この作品は、R & D 計画の広東省 (中国) (2016A050503028) によって財政的に支えられました。

人間の血のコレクションを含むプロシージャをすべては、太陽 Yat Sen 大学倫理委員会で承認されました。
1. GPC3 S 工場デザイン戦略
<ol><li>アンチ GPC3 (ヒト GC3313) を抗 CD16 VHH14 (図 1) の工場にリンクして GPC3 S 工場を設計します。</li>
	<li>合成し、以前に報告された12として pET26b と pET21a のベクトルに VH CH1-CD16 VHH と VL CL のクローンします。</li>
</ol>2. 変換と文化
<ol><li>追加 100 100 VH-CH1-CD16 (図 1 a) を含む pET26b の ng 主務 BL21 の 100 μ L に VL CL (図 1 a) を含む pET21a の ng (DE3) 細胞。よく混ぜると氷 45 90 s、転送、42 ° C の水浴中 30 分加温の上を孵化し、氷上 3-5 分の間孵化させなさい。</li>
	<li>BL21 を含むチューブにホストゲノム スープ (LB) 媒体の 500 μ L を追加 (DE3) 細胞し、37 ° c、45-60 分 150 rpm BL21 の広がる 100 μ L をインキュベーションして (DE3) セル LB 寒天培地プレート含む 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンの 100 μ g/mL、12-16 h の 37 ° C で、孵化させなさいと。<ol>
<li>ホストゲノム スープ (LB) メディアの準備: 1 %wt/巻トリプトン、0.5 %wt/巻酵母エキス、1 %wt/巻塩化ナトリウム。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一晩 50 μ G/mlカナマイシンの 100 μ g/mL 37 ° c、220 rpm は、アンピシリン、文化を含むスーパー スープ (SB) 培地 5 mL に単一コロニーから細胞を接種します。その後、SB 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンと 37 ° C、4 h 220 rpm で文化の 100 μ g/mL の 100 mL に文化の 1 mL を接種します。その後、SB 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンと 37 ° C, 220 rpm で文化の 100 μ g/mL の 1 L に 10 mL の文化を転送します。<ol>
<li>スーパー スープ メディアの準備: 3.2 %wt/巻トリプトン、2 %wt/巻酵母エキス、0.5 %wt/巻塩化ナトリウム。</li>
	</ol>
</li>
	<li>外径600に達する 0.6 - 0.8 は 0.2 mM の最終的な集中にイソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド (IPTG) を追加します。16 ° c、ペリプラズム式の 36-48 時間 180 rpm 文化。</li>
</ol>3. GPC3 S Fab ペリプラズム浄化
<ol><li>ペリプラズム画分調製<ol>
<li>4,000 x g、30 分のための 4 ° C で遠心分離によって細胞を収集、媒体を破棄し、セルの重量を量る。</li>
		<li>冷たいショ糖液 (pH 7.5 トリス-HCl の 20 mM; 25% (重量/巻) ショ糖と 1 mM EDTA の) 細胞の 1 グラムあたり 4 mL を徹底的に細胞を再懸濁し、15 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>遠心分離機 (テーブル トップ遠心分離機、固定角ロータ) 8,500 x g で 4 ° C 20 分清 (ショ糖の割合) を削除、保存氷の上。</li>
		<li>冷たい 5 mM MgCl2 PMSF (グラム セルあたり 4 mL) の 1 mM のミックスでペレットを再懸濁します。グラムあたり、リゾチーム株式 (15 mg/mL) 40 μ L を追加し、氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>4 ° C、20 分清 (ペリプラズム画分) の転送 8,500 × g (テーブル トップ遠心、固定角ロータ) で遠心し、氷の上保存します。</li>
		<li>氷の上の 50 mL の円錐管に 30 分は上澄みを除去、保存 30,000 × g、4 ° C で遠心し、糖画分およびペリプラズム画分を組み合わせます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni NTA の親和性の浄化<ol>
<li>均質な懸濁液を達成するため、Ni NTA 寒天新鮮な 15 mL の円錐管に 1 mL を削除および 10 列ボリューム (CV) 平衡バッファーを追加する徹底的に混合することによって Ni NTA agarose の 1 mL を再懸濁します (pH 7.5; トリス塩酸 25 mM 1 M NaCl の) 平衡に。</li>
		<li>5 分 400 x g で遠心し、上清を慎重に削除します。その後、糖画分およびペリプラズム画分を含む 50 mL のチューブに Ni NTA アガロースを追加します。2 h の 4 ° C でロック。</li>
