עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית "1000plan הנוער", את הכספים הפעלה מאוניברסיטת טונגג'י, ו NSFC גרנט # 21607115 21777116 (לין).

1. עיצוב, ייצור של העוברים דג זברה סידור במערך תבנית
<ol><li>
לעצב את תבנית arraying עם 12 על ידי 8, פריסת 96-ובכן שמתאים צלחת 96-ובכן סטנדרטי. שימוש המימדים המופיעים איור 1A עבור תא מלכוד העובר העליון (ראה גם את קובץ משלים).
	<ol>
<li>השתמש מידות איור 1B ו- 1 D על מלכוד היטב.</li>
		<li>להשתמש את המידות ב- 1C דמות בתחתית המצודה ואקום.</li>
		<li>להשתמש את הממדים איור 1B באוויר ב / עודפים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשתמש במדפסת תלת-ממד (עם דיוק של 0.1 מ"מ) כדי להדפיס את התבנית; ראה טבלה של חומרי שרף מומלץ שישמש לשם הדפסה. הערה: מדפסות תלת-ממד עם דיוק 0.1 מ מ מומלץ עבור ייצור התבנית arraying (ראה טבלה של חומרים). הצבע המוצע על פני השטח של התבנית הוא אפור כהה או שחור.</li>
</ol>2. דג זברה העובר ההשרצה
<ol><li>מקום שני זוגות של זכר ונקבה דגים למטר ההזדווגות תיבת יום אחד לפני ההשרצה. נפרד זכרים ונקבות על ידי מחיצה פלסטיק שקוף.</li>
	<li>תוריד את המחיצות בבוקר לערבב דג זכר ונקבה.</li>
	<li>הסר את הדגים זכר ונקבה ולאסוף עוברי דג זברה באמצעות מסננת פיין-רשת. לשטוף העוברים עם ביצה 250 מ ל מים (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להעביר את העוברים שנאספו פטרי (90 מ מ קוטר) עם הפתרון של Holtfreter (ראה טבלה של חומרים) ולהסיר את העוברים מופרית ומתה תוך שימוש stereomicroscope של.</li>
	<li>מקם את העוברים חממה 28.5 ° C. ב- 4 h פוסט הפריה (hpf), לבחון את העוברים ולהסיר כל העוברים מת, לא בריא. העוברים מוכנים עכשיו השלב הבא.</li>
</ol>3. הכנת סידור במערך תבנית
<ol><li>לשטוף את תבנית 2-3 פעמים עם יונים 500 מ"ל מים והכניס אותו לתוך תנור ייבוש (45 ° C) במשך 5 דקות.</li>
	<li>קלטת בתחתית המצודה עם חתיכה של איטום הסרט (איור 2שלב 1).</li>
	<li>חבר של משאבת ואקום דרך שקע אוויר בתחתית התבנית. הערה: הואקום מקסימום המומלצת עבור משאבת ואקום הוא 0.1 Mpa. להיות מודע עוצמת הוואקום בשימוש. אם הלחץ השלילי חזק מדי, לחתוך חור בצורת צלב על הסרט איטום כדי להוריד את הלחץ.</li>
</ol>4. סידור דג זברה עוברי במערך לתוך צלחת 96-ובכן
<ol><li>באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק, למקם כ 150 עוברי לתוך התבנית, כפי שמתואר באיור 2, שלב 2.</li>
	<li>לחבר את משאבת ואקום שקע אוויר כדי ליצור לחץ שלילי בתא אטום על ידי הסרט איטום בשלב 3.3.</li>
	<li>מנערים את התבנית כולה אופקית עד בכל טוב יש אחד העובר לכודים (איור 2, שלב 3). הערה: אם הפתרון של Holtfreter מתייבש לפני העוברים לכוד בתוך כל טוב, להוסיף הפתרון של Holtfreter נוספים בבית הבליעה מלכוד, חזור על שלב זה.</li>
	<li>להיפטר פתרון של Holtfreter נוספת של עוברי כי הם לא לכודים בתוך הבארות (איור 2, בשלב 4).</li>
	<li>לכבות ולנתק את משאבת ואקום.</li>
	<li>מניחים צלחת 96-ובכן תקן הפוך נגד התבנית (איור 2, בשלב 5) ולסובב את שניהם באותו זמן (איור 2, לשלב 6).</li>
	<li>הקש על תחתית התבנית או לחבר את האוויר לשקע אבקת גז דחוס יכול העברת העוברים כל לכוד מהתבנית לצלחת 96-ובכן (איור 2, לשלב 6).</li>
	<li>חזור על שלב 4.1 עד 4.8 להכין צלחות רב טוב נוספים.</li>
	<li>להסיר את הסרט איטום ולשטוף את התבנית 3 פעמים מלמעלה עד למטה עם יונים 500 מ"ל מים לשימוש עתידי. הערה: אין להשתמש כל ממסים אורגניים, כמו אתנול, לנקות את התבנית.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments.">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Transformation,+Speciation,+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent.">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract.">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles.">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li><li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+(nanotomy)+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain.">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials.">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid,+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules.">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li><li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies.">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li></ol>

המחברים מילאו פטנט על התבנית מודפס 3D המתואר.

ישנם שני שלבים קריטיים של פרוטוקול זה מחייבות תשומת לב לביצוע הטמעה מוצלחת של הדפסת תלת-ממד תבנית עבור סידור במערך דג זברה עוברי.
הגורם החשוב ביותר על העיצוב של התבנית arraying הוא מלכוד היטב. ודואג אין היחיד העובר לכוד בתוך כל טוב, אחד צריך לשלם קרוב לב הקוטר ואת העומק של הבאר מל...

כאורגניזם מודל פופולרי, דג זברה נעשה שימוש נרחב בתחומים של רפואה ו הרעלים1,2,3,-4. לעומת במבחנה פלטפורמות, דג זברה מציעים המורכבות הביולוגית גדול הרבה שאחד או שני סוגי תאים לא יכול להציע. מלבד היותו יצור כל דגם, פוריות גדול של דג זברה, התפתחות מהירה, בו זמנית, איברים גבוהה המוגבהת העניקו זה מודל ייחודי יתרונות לשמש רעילות בקנה מידה גדול או סמים/מתחם הקרנת5. מאות עוברי המיוצר על ידי זוג אחד של דג זברה למבוגרים בכל שבוע לעלות על דוגמניות כל בעלי חיים אחרים, הפכו אותה מתאימה להקרנה תפוקה גבוהה.
תהליך ההקרנה טיפוסי באמצעות דג זברה כרוך כמות משמעותית של עבודה ידנית, כגון דג זברה בוגרת ההשרצה, העובר בחירה, ואת סידור במערך עוברי לתוך מיכלים מתאים שבו הם נתונים לחשיפה באמצעות טבילה במי. התפתחות העוברים מנוטר, הנצפה נקודות קצה כגון תמותה, hatchability, חריגות לעיתים קרובות להעריך באופן ידני, משמש את ההזדהויות ראשוני של הרעילות של כימיקלים או סימנים של יעילות סמים או תרכובות. כדי לזרז את ההליך ההקרנה, גישות כגון הדמיה אוטומטית וניתוח תמונת המחשב בסיוע נחקרו בעבר. לדוגמה, מיקרוסקופים עם תכולה גבוהה ויכולות הדמיה הותאמו לביצוע אוטומטי בהיר-שדה או קרינה פלואורסצנטית הדמיה על דג זברה עוברי בשלבים התפתחותיים שונים 96/384 צלחות טוב6. התקנים Microfluidic בשילוב עם מיקרוסקופים שימשו כדי למקם דג זברה הזחלים באמצעות מניפולציה הנוכחי עבור הדמיה של נוירונים במוח7. גישות אלה יכול לשפר באופן משמעותי את היעילות של רכישות התמונה לעומת ידני מסורתיים. יתר על כן, עם מספר גדול של תמונות הנוצר, כלי ניתוח תמונה גם פותחו כדי להאיץ את העיבוד של הנתונים, כפי שמגלה ליו. et al. , טו. et al. 8 , 9.
רמת התפוקה הדמיה וניתוח התמונה גודלת, התברר כי הצעד הגבלת קצב להקרנה טמון בתהליך הכנת דג זברה עוברי חשיפה, אשר בדרך כלל אומר סידור במערך אותם לתוך צלחות 96 - או 384-ובכן. כדי לפתור את שלב זה צוואר בקבוק, רובוטיקה מונחה חזון פותחו על-ידי מנדרל. et al. 10 . ואנחנו11 בעבר כדי להחליף טיפול ידני אבל הכלים היו מתוחכמים למדי, יש עקומת למידה עמוקה ליישם טכניקות אלה. לכן, כדי לספק גישה נוחה לשימוש הופך להיות גורם חשוב אחד לשפר עוד יותר את רמת התפוקה של דג זברה ההקרנה היא המטרה העיקרית של עבודה זו.
בעבודה זו, אנו תוכנן, מפוברק העובר סידור במערך תבנית על-ידי הדפסת תלת-ממד. תבנית כזו arraying נועד אומללותו דג זברה העובר לתוך בארות שמתאימים עם צלחת 96-ובכן סטנדרטי. במקום בחירה העוברים ולאחר סידור במערך אותם לבאר בודדת אחת, אחד יכול לבצע העובר מלכוד ית כל העוברים 96 לתוך צלחת multiwall בבת אחת. באמצעות תבנית זו, הפרוטוקול הבא, אחד יכול להגדיל באופן משמעותי את היעילות של סידור במערך עוברי לוחות multiwall, אשר בהמונח להגביר יכולת הקרנת לפחות פי עשרה, בהשוואה באופן ידני. הפרוטוקול המתואר להלן כוללת של עיצוב כללי עבור סידור במערך תבנית, דג זברה ההשרצה, אוסף העובר וכן סידור במערך. איור 1 מציג את התכנון הכולל של התבנית arraying. איור 2 מציג מבט כולל על פרוטוקול שלב אחר שלב באמצעות התבנית שמתואר חלקים 3 ו- 4.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Facility</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td>Z-A-S5</td><td></td></tr><tr><td>Mating box</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wash Bottle, 500 ml</td><td>Sangon Biotech</td><td>F505001-0001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Vetec</td><td>V900058-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Vetec</td><td>v900182-500G</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>TCI</td><td>M0501</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011008</td><td></td></tr><tr><td>Sea Salts</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675M</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Biochemical incubator</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>LRH-250</td><td></td></tr><tr><td>3D printer</td><td>UnionTech</td><td>Lite600</td><td></td></tr><tr><td>Photosensitive resin</td><td>UnionTech</td><td>UTR9000</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SHB-IIIA</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive PCR Plate Seals</td><td>Solarbio</td><td>YA0245</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Multi 8-channel pipette 30 - 300 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>Compressed Gas Duster</td><td>Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.</td><td>ST1005</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>Thermo</td><td>GenPure Pro UV/UF</td><td></td></tr><tr><td>Drying oven</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>BPG-9106A</td><td></td></tr><tr><td>System water</td><td></td><td></td><td>Water out of the facility&amp;rsquo;s water system</td></tr><tr><td>Egg water</td><td></td><td></td><td>Dilute 60mg &amp;ldquo;Instant Ocean&amp;rdquo; sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water</td></tr><tr><td>Holtfreter&amp;rsquo;s solution</td><td></td><td></td><td>Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water</td></tr></tbody></table>

a 3-dimensional (3d)-printed template for high throughput zebrafish embryo arraying

דג זברה הוא שאורגניזם גלובלית מוכרת מים טריים משמשים לעתים קרובות ב ביולוגיה התפתחותית, טוקסיקולוגיה סביבתית, מחלות אנושיות תחומי מחקר קרובים. בזכות תכונות ייחודיות שלה, כולל פוריות גדול העובר המוגבהת, פיתוח מהיר בו זמנית, וכדומה, דג זברה עוברי משמשים לעתים קרובות להערכת רעילות בקנה מידה גדול של כימיקלים, סמים/מתחם ההקרנה. תהליך ההקרנה טיפוסי כרוך דג זברה בוגרת ההשרצה, העוברים ובחירת, סידור במערך העוברים לוחות רב טוב. משם, העוברים הם נתון חשיפה הרעילות של כימיקלים, או היעילות של התרופות/תרכובות ניתן להעריך במהירות יחסית מבוסס על תצפיות פנוטיפי. בין תהליכים אלה, העוברים סידור במערך הוא אחד הצעדים מהגידולים ועתירת ביותר אשר מגביל את רמת התפוקה. פרוטוקול זה, אנו מציגים גישה חדשנית אשר גורם השימוש של תבנית arraying מודפס 3D בשילוב עם ואקום מניפולציה כדי להאיץ את שלב מפרך. פרוטוקול במסמך זה מתאר את התכנון הכולל של התבנית arraying, הגדרת הניסוי מפורט, הליך שלב אחר שלב, ולאחריו נציג תוצאות. כאשר מיושמת, גישה זו צריך להועיל במגוון רחב של יישומי מחקר שימוש דג זברה העוברים בדיקות נושאים.

איור 3 מראה תבנית אופיינית arraying מודפס 3D. תבנית זו משתמשת שרף פוטוסנסיטיבית כחומר גלם, נעשתה על ידי מדפסת תלת-ממד; שכבה של צבע שחור הוחל לספק ניגוד יותר לצבע של העוברים. המיקום של 96 וולס (12 על ידי 8) תוכנן כדי להתאים עם צלחת 96-ובכן סטנדרטי. באופן דומה, תבנית טוב 3...

Watch this Scientific Journal Video about A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying at JoVE.com

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

a-3-dimensional-3d-printed-template-for-high-throughput-zebrafish

Research

JoVE Journal

Environment

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

6.7K Views.  Tongji University. כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.

Video: A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetics

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Developmental Biology

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מיקרוסקופיה מרובת תצוגות מעודנת עבור עוברים של דגי זברה

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר Spotlight: אסטרטגיות להרכבת עוברים של דגי זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור מרובה תצוגות ברזולוציה גבוהה — טכניקות להדמיה ושחזור תמונה

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה