Name: quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני [מענק הסיוע 0365274B כדי מרגשת], מכון הסרטן הלאומי [GI נבג P50CA150964 ל ז. ו.], מכוני הבריאות הלאומיים [Office של מחקר תשתית משותפת מכשור גרנט S10RR031845 כדי מיקרוסקופ אור הדמיה המתקן ב אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב], סין מלגת המועצה [עד X.G.]. המחברים תודה ריצ'רד לי אור מיקרוסקופ הדמיה הליבה על עזרתו עם מגלשה סריקה.

כל הניסויים המתוארים כאן המערבות עכברים אושרו על ידי התיק Western Reserve אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה. הכותרת של פרוטוקול 2016-0068 (PI: הואה לו) הוא תפקיד של שחבור חלופי pre-mRNA בפיתוח חוליות".
הערה: המידע של כל ציוד, ריאגנטים, אספקה בשימוש פרוטוקול זה נכללת טבלה של חומרים.
1. מכינים פורמלין פרפין קבוע משובצים קטעים (FFPE)
<ol><li>
המתת חסד 1 CD1 עכבר ועכבר C57BL/6J 1 מאת נקע בצוואר הרחם. בזהירות לחתוך את הגולגולת עם מספריים כירורגיים וחדים. מסירים את המוח עם סקופ. הערה: עכברים זכר בן 5 חודשים CD1 ועכברים בת 3 חודשים C57BL/6J זכר היו בשימוש, הראה תוצאות דומות.<ol>
<li>לשטוף את המוח עם PBS. לתקן את זה. עם פתרון המכיל 10% פורמלין בטמפרטורת החדר (RT) אחר 30 אבני על ידי לשים את כל המוח ב- 50 מ של הפתרון פורמלין.</li>
		<li>שנה הפתרון תיקון ל- PBS, דגירה המוח ב- PBS בן לילה ב 4 º C. מייבשים, להטביע את המוח עם קסילן, פרפין באמצעות הליכים סטנדרטיים18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השימוש של מיקרוטום לחתוך רקמות מוטבע למקטעים 5 מיקרומטר. לשים רצועת פראפין באמבט מים RT הראשון, ולאחר מכן באמבט מים 45 ° C כדי להפיץ את הסרט.
	<ol>
<li>כאשר קמטים, קפלי ברצועת הכלים נעלמים, מיד הר מקטעים בשקופיות זכוכית. האוויר יבש השקופיות בן לילה RT. אופים שקופיות עבור h 1 ב 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. דגימה רעלני
<ol><li>
Deparaffinize רקמה מקטעים. לבצע את הפעולות הבאות בברדס fume.
	<ol>
<li>למלא כביסה שתי מנות (איור 1 א') 250 מ של קסילן טריים ושתיים עם 250 מ של 100% אתנול. להוסיף שקופיות רקמה לתוך מתלה כביסה (איור 1 א') מקום השטיפה לארון תקשורת במנות כביסה בעקבות הסדר וזמן הדגירה המצוין בטבלה 1.</li>
		<li>במהלך כל הדגירה, להרים את מתלה הכביסה למעלה ולמטה יותר מ 3 פעמים בצלחת כביסה. לאחר כל דגירה, להעביר במהירות את מתלה הכביסה לתוך המנה הכביסה הבא כדי למנוע את קטעי רקמה מתייבשת.</li>
		<li>לאחר השלמת השלבים דגירה, הסר את מתלה הכביסה עם מגלשות המנה כביסה. מקום ארון התקשורת חממה 60 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות או עד השקופיות יבשים לחלוטין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צייר מחסום 0.75'' x 0.75'' סביב סעיף הרקמה עם עט הידרופובי המכשול. האוויר יבש המכשול למשך 3 דקות ב- RT.</li>
	<li>
Pretreat פרוסות
	<ol>
<li>להכין ראגנטים וציוד<ol>
<li>להדליק את התנור הכלאה (איור 1B) ולהגדיר את הטמפרטורה עד 40 ° צלזיוס 30 דקות לפני השימוש.</li>
			<li>הרטיבו את הנייר humidifying (איור 1E) עם מים מזוקקים לחלוטין והניחו אותה במגש בקרת לחות (איור 1D, משמאל). השאר את המגש בקרת לחות בתנור הכלאה.</li>