		<li>400 x g で混合物を遠心分離機、4 ° C、5 分は、非連結の一部として別の新鮮な冷たいチューブに上清を慎重に取り外します。重力列に Ni NTA アガロースを転送します。</li>
		<li>10 を追加バッファーを洗浄の CV (pH 7.5; トリス塩酸 25 mM 1 M 塩化ナトリウム; 20 mM、30 mM か 40 mM のイミダゾール) 列、および収集、洗濯分数として想定し, 浸出液に。 注: これらのソリューションは、イミダゾールの濃度の増加の順序で追加する必要があります。</li>
		<li>3 追加溶出の CV バッファー列を (pH 7.5; 300 mM NaCl のトリス塩酸 25 mM; 100 mM、200 mM、300 mM や 400 mM のイミダゾール) と溶出画分 1、2、3、および 4 として、想定し, 浸出液を収集します。 注: これらのソリューションは、イミダゾールの濃度の増加の順序で追加する必要があります。</li>
		<li>透析 2 l PBS (137 mM nacl、KCl、2.7 mM、Na2HPO4KH2PO4、pH 7.4 の 2 mM の 10 mM) の溶出画分 12% GPC3 S 工場の存在を確認 2 のための 4 ° C で透析チューブ (12.4 kDa) を使用して SDS ページし、次にCoomassie 青い染色。</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG CH1 の親和性の浄化<ol>
<li>IgG CH1 の親和性の樹脂の 1 mL を 50 mL の円錐管に転送し、まず PBS とビーズを洗ってください。3.2.6 のステップ後透析液 GPC3 S Fab を追加します。2 h の 4 ° C でロック。</li>
		<li>400 x g で 5 分間遠心、4 ° C慎重に別の新鮮な冷たいチューブに上清を除去し、樹脂を重力列に転送します。</li>
		<li>10 追加洗濯の CV バッファー列を (PBS) と洗浄分数として溶出を収集します。</li>
		<li>1 M トリス pH 9.0 (各溶出画分の mL あたり 0.1 mL) を追加することによって、コレクション チューブを準備します。3 CV 溶出バッファー (pH 2.7 グリシン塩酸 0.1 M) で溶出し、溶出の端数を収集3 回繰り返します。</li>
		<li>透析 2 l 2 のための 4 ° C で透析チューブ (12.4 kDa) を使用して PBS の溶出画分を 2 回繰り返します。</li>
		<li>Ultramicrospectrophotometer によるタンパク質濃度を測定 (分子吸光係数: 91105。 1 A280 = 0.69 mg/L)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-PAGE および西部のしみが付く分析
<ol><li>5 x SDS 読み込みバッファーにサンプルの 10 μ L を取るし、よく混ぜます。5 分間 100 ° C で蛋白質の混合物を沸かしなさい。<ol>
<li>5 x SDS 読み込みバッファーを準備: トリス-HCl、pH 6.8, 10 %wt/巻 SDS の 250 mM、0.5 %wt/巻ブロモフェノールの青、5% 巻/巻 β-メルカプトエタノール、巻/集グリセリン 50%。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前述の26,27,28として読み込みゲル (5%) と分離ゲル (12%) の SDS-PAGE ゲルを準備します。</li>
	<li>ゆで蛋白質の混合物とタンパク質マーカーの 10 μ L を読み込み、SDS のページを実行します。</li>
	<li>Coomassie 鮮やかな青色の溶液に 20 分間揺れでゲルを染色し、染め色を行います。</li>
	<li>PVDF 膜に転送した後、西部のしみの tbst (20 mM トリス-HCl の nacl 0.1% 巻/巻トゥイーン 20 150 mM) 膜をブロック + 5 %wt/巻の揺れながら室温で 1 h のスキムミルクします。</li>
	<li>一次抗体を持つ膜を孵化させなさい (反彼または反フラグ) TBST + 5% スキムミルク 1 h の 1:2,000 を希釈します。</li>
	<li>Tbst、室温で 5 分間洗浄し、3 回繰り返します。</li>
	<li>TBST + 5 %1 h のスキムミルクで希釈した二次抗体 (HRP リンク抗マウス Fc 抗体) 1:2,000 で膜を孵化させなさい。</li>
	<li>Tbst、室温で 5 分間洗浄し、3 回繰り返します。</li>
	<li>映画 1 本あたりの HPR 基板の 1 mL を追加し、開発と画像を撮影。</li>
</ol>5. ゲルろ過分析
<ol><li>次の列を使用する: 列量 24 mL。PBS pH 7.4; の平衡バッファー温帯; ルームで 0.5 mL/min の流速200 μ L のサンプル量。</li>
	<li>次のタンパク質の量と濃度を使用して: 1.2 mg/mL GPC3 S 工場の 500 μ L。30 分 20,000 × g で遠心分離し、ロードに 200 μ L を取る。</li>
	<li>タンパク質マーカーの量と濃度は、1 つの管にシトクロム C の 100 μ L (2 mg/mL、12.4 kDa)、脱水 (3 mg/mL, 29 kDa) の 140 μ L、アルブミン (10 mg/mL、66 kDa) の 140 μ L、200 μ L アルコール脱水素酵素 (5 mg/mL, 150 kDa) を取る。30 分 20,000 × g で遠心分離し、ロードに 200 μ L を取る。</li>
	<li>各実行する前に、少なくとも 2 で洗って 0.5 mL/min の流速で蒸留水の CV。</li>
	<li>少なくとも 2 列を平衡平衡バッファー (PBS、pH 7.4) 0.5 mL/min の流量での CV。</li>
	<li>サンプルをロードする 0.5 mL/min でサンプルを自動的に挿入します。</li>
	<li>0.5 mL/min で平衡バッファーで溶出し、280 と 215 nm で検出します。</li>
</ol>6. 流れのフローサイトメトリー解析
<ol><li>文化、HepG2 (GPC3 陽性)、Hep3B (GPC3 陽性)、Huh7 (GPC3 陽性) および切除例が少ない-97 H (GPC3 負) 細胞 10% 牛胎児血清 (FBS)、(100 μ g/mL)、ペニシリン、ストレプトマイシン (50 μ g/mL) 37 ° c に DMEM 培地を含む 100 mm × 20 mm のプラスチック製の食器5% CO2。</li>
	<li>文化町 (GPC3 負) 細胞と町/gpc3 由来細胞の 10 %fbs、ペニシリン (100 μ g/mL)、37 ° c、5% CO2ストレプトマイシン (50 μ G/ml) と RPMI 1640 媒体を含んでいる 100 mm × 20 mm のプラスチック製の食器で実物大の人間 gpc3 由来 cDNA (GPC3 陽性)。</li>
	<li>25 cm2フラスコ 10 %fbs、ペニシリン (100 μ g/mL)、37 ° c、5% CO2ストレプトマイシン (50 μ G/ml) と RPMI 1640 媒体を含んでいる実物大の人間の CD16 cDNA (CD16 陽性) をかくまっている NK92/CD16 を文化します。</li>
	<li>セルは 70-90% 合流、培地を除去、2 ml の PBS のセルを洗浄します。0.25% トリプシンの 1 mL を追加し、37 ° C で 2-3 分 (またはセルを開始表面からデタッチするまで) で孵化させなさい。トリプシンを中和し、再上下に軽くピペッティングにより細胞を停止する完全な成長培地 1 mL を追加します。</li>
	<li>ノイバウアー検定を使用してセル数をカウントし、トリパン ブルーによる細胞生存率を検出します。</li>
	<li>3 x 106セルの各セルの行を収集します。1 mL の PBS + 0.2 %bsa 再度セルを中断するを追加します。200 × g で遠心分離、4 ° C、5 分 2 回の繰り返し。</li>
	<li>セルを再停止する PBS + 0.2 %bsa の 0.3 mL を追加し、100 μ L (約 100 万) を各 5 mL ポリスチレン丸底チューブに転送します。 注: 氷で、チューブにここからすべての手順を実行する必要があります保たれる寒さを確認してください。細胞表面抗原に抗体をバインドすると、複雑な内面化する開始されます。寒さそれを維持し、プロセスが著しく遅くなります。</li>
	<li>すべてのチューブに一次抗体 (GPC3 S Fab やヒト IgG1、最終濃度 5 μ G/ml) の 10 μ L を追加し、氷上で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>1 mL の PBS を追加 + 0.2 %bsa を 5 分の 4 ° C、200 × g で遠心洗浄を 3 回繰り返します。</li>
	<li>100 μ L の PBS + 0.2 %bsa で再停止し、二次抗体 (抗ひと IgG(H+L) 488、最終濃度 10 μ g/mL) の 0.5 μ L を追加し、注 1 における氷の上を孵化させなさい: このステップから光からセルがください。</li>
	<li>1 mL の PBS を追加 + 0.2 %bsa を 5 分の 4 ° C、200 × g で遠心洗浄を 3 回繰り返します。</li>
	<li>標準プロトコル29によるとフローサイト メーターによる細胞を分析します。488 nm レーザー励起用のセルを取得します。</li>
</ol>7. 細胞毒性の試金
<ol><li>腫瘍細胞を準備します。<ol>
<li>町、切除例が少ない-97 H、Huh7 Hep3B 文化 HepG2 細胞 6.1 6.5 の手順で説明するよう。</li>
		<li>0.5 × 105/mL に細胞を希釈し、100 μ L 細胞 (ウェルあたり 5,000 細胞) 96 ウェルのプレート上にプレートします。セルを添付するように 6 ~ 8 h の文化.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ひと末梢血単核球 (PBMCs) を準備します。<ol>
<li>50 mL の円錐管に PBS の等しいボリュームと新鮮な準備ができて血液を希釈します。たとえば、10 mL を 10 mL の PBS で血液を希釈します。</li>
		<li>新鮮な 50 mL の円錐管にリンパ球分離培地 15 mL を入れます。ゆっくりとチューブ側に沿ってリンパ球分離媒体に希釈血液を転送します。 注意: はチューブを垂直に注意します。リンパ球分離媒体の表面を壊さない。</li>
		<li>オフ ブレーキ部屋の温度で 35 分の 400 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>ゆっくりと上部のプラズマ層を削除し、プラズマ リンパ球分離媒体界面 PBMCs を含む白血球層を取る。</li>
		<li>PBS + 2% の二重ボリュームの PBMCs を希釈 FBS。5 分間 400 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>PBS + 2% で 2 回細胞を洗う FBS。手順 6.5 で説明したセル数字をカウントして 400 × g で 5 分間遠心します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK 細胞を準備します。<ol>
<li>5 x 107セル/mL の PBS + 2 %fbs、場所での濃度の PBMCs 懸濁液の準備に 5 mL ポリスチレン丸底チューブで。</li>
		<li>50 μ L/mL の細胞にヒト NK 細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し 10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>彼らは一様にピペッティングによって中断されるように NK 細胞濃縮キットとよく混ぜるから、磁性粒子を上下に 5 回以上も精力的に再懸濁します。細胞懸濁液を 100 μ L/mL で再懸濁の磁性粒子を転送します。よく混ぜ、5 分間室温で孵化させなさい。</li>
		<li>PBS + 2% を追加することにより 2.5 mL の容量まで細胞懸濁液をもたらす政府短期証券。優しく上下に 2 - 3 回をピペッティングによりチューブに細胞をミックスします。磁石に (キャップ) なし管を配置します。落ち着く 2.5 分間室温磁気ビーズをしましょう。</li>
		<li>磁石を削除します。1 つの連続的な動きで新しい管に濃縮細胞懸濁液を注いで、チューブを反転します。</li>
		<li>6.5 の手順で説明されているように細胞数をカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞傷害性の反応を設定します。<ol>
<li>5 × 105セル/mL に対応する培養培地を使用して NK 細胞を希釈します。96 ウェル プレートにメッキ腫瘍細胞に NK 細胞懸濁液 100 μ L を追加します。</li>
		<li>30 μ g/mL、3 倍希釈、9 ポイント (3 つレプリケートします) の最終的な集中に最高用量と異なる濃度で GPC3 S 工場の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° c、5% CO2 72 時間インキュベートします。</li>
		<li>培養 72 時間後、培地を取り除き、CCK8 試薬を各ウェルの 96 ウェル プレートでの 10 μ L を含む DMEM 培地を 100 μ l 添加し、37 ° c. で孵化し</li>
		<li>プレートが 450 nm で 1、2、3、および 4 h CCK8 試薬を追加した後。</li>
		<li>データを分析します。(OD450 GPC3 S Fab + エフェクター + 腫瘍- OD450媒体) として生存率を計算する/(OD450腫瘍- OD450媒体) × 100%、(OD450 GPC3 S Fab + 腫瘍- OD450中)/(OD450腫瘍-OD450媒体) × 100%。エフェクター細胞は、NK 細胞です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis.">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders.">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li><li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma:+biological+significance+and+temporospatial+distribution.">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li><li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+(FcgammaRIII)+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice.">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li><li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans.">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CD16a,+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells,+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells.">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes.">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma.">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li></ol>

著者は利益相反を宣言しません。

本研究で提案する bsAbs の書式を新規作成するための戦略 GPC3-S-ファブをターゲットに GPC3 陽性腫瘍細胞 NK 細胞を募集することができます。S 工場はすてきな自然に基づいて抗 CD16 VHH11,12を追加することによって形式。BsAbs 含む Fc 領域と比べると、GPC3 S Fab 簡単に大規模な細菌のペリプラズムで製造することができます。
プロト?...

モノクローナル抗体はがん治療1今広く使用されています。抗体の柔軟性のため様々 な抗体基づかせていたフォーマットを積極的に検討しています。BsAbs は、モノクローナル抗体と比較して、2 つの異なるターゲット同時にかつ効率的にトリガーをターゲットし、腫瘍細胞2を殺す免疫エフェクター細胞の募集を認識し、それらを有効にする 2 つの異なる抗原結合モジュールがあります。
現在の組換え bsAb 形式は一般的に 2 つのクラスを割り当てることができます: Fc 含む bsAbs と Fc 領域なし bsAbs。主に哺乳類細胞で生成される Fc 含む形式と比較して、bsAbs なし Fc 領域より小さいサイズの利点がある微生物式システムでより容易に作り出される、腫瘍組織をより効率的に浸透することができます3。
Fc 領域なし bsAbs 一般的単一鎖可変断片 (scFvs) や Fab3などの個々 のバインディング部分をリンクすることによって形成されています。安定ドメインなし bsAbs scFv フラグメントに基づいて、多くの場合は熱安定性、低溶解度、または集計4、5の増加の可能性が侵害します。対照的に、工場ベース bsAbs はネイティブの Fab 部位4,6CH1 と CL の heterodimerization によるより安定しています。
重鎖だけ抗体 (VHHs、単一ドメイン抗体とも呼ばれます) から可変ドメインは、自然の重鎖抗体7のアクティブな抗原結合フラグメントです。VHHs 細菌の表現9に従来の Igg8、低免疫原性、高収率の特異性、親和性が高い特性があります。VHHs Fv 断片と比較して、高い熱安定性10があります。VHHs Fab 部分と比べると、CH1 と CL の不足のための小さいサイズがあります。したがって、S ・ Fab、単一ドメイン抗体、VHH、Fab をリンクすることによって得られる bsAb 形式を設計、その抗腫瘍効果11,12を勉強します。
本研究では抗 CD16a VHH14 hGC3313のファブをリンクすることにより GPC3 S 工場の建設が記述されていた。GPC3 S 工場は、エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)のペリプラズム式で効率よく製作できます。GPC3 S 工場の機能調査は、GPC3 S Fab が肝臓癌療法のための有望な戦略であることを提案しました。したがって、簡単な生産と精製より安定した bsAbs 以前の研究に適用可能な参照を持つ代替技術上 GPC3 S 工場の利点があります。
哺乳類発現系と prokaryotic 表現システムは、BsAbs のさまざまな形式を表現するために使用されています。哺乳動物発現システム、大腸菌とは異なり-ベースのタンパク質発現系高収量、低コスト ・省力化、遺伝子操作と高変換効率15の容易さなど多くの利点があります。BsAbsエシェリヒア属大腸菌で、式の 2 つの基本的な戦略があります: 細胞質と細胞質と細胞膜の外側15ペリプラズムに式で表現します。細胞質の還元環境と比較して、ペリプラズムより酸化のフォールディングを促進する環境と共発現タンパク質16の。正しい折りたたみ bsAbs の溶解性、安定性、機能の生成に重要な役割を果たしています。したがって、信号シーケンス pelB はエシェリヒア属大腸菌の17のペリプラズムに分泌を直接に S 工場の N 末端に追加されました。確保するために、折りたたみ、溶解性、熱安定性、構造安定性、複雑さと抗体のサイズを減らすことは正しい頻繁16が採用。S ・ Fab 形式は 1 つの Fab と 1 つ VHH、小型、シンプルな構造により可能性のある細菌のシステムで非常によく表現されるから成っています。
GPC3 は、GPC3 S Fab バイスペシフィック抗体形式で選ばれました。グリピカン 3 (GPC3) 一種 (GPI)18を介して細胞表面に固定されているヘパリン硫酸 (HS) プロテオグリカン家族のメンバーであります。Gpc3 由来は肝臓癌19,20,21,22の大部分を占める肝細胞癌 (HCC) の場合の 70% の発現です。Gpc3 由来がほとんど表されるので正常組織には、gpc3 由来は肝細胞癌に対する潜在的なターゲットとして提案されています。GPC3 に対して複数のマウスのモノクローナル抗体を生産されています。GC33 のみ展示限定の抗腫瘍活性22, し、それは患者の臨床効果を示すことに失敗しました。本研究では GPC3 S 工場は14gpc3 由来腫瘍の細胞を殺す NK 細胞を募集できるように示されました。
NK 細胞を募集、抗 CD16 VHH を使用しました。CD16a は、低親和性 IgG 受容体、ナチュラル キラー (NK) 細胞、マクロファージ、単球、T 細胞のいくつかのサブタイプに主に表現されます。NK 細胞23細胞抗体依存性細胞傷害 (ADCC) にかかわる。ヒト NK 細胞は、CD56 の 2 種類に分類できます - CD16 + と CD56 + CD16-。CD56 + CD16− NK 細胞、CD56 と対照をなして-CD16 + NK 細胞はパーフォリンおよびグランザイム B の高いレベルを解放でき、したがって24強い細胞毒性を提示します。CD16a を表現するクッパー細胞 (KCs) は、肝マクロファージです。クッパー細胞は、肝臓癌25の抑制に重要な役割を果たします。したがって、ターゲット CD16a bsAbs より魅力的な肝臓がんに対する T 細胞より有望な戦略があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Zhicheng</td>
			<td>ZWYR-D2402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Cence</td>
			<td>GL-10MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti j-26S XPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Mini-PROTEAN&#174; Tetra</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-blot apparatus</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>chemidoc tm XRS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid chromatogram</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA avant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5702R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti His-tag</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-6657-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag-tag</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human(H&#38;L)-488</td>
			<td>A11013</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA-Agarose</td>
			<td>Tribioscience</td>
			<td>TBS9202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-CH1 affinity resin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>194320005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8 kit</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15050-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard marker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MWGF200</td>
			<td>Gel filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>VWRC0487-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0655-100FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knanamycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0408-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0339-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6791-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>A110752-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>P112134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A505255-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a name="RANGE!A50">Coomassie Brilliant Blue R250</a></td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500922-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 20mm plastic dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610498-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GNHa 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCC-97H</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>SCSP-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu 72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL2408</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

このプロトコルでは、建設、バイスペシフィック抗体 (bsAb) GPC3 S 工場の機能性研究をについて説明します。bsAbs は彼らの 2 つの異なる腕を介して 2 つの異なるエピトープを認識できます。bsAbs を積極的に直接腫瘍細胞を殺すために免疫細胞を募集する能力について研究されています。現在、bsAbs の大半は Fc 含む bsAbs または Fc 領域なし小さい bsAb デリバティブとして組換え蛋白の形で生産されています。本研究では GPC3-S-ファブ、抗体フラグメント (Fab) に基づいてバイスペシフィック抗体は抗 gpc3 由来抗体 GC33 抗 CD16 単一ドメイン抗体の Fab をリンクによって設計されました。GPC3 S 工場は、大腸菌で発現し、2 つの親和性クロマトグラフィーで精製できます。精製 GPC3 S 工場は具体的にバインドし、肝臓癌治療における GPC3 S 工場の潜在的なアプリケーションを示唆しているナチュラル キラー細胞を募集して GPC3 陽性肝癌細胞を殺します。

GPC3 S 工場浄化
GPC3 S 工場から精製した大腸菌2 段階アフィニ ティー精製で最初 Ni-国税庁-アガロース、IgG CH1 の親和性の浄化が続くと.2 段階の親和性の浄化後 GPC3 S 工場は 1:1 (図 2 a) に近い 2 つのチェーンとの同質性を精製しました。VH CH1 CD16 VHH と VL CL ポリペプチドの存在は、別?...

Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

紹介でバイスペシフィック抗体 GPC3 S Fab プロトコル大腸菌。精製 GPC3 S Fab GPC3 陽性肝癌細胞に対して強力な細胞毒性があります。

GPC3 ターゲット バイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K ビュー.  Sun Yat-Sen University. 紹介でバイスペシフィック抗体 GPC3 S Fab プロトコル大腸菌。精製 GPC3 S Fab GPC3 陽性肝癌細胞に対して強力な細胞毒性があります。

ビデオ: A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

がん研究

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

がん研究における治療・診断抗体生体分布の評価のための生体内免疫蛍光局所法

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes more complex, the goal of targeting mitochondria using various compounds that inflict mitochondrial damage (so-called mitocans) is becoming quite popular. Unfortunately, many existing cytotoxicity assays, such as those based on tetrazolium salts or resazurin require functional mitochondrial enzymes for their performance. The damage inflicted by compounds that target mitochondria often compromises the accuracy of these assays. Here, we describe a modified protocol based on differential staining with two fluorescent dyes, one of which is cell-permeant (Hoechst 33342) and the other of which is not (propidium iodide). The difference in staining allows living and dead cells to be discriminated. The assay is amenable to automated microscopy and image analysis, which increases throughput and reduces bias. This also allows the assay to be used in high-throughput fashion using 96-well plates, making it a viable option for drug discovery efforts, particularly when the drugs in question have some level of mitotoxicity. Importantly, results obtained by Hoechst/PI staining assay show increased consistency, both with trypan blue exclusion results and between biological replicates when the assay is compared to other methods.

The protocol describes a rapid, high-throughput, reliable, inexpensive, and unbiased assay for efficiently determining cellular viability. This assay is particularly useful when cells&#39; mitochondria have been damaged, which interferes with other assays. The assay uses automated counting of cells stained with two nuclear dyes &#8211; Hoechst 33342 and propidium iodide.

マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

インビボおよびインビボでマウス樹状細胞を標的とする全長タンパク質を用いた精製DEC-205指向抗体の化学的結合

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

ショウジョウバエメラノガスターにおけるプログラム可能な自動ナノリットル注射器による腫瘍他家移植

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), relying on collateral flow to the liver through the gastroduodenal artery (GDA). In the current manuscript, the technical conduct of robotic DP-CAR is outlined. The greater curve of the stomach is mobilized with care to avoid sacrificing the gastroepiploic vessels. The stomach and liver are retracted cephalad to facilitate dissection of the porta hepatis. The hepatic artery (HA) is dissected and encircled with a vessel loop. The gastroduodenal artery (GDA) is carefully preserved. The common HA is clamped and triphasic flow in the proper HA via the GDA is confirmed using intra-operative ultrasound. A retropancreatic tunnel is made over the superior mesenteric vein (SMV). The pancreas is divided with an endovascular stapler at the neck. The inferior mesenteric vein (IMV) and splenic vein are ligated. The HA is stapled proximal to the GDA. The entire specimen is retracted laterally with further dissection cephalad to expose the superior mesenteric artery (SMA). The SMA is then traced back to the aorta. The dissection continues cephalad along the aorta with the bipolar energy device used to divide the crural fibers and celiac nerve plexus. The specimen is mobilized from the patient's right to left until the origin of the celiac axis is identified and oriented towards the left. The trunk is circumferentially dissected and stapled. Additional dissection with hook cautery and the bipolar energy device fully mobilizes the pancreatic tail and spleen. The specimen is removed from the left lower quadrant extraction site and one drain is left in the resection bed. A final intra-operative ultrasound of the proper HA confirms pulsatile, triphasic flow in the artery and liver parenchyma. The stomach is inspected for evidence of ischemia. Robotic DP-CAR is safe, feasible and when used in conjunction with multi-modality therapy, offers potential for long-term survival in selected patients.

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

We present our operative approach to robot assisted distal pancreatectomy, splenectomy, and celiac axis resection (DP-CAR), demonstrating that the procedure is safe and feasible with proper planning, patient selection, and surgeon experience.

膵癌のためのセリアック軸切除術(DP-CAR)によるロボット支援遠位膵切除術:外科計画と技術

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

GPC3 ターゲット バイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ

GPC3 ターゲットバイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