותר.
הביטוי יונקים ומערכות ביטוי prokaryotic שימשו כדי לבטא בפורמטים שונים של BsAbs. בניגוד ביטוי בתרבית של מערכות, e. coli-מערכות ביטוי חלבון מבוסס יש יתרונות רבים, כולל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה, חוסך עבודה, להקל על מניפולציות גנטיות ו- יעילות המרה גבוהה15. להבעה bsAbs e. coli, ישנן שתי אסטרטגיות בסיסיות: ביטוי ציטופלזמה, ביטוי periplasm בין ציטופלזמה החיצוני של קרום התא15. לעומת הסביבה תוך צמצום של הציטופלסמה, periplasm הוא סביבה, המקדם את הקיפול הנכון יותר חמצון, שותף ביטוי של חלבונים16. קיפול הנכון ממלא תפקיד מפתח בדור מסיסות, יציבות ותפקוד של bsAbs. לכן, נוספה pelB רצף האות N-הסופית של S-Fab לכוון הפרשת כדי periplasm e. coli17. כדי להבטיח הנכון קיפול, המסיסות, יציבות תרמית, יציבות הסתגלותי, להפחית את המורכבות ואת הגודל של נוגדן הוא לעתים קרובות מועסקים16. התבנית S-Fab מורכב Fab אחד אחד VHH, הבאה לידי ביטוי היטב ככל הנראה בגלל מבנה פשוט של גודל קטן חיידקי מערכות.
GPC3 נבחרה תבנית נוגדן bispecific זו GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) הוא חבר של המשפחה פרוטאוגליקן סולפט (HS) הפארין מעוגנת השטח תא דרך glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 הוא overexpressed ב-70% מהמקרים (HCC) קרצינומה hepatocellular, באיזה חשבון עבור הרוב המכריע של סרטן הכבד19,20,21,22. כי GPC3 מתבטאת לעיתים רחוקות רקמות רגילה, GPC3 הוצע כמטרה פוטנציאלית עבור HCC. MAbs בעכבר מרובים הופקו נגד GPC3. עם זאת, רק GC33 הציג פעילות אנטי הגידול מוגבל 22, והוא נכשל להפגין יעילות קלינית בחולים. במחקר זה, GPC3-S-Fab הוצגה היכולת לגייס תאי NK כדי להרוג תאים סרטניים GPC314.
לגייס תאי NK, שימש VHH אנטי-CD16. CD16a הוא קולטן IgG זיקה נמוכה, באה לידי ביטוי בעיקר על תאים הרוצח הטבעיים (NK), מקרופאגים, ומונוציטים ו תתי כמה סוגים של תאי T. זה מעורב נוגדנים תלויי תא cytotoxicity (ADCC) על ידי תאי NK23. תאי NK אדם יכולים להיות מסווגים לשני סוגים, CD56 - CD16 + ו CD56 + CD16-. בניגוד תאי NK CD56 + CD16−, CD56-תאי NK CD16 + יכול לשחרר רמות גבוהות יותר של perforin granzyme B, ובכך להציג cytotoxicity חזקה של24. תאים Kupffer (kcs ב), לבטא CD16a, הם המקרופאגים תושב בכבד. תאים Kupffer תפקיד חשוב בדיכוי סרטן הכבד25. לפיכך, ייתכן bsAbs מיקוד CD16a אסטרטגיה מבטיח יותר מאשר עיסוק ותאי T כנגד סרטן הכבד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Zhicheng</td>
			<td>ZWYR-D2402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Cence</td>
			<td>GL-10MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti j-26S XPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Mini-PROTEAN&#174; Tetra</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-blot apparatus</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>chemidoc tm XRS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid chromatogram</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA avant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5702R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti His-tag</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-6657-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag-tag</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human(H&#38;L)-488</td>
			<td>A11013</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA-Agarose</td>
			<td>Tribioscience</td>
			<td>TBS9202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-CH1 affinity resin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>194320005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8 kit</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15050-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard marker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MWGF200</td>
			<td>Gel filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>VWRC0487-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0655-100FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knanamycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0408-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0339-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6791-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>A110752-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>P112134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A505255-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a name="RANGE!A50">Coomassie Brilliant Blue R250</a></td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500922-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 20mm plastic dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610498-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GNHa 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCC-97H</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>SCSP-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu 72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL2408</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה ואת מחקרים פונקציונלי של נוגדן bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs יכול לזהות שתי epitopes שונות דרך שלהם שתי זרועות שונות. bsAbs נחקרו באופן פעיל בשל יכולתן לגייס תאים חיסוניים כדי להרוג תאים סרטניים ישירות. כיום, הרוב המכריע של bsAbs מיוצרים בצורה של חומרים, או כמו bsAbs המכילים Fc או נגזרות bsAb קטן יותר ללא אזור Fc. במחקר זה, GPC3-S-Fab, נוגדן bispecific מבוסס נוגדן פרגמנט (חיובי), תוכנן על-ידי קישור של Fab של נוגדן anti-GPC3 GC33 עם נוגדן anti-CD16 מחשבים בודדת. יכול להיות לידי ביטוי Escherichia coli , מטוהרת על-ידי שני זיקה chromatographies GPC3-S-Fab. GPC3-S-Fab מטוהרים ניתן לאגד, במיוחד להרוג תאים סרטניים בכבד חיובי GPC3 על-ידי גיוס תאים רוצח טבעי, רומז על פוטנציאל היישום של GPC3-S-Fab בטיפול בסרטן הכבד.

GPC3-S-Fab טיהור
GPC3-S-Fab היה טהור של e. coli על ידי טיהור זיקה שני שלבים, הראשון עם Ni-נ-agarose, ואחריו IgG-CH1 זיקה טיהור. לאחר הטיהור זיקה בשני שלבים, GPC3-S-Fab היה טהור עד הומוגניות עם שתי השרשראות קרוב 1:1 (איור 2 א). הנוכחות של polype...

Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר נוגדן bispecific GPC3-S-Fab ב Escherichia coli. GPC3-S-Fab מטוהרים יש cytotoxicity חזק נגד תאי סרטן הכבד חיובי GPC3.

פילוח GPC3 נוגדן Bispecific, GPC3-S-חיובי, עם חזק Cytotoxicity

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K Views.  Sun Yat-Sen University. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר נוגדן bispecific GPC3-S-Fab ב Escherichia coli. GPC3-S-Fab מטוהרים יש cytotoxicity חזק נגד תאי סרטן הכבד חיובי GPC3.

Video: A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes more complex, the goal of targeting mitochondria using various compounds that inflict mitochondrial damage (so-called mitocans) is becoming quite popular. Unfortunately, many existing cytotoxicity assays, such as those based on tetrazolium salts or resazurin require functional mitochondrial enzymes for their performance. The damage inflicted by compounds that target mitochondria often compromises the accuracy of these assays. Here, we describe a modified protocol based on differential staining with two fluorescent dyes, one of which is cell-permeant (Hoechst 33342) and the other of which is not (propidium iodide). The difference in staining allows living and dead cells to be discriminated. The assay is amenable to automated microscopy and image analysis, which increases throughput and reduces bias. This also allows the assay to be used in high-throughput fashion using 96-well plates, making it a viable option for drug discovery efforts, particularly when the drugs in question have some level of mitotoxicity. Importantly, results obtained by Hoechst/PI staining assay show increased consistency, both with trypan blue exclusion results and between biological replicates when the assay is compared to other methods.

The protocol describes a rapid, high-throughput, reliable, inexpensive, and unbiased assay for efficiently determining cellular viability. This assay is particularly useful when cells&#39; mitochondria have been damaged, which interferes with other assays. The assay uses automated counting of cells stained with two nuclear dyes &#8211; Hoechst 33342 and propidium iodide.

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

הטיות כימיות של נוגדן מטוהר מכוון DEC-205 עם חלבון באורך מלא למיקוד תאים דנדריטיים של עכבר במבחנה וב- In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), relying on collateral flow to the liver through the gastroduodenal artery (GDA). In the current manuscript, the technical conduct of robotic DP-CAR is outlined. The greater curve of the stomach is mobilized with care to avoid sacrificing the gastroepiploic vessels. The stomach and liver are retracted cephalad to facilitate dissection of the porta hepatis. The hepatic artery (HA) is dissected and encircled with a vessel loop. The gastroduodenal artery (GDA) is carefully preserved. The common HA is clamped and triphasic flow in the proper HA via the GDA is confirmed using intra-operative ultrasound. A retropancreatic tunnel is made over the superior mesenteric vein (SMV). The pancreas is divided with an endovascular stapler at the neck. The inferior mesenteric vein (IMV) and splenic vein are ligated. The HA is stapled proximal to the GDA. The entire specimen is retracted laterally with further dissection cephalad to expose the superior mesenteric artery (SMA). The SMA is then traced back to the aorta. The dissection continues cephalad along the aorta with the bipolar energy device used to divide the crural fibers and celiac nerve plexus. The specimen is mobilized from the patient's right to left until the origin of the celiac axis is identified and oriented towards the left. The trunk is circumferentially dissected and stapled. Additional dissection with hook cautery and the bipolar energy device fully mobilizes the pancreatic tail and spleen. The specimen is removed from the left lower quadrant extraction site and one drain is left in the resection bed. A final intra-operative ultrasound of the proper HA confirms pulsatile, triphasic flow in the artery and liver parenchyma. The stomach is inspected for evidence of ischemia. Robotic DP-CAR is safe, feasible and when used in conjunction with multi-modality therapy, offers potential for long-term survival in selected patients.

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

We present our operative approach to robot assisted distal pancreatectomy, splenectomy, and celiac axis resection (DP-CAR), demonstrating that the procedure is safe and feasible with proper planning, patient selection, and surgeon experience.

כריתת לבלב בסיוע רובוט עם כריתת ציר צליאק (DP-CAR) לסרטן הלבלב: תכנון וטכניקה כירורגית

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...