			<li>הכינו 700 מ"ל של ריאגנטים אחזור יעד טרי 1 x על-ידי הוספת 630 מ ל dH2O 70 מ של 10 x יעד אחזור ריאגנטים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>החל מימן על-חמצני.<ol>
<li>לשים את השקופיות deparaffinized על הספסל. להוסיף 5-8 טיפות מי חמצן מקטע לכסות לגמרי את הרקמה. תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.</li>
			<li>הקש על השקופיות על פיסת נייר סופג כדי להסיר הפתרון מימן על-חמצני, שקופית אחת בכל פעם. מיד להוסיף את השקופית לתוך מתלה כביסה ולהעביר את המדף אל צלחת כביסה מלאים dH2O.</li>
			<li>לשטוף את השקופיות על-ידי העברת ארון התקשורת למעלה ולמטה במים מזוקקים למשך שלוש עד חמש פעמים. להעביר את מתלה הכביסה צלחת כביסה מלאים מים מזוקקים ושקופיות לשטוף עוד פעם אחת.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לבצע אחזור היעד<ol>
<li>במקום גביע זכוכית 1000 מ על פלטה חמה. להוסיף 700 מ"ל של טרי 1 x יעד אחזור ריאגנטים כשהספל ומכסים אותו עם נייר כסף. הכנס מדחום כשהספל לכיסוי רדיד (איור 1C). להדליק את הכיריים ולהגדיר גבוה למשך 10-15 דקות.</li>
			<li>כאשר הטמפרטורה של ריאגנטים אחזור מגיע 98 ° C, מעבר לשליטת טמפרטורה הכיריים בגובה נמוך כדי לשמור על החום הגדול מתון. לא להרתיח יותר מ 15 דקות.</li>
			<li>בינתיים, בזהירות פתח את רדיד האלומיניום, לשים את מתלה הכביסה עם פרוסות בתוך ההנהלה לאחזור. מכסה את הספל שוב, תקופת דגירה של 15 דקות.</li>
			<li>שימוש מלקחיים להסיר את המתלה הספל על צלחת כביסה מלאים 200 מ של dH2O ולשטוף 15 s.</li>
			<li>. לא ידענו על צלחת כביסה המכיל 100% אתנול טריים ותנו לשבת 3 מינימלית להסיר את השקופיות, נייבש אותם חממה 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>החלת פרוטאז השלישי<ol>
<li>מקם את השקופיות על המדף הכתם (איור 1D, נכון). להוסיף 5 טיפות פרוטאז השלישי כדי לכסות את הרקמה. בזהירות לשים ארון התקשורת במגש בקרת לחות (איור 1D, שמאלה), הכנס את המגש לתנור הכלאה 40 ° C. תקופת דגירה של 30 דקות.</li>
			<li>להסיר את המדף שקופיות, להחזיר את המגש לתנור. הקש על השקופיות כדי להסיר את עודפי הנוזל, שקופית אחת בכל פעם. להוסיף את השקופית מתלה כביסה ואת המקום המדף בקערה כביסה מלא dH2O. מהלך המתלה למעלה ולמטה כדי לשטוף את השקופיות עבור 3 - 5 פעמים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. איש Assay
<ol><li>
להכין חומרים
	<ol>
<li>לחמם 50 x שטיפת מאגר חממה 40 ° C עבור מינימלית 20 מיקס 2.94 L של dH2O ו- 60 מ של 50 x שטיפת מאגר לעשות 1 x מאגר לשטוף.</li>
		<li>להכין 50% Hematoxylin מכתימים פתרון על-ידי הוספת 100 מ של hematoxylin של גיל אני 100 מ של dH2O. הכן 0.02% (w/v) אמוניה מים על-ידי הוספת מ 1.43 ל 1 N אמוניה מימית 250 מ של dH2O. לערבב טוב במיכל.</li>
		<li>לשים את הגששים ואת המגבר 0-6 ריאגנטים ב RT 30 דקות לפני השימוש. השאר את המגש בקרת לחות בתנור הכלאה 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הליך איש הערה: כדי לבדוק הביטוי של Nf1 שחבור איזופורמים ולחשב את אחוז משולבים (PSI) ערך עבור אקסון 23a, שלושה רגשים איש שונים המכוונות אקסון isoform כלול 23a, אקסון לא נכלל 23a isoform או שניהם איזופורמים הם משומשים (איור 2 ). הגששים משמשים על מקטעי רקמת adjacently לחתוך. כדי להבטיח את הדיוק של החישוב, זה קריטי כי הסעיפים רקמות שלושה מטופלים בדיוק בשלבי גילוי הכלאה, הגברה ושידור.<ol>
<li>בדיקה הכלאה.<ol>
<li>הסר את השקופיות מתלה הכביסה והקש על הנוזל העודף מהשקופיות. מקם את השקופיות בארון הכתם.</li>
			<li>השתמשי בעיפרון לתייג את השקופיות עם שם בדיקה. לשים את השקופיות רקמת המוח adjacently לחתוך שלושה שהוכלא יחד עם שלושה רגשים Nf1 שונים (איור 2). לבצע את השלבים הבאים באותו סדר של שקופיות.</li>
			<li>להוסיף 4 טיפות בדיקה כדי לכסות את הרקמה. אישור בכל פעם כדי למנוע את הסעיפים מתייבשת. מקום המדף הכתם במגש בקרת לחות והוספתו לתוך התנור 40 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
			<li>לשטוף את השקופיות פעמיים עם שטיפה מאגר. עבור כל כביסה, למלא את הצלחת מכתימים 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר ולמקם מתלה כביסה בתוכו. הקש על עודף נוזל על מגבת נייר שקופית אחת בכל פעם והוספתו במהירות לתוך המדף כביסה. . לא ידענו שקופית למעלה ולמטה לתוך המנה עבור 3 – 5 פעמים למשך 2 דקות ב- RT.</li>
			<li>לשימוש לשטוף את השני, מאגר שטיפת טריים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הגברה של האות.<ol>
<li>הקש על המאגר שטיפת עודפי מהשקופיות ומניחים בארון הכתם. להוסיף 4 טיפות של המגבר 0 כדי לכסות את הרקמה. למקם ארון התקשורת הכתם במגש בקרת לחות, להכניס אותו לתנור למשך 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לשטוף את השקופיות פעמיים עם שטיפה מאגר כמתואר לעיל.</li>
			<li>חזור על שלב זה עם המגבר 1 – 6 בעקבות את ההזמנה ואת תנאי בטבלה 2. לשטוף את השקופיות פעמיים אחרי כל שלב הכלאה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>אות זיהוי<ol>
<li>הקש על המאגר שטיפת עודפי מהשקופיות ומניחים בארון תקשורת הכתם. להוסיף 2 µL של מהר אדום B µL 120 מהר אדום (יחס יצירת) צינור microcentrifuge. לערבב היטב ולהוסיף כדי כיסוי מלא סעיף הרקמה. הערה: הנפח הכולל של אדומה / מיקס B מבוססת על המספר והגודל של רקמות מקטעים. עבור אזור 0.75'' x 0.75'', 120 µL הוא מספיק עבור מקטע אחד. לערבב בתוך 5 דקות והימנע חשיפה של המיקס לקרני השמש או אור UV.</li>
			<li>לסגור את המגש, תקופת דגירה של 10 דקות-RT. להסיר את הפתרון פח אשפה מיד להכניס את השקופיות מתלה כביסה ו למקם ארון התקשורת צלחת כביסה מלאים במי ברז. לשטוף שוב עם מים מהברז.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining של השקופיות
	<ol>
<li>הסר את מתלה הכביסה של מי ברז, הקש במהירות על נייר סופג כדי להסיר את עודף מים. להכניס ארון התקשורת hematoxylin 50% מכתים פתרון ולהעביר מיד את המדף לאורך מספר פעמים. תקופת דגירה של 2 דקות ב- RT.</li>
		<li>העברת המדף שקופית בחזרה לתוך המנה מי ברז. רחץ 3 – 5 פעמים על-ידי נע מעלה ומטה ארון התקשורת ושינוי טריים מי ברז עד השקופיות הופכים ברורים, בעוד ברקמות המוח להישאר סגול.</li>
		<li>. לא ידענו על תבשיל המכיל מים אמוניה 0.02% . לא ידענו למעלה ולמטה 2 – 3 פעמים עד הרקמות כחולות לשטוף את השקופיות 3 – 5 פעמים עם מים מהברז טריים בקערה מוכתמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הרכבה של הדגימות
	<ol>
<li>להעביר המדף שקופיות מתוך קערה מכתימים חממה 60 מעלות צלזיוס, תקופת דגירה של פחות 15 דקות עד השקופיות יבשים לחלוטין.</li>
		<li>מקום 40 µL של הרכבה בינונית בשקופית ובזהירות הצב coverslip 24 מ"מ x 50 מ"מ על סעיף הרקמה. שקופיות אוויר יבש למשך 30 דקות ב- RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. איסוף נתונים וניתוח
הערה: השתמש סורק שקופיות כדי לסרוק את התמונות בהגדלה X 40.
<ol><li>
פקדים חיוביים ושליליים
	<ol>
<li>עבור ניסוי, כוללים פקדים חיוביים ושליליים (איור 3). כפקד חיובי טוב, אות צריך להיות גלוי כנקודות punctate ב- 20-40 X הגדלה.</li>
		<li>השתמש עכבר (Mm) 1ZZ - PPIB - כפקד חיובי. המכשיר הזה מטרות הגן משק בית משותף PPIB. . באמת, נקודה אחת על כל התאים 20 הצגת הרקע מכתים לכל 20 X מיקרוסקופ שדה מקובל.</li>
		<li>השתמש החללית DapB-1ZZ כפקד שלילי. המכשיר הזה מטרות dapB של גנים חיידקיים. הגששים שליטה אלה שימשו איש רבים מבחני19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אות זיהוי וניתוח של כמו דפוסי ביטוי של אקסון Nf1 23a
	<ol>
<li>כמו האותות הכלאה מסומנות נקודות punctate, ספרו את הנקודות באופן ידני. מספר הנקודות הוא מתואם עם הרמה של התרשימים שמזוהה על-ידי בדיקה ספציפית. שימו לב כי מספר הנקודות יכול גם להיות מנותח על ידי תוכנות ImageJ או SpotStudio.</li>
		<li>להשתמש שלושה רגשים hybridize המכילים אקסון 23a, אקסון שחסרים 23a איזופורמים או Nf1 הכולל תעתיקים (איור 2). הגששים 3 אין אפשרות להשתמש בו זמנית, להשתמש בשלושת המקטעים של רקמת המוח סמוכים כדי hybridize על כל בדיקה.<ol>
<li>כדי לחשב אחוזים או, אבל בארט (PSI) עבור אקסון 23a, לספור את מספר תאים ונקודות באזורי מוח שונים. עבור כל אזור בעל עניין, לספור תאים יותר מ-400 מכמה תתי אזורים כמצוין באיור4.</li>
			<li>איסוף הנתונים מאזורים המשנה זהה עבור כל אחד משלושת רגשים. לחשב PSI במספר הנקודות בכל תא עם החללית הכללה אקסון 23a / (מספר של נקודות בכל תא עם אקסון 23a הכללה בדיקה + מספר נקודה לכל תא עם exon23a דילוג על בדיקה) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing?.">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?.</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li><li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+in+situ+hybridisation.">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li><li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity.">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA.">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li><li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li><li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras/ERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li><li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner.">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes.">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li><li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

תקשורת זו מדווחת על השימוש BaseScope איש RNA לבדוק דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. הוכח שבצומת הזה תחושה אנטי אקסון-אקסון רגשים קצרים יותר נוקלאוטידים 50 ניתן לייעד אקסון הכללה ולהקפיץ איזופורמים robustly, במיוחד. יתר על כן, האותות וכתוצאה מכך יכול לשמש כדי לחשב PSI של אקסון חלופית.
כמה ו?...

חלופי splicing (AS) הוא תהליך נפוץ המתרחשת במהלך ההבשלה pre-mRNA. בתהליך זה, אקסון ניתן לכלול באופן שונה ב- mRNA בוגר. לכן, דרך AS, אחד הגנים ניתן להפיק רבות mRNAs את הקוד עבור מוצרי חלבונים שונים. ההערכה היא כי 92-94% של גנים אנושיים לעבור חלופי splicing1,2. חלופה חריג שחבור דפוסי נבעה מוטציות גנטיות נקשרו למספר רב של מחלות, כולל נוירודגנרטיביות, ניוון חולים myotonic וסרטן3,4. לפיכך חיוני לחקור ולהבין טוב יותר מנגנונים רגולטוריים splicing חלופיים, בניסיון למצוא טיפולים חדשים של מחלות אנושיות.
כפי מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. חשוב לקבוע הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים במערכת הביולוגית נתון. עם זאת, זה הופך מסובך כאשר איבר מורכב המכיל סוגים רבים ושונים של תאים, כמו במוח או בלב, הוא למד. במקרה זה, הוא הבחירה האידיאלית של מערכת assay RNA בחיי עיר הכלאה (איש) באמצעות רקמות סעיפים אז הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים ניתן להבחין סוגי תאים רבים בו זמנית. אכן, אקסון ספציפיים הגששים שימשו להערכת רמות הביטוי של6,5,חלופי אקסון7. עם זאת, גישה זו אינה מתאימה עבור כמו ניתוח דפוס מהסיבות הבאות. שיטות איש הראשון, המקובלת בדרך כלל להשתמש יותר מ 300 הגששים bp, בעוד הגודל הממוצע של חוליות exons פנימי (אקסון לא הראשון או האחרון) הוא 170 נוקלאוטידים8,9. שנית, בעת בדיקה ספציפית אקסון לבחון את התבנית splicing של אקסון חלופי פנימי, isoform mRNA היחיד שזיהה את המכשיר הוא אחד המכיל את אקסון, תוך isoform mRNA בלי אקסון לא ניתן לאתרם. לפיכך, חישוב האחוזים משולבים (PSI) ערך עבור אקסון חלופי הוא מסובך. יתר על כן, איש פלורסנט קונבנציונלי משלבת לעיתים קרובות איש עם immunostaining, אשר מפחית את יעילות הזיהוי ואת החוסן. לדוגמה, במחקר שחקרה את מפגינות שחבור isoform מיתוג של אצטילכולין אסטראז (AChE) mRNA, digoxigenin סופחה החללית איש וזוהה באמצעות נוגדן anti-digoxigenin. לחלופין, בדיקה התווית על-ידי ביוטין זוהה על ידי המספר המשלים של phosphatase אלקליין/streptavidin מצע phosphatase אלקליין10. אף שיטה משתמשת בכל אסטרטגיה הגברה כדי להגביר את הרגישות של זיהוי. כתוצאה מכך, זה מאתגר כדי לזהות תעתיקים mRNA באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. לפיכך, מערכת assay איש פשוט יותר ועוצמתי יותר יש צורך לנתח בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.
BaseScope לאחרונה פותחה על הפלטפורמה של RNAscope, ומבוססת בסיס, בשימוש נרחב מערכת assay איש. שתי מערכות assay מעסיקים טכנולוגיה במטרה ההגברה מגביר את הרגישות של זיהוי11,12. מה שמבדיל את אחד מהשני הוא האורך של רצף המטרה, אשר הוא קצר ככל נוקלאוטידים 50 עבור BaseScope, 300-1000 נוקלאוטידים עבור RNAscope. לכן ניתן הגששים עיצוב שכוונו אקסון-אקסון צמתי כדי לזהות איזופורמים mRNA חלופיים ספציפיים. במחקר הנוכחי, הליך הוקמה כדי לבחון ההקלדה דפוסי ביטוי של נוירופיברומטוזיס 1 (Nf1) אקסון 23a, אקסון חלופי בהרחבה למד באותה מעבדה13,14,15 , 16 , 17, בסעיפים מוח העכבר. התוצאות מדגימים כי BaseScope הינה מערכת אידיאלי ללמוד דפוסי ביטוי של אקסון 23a Nf1 באתרו בתוך. מערכת זו assay יכול להיות מותאם כדי לנתח כמו דפוסי ביטוי של exons אלטרנטיביים רבים, הוא מייצג כלי רב עוצמה חדשה בלימודי בשם

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (with lid)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III General Purpose Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pretreatment kit&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

חלופי splicing (AS) מתרחשת אצל יותר מ-90% של גנים אנושיים. למשמעות הביטוי אקסון spliced לחילופין מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. כביטוי דפוסי מנותחים בדרך כלל על ידי RT-PCR ו- RNA-seq באמצעות דגימות RNA מבודדים מתוך אוכלוסיה של תאים. בחיי עיר בחינת כמו דפוסי ביטוי עבור מבנה ביולוגי מסוים יכול להתבצע על ידי RNA בחיי עיר הכלאה (איש) משתמש ספציפי אקסון הגששים. עם זאת, השימוש המסויים איש הוגבלה בגלל exons חלופית הם בדרך כלל קצרים מדי בשביל עיצוב ספציפי אקסון הגששים. בדו ח זה, השימוש BaseScope, טכנולוגיה פיתחה לאחרונה מעסיקה oligonucleotides antisense קצר ב- RNA איש, מתואר לנתח כמו דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. אקסון 23a של נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (Nf1) משמש דוגמא כדי להמחיש כי אקסון קצר-אקסון צומת הגששים להפגין אותות חזקים הכלאה עם ירידה לפרטים גבוה בניתוח RNA איש על חלקים במוח העכבר. חשוב מכך, אותות מזוהה עם הגששים הכללה דילוג ספציפיים או אקסון יכול לשמש באופן אמין לחשב את אחוז משולבים בערכים Nf1 אקסון 23a הביטוי תחומים אנטומיים שונים של מוח העכבר. נסיוני ואת שיטת חישוב עבור כמו ניתוח מוצגים. התוצאות מצביעות על כי BaseScope מספק כלי חדש חזק כדי להעריך בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.

איש BaseScope בוצע באמצעות העכבר שלושה זנים: CD1 פראי סוג עכברים, C57BL/6J פראי סוג עכברים ועכברים Nf123aIN/23aIN מוטציה ברקע C57BL/6J, ב אקסון אילו 23a נכלל כל סוגי תאים כתוצאה מכך מהונדסים splice באתר מוטציות14,15.
כצעד ר?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K Views.  Case Western Reserve University. בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

Video: Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Cancer Research

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biology

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Neuroscience

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה

מהיר

שילוב קרינה זוגית

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections