המחברים רוצה להודות לאנגנאו דוד למתן בנדיבות שטח האקווריום; אריק אבן, ג'ון ג. מור, צ'ין טאנג בשביל לעזור עם דג זברה תחזוקה, ריאגנטים, ו אן רוברטסון, אליוט Hagedorn מהמעבדה של לאונרד Zon עבור ברכישת המתח דג זברה המשמש כאן. הם גם רוצה להודות אוקטביו הורטדו לקבלת ייעוץ על טכניקות photolithographic. FE מומן על ידי מלגות מבית החולים של שריינר לילדים, האגודה האמריקאית אוסטרלי. עבודה זו מומן על ידי NIH הענק GM92804.

Microinjection של הזחלים אושרה על ידי הוועדה חולים כללי מסצ'וסטס-אכפת לי חיה מחקר תחת פרוטוקול 2011N000127.
1. התקן פבריקציה נוספת
הערה: כל בסיוע מחשב (CAD) קבצי ציור המשמש עיצוב מסכות פוטוליתוגרפיה המתוארים כאן (איור 1) זמינים להורדה. ראה טבלה של חומרים עבור קישורים.
<ol><li>לפברק כשהפחד מאסטר עובש בחדר נקי Class 1,000 באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי7. עבור מערכים מיקרו ו ערוצים, דפוס את photoresist על בסיס אפוקסי שלילי ברצף ב 3 שכבות באמצעות 3 מסכות נפרדים, בהתאם להוראות היצרן: 100 מיקרומטר עבור התכונות רדוד, מיקרומטר 200 עבור התכונות בינונית ו- 400 מיקרומטר עבור התכונות עמוק. עבור התקן הדמיה, דוגמת שתי שכבות באמצעות מיקרומטר 400 עבור התכונות רדוד מיקרומטר 600 עבור התכונות עמוק.</li>
	<li>קלטת כשהפחד שהושלמו לבסיס של 15 ס מ פטרי ליציקת (איור 2).</li>
</ol>2. הכנת מערכי משטח Microstructured - PDMS
<ol><li>כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק polydimethylsiloxane (PDMS), באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של היוזם, מערבבים ביסודיות פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.</li>
	<li>שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.</li>
	<li>דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.</li>
	<li>. כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.</li>
	<li>חותכים בזהירות מסביב למכשיר על כשהפחד הראשי באמצעות אזמל, מקפיד לשמור על קשר בין קצה האזמל השטח וופל. באמצעות מלקחיים, לקלף את העותק המשוכפל של PDMS מחוץ ופלה העברת נקי 10 ס מ פטרי, תכונה בצד (איור 3).</li>
	<li>לטפל המכשיר עם פלזמה חמצן באמצעות תנור פלזמה עבור 35 s כדי להפחית את hydrophobicity.</li>
	<li>מכסים עם דג זברה העובר בינוני (E3) המכיל 168 מ ג/ליטר של אתיל methanesulfonate 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). הסרה של בועות מתכונות עמוק יותר על-ידי זרימת מים על פני השטח של המכשיר באמצעות פיפטה של העברה.</li>
</ol>3. הכנת מערכי משטח Microstructured - Agarose
<ol><li>כדי להפוך את תבנית PDMS שלילי, קודם לטפל מכשיר PDMS עם חמצן פלזמה.</li>
	<li>
פנקו את המכשיר PDMS עם 1H, 1H, 2H, 2Hכדי ליצור משטח אינרטי8אדי silane - Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS). בקצרה:
	<ol>
<li>מניחים את PDMS להיות מטופלים תכונה-צד-up בתוך תא ואקום בתוך ברדס fume.</li>
		<li>ליד PDMS, מקום קטן פתוח זכוכית או אלומיניום תבשיל, בזהירות פיפטה 200 µL של PFDTS (98% silane) לתוך קערה. התראה: PFDTS silane הוא הפכפך מאוד, מגיב באלימות עם מים, דליק, גורמת נזקים חמורים העור והעין על קשר. MSDS לקריאה בהרחבה לפני השימוש.</li>
		<li>לסגור את תא ואקום ולהחיל ואקום למשך 15-30 דקות, או עד silane PFDTS הוא התאדו לגמרי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנס את ההתקן צלחת פטרי, להשתמש כתבנית עבור PDMS טריים, המוכנים כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3.</li>
	<li>אופים ב- 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות, ולאחר מכן לקלף את כל השכבה של טרי PDMS מהמכשיר שטופלו ומניחים בצלחת פטרי טריים. זה יכול לשמש לאחר מכן כתבנית שלילי להטיל agarose.</li>
	<li>כדי להכין agarose, מרתיחים פתרון 2% של נמוך ג'לי טמפרטורה agarose ב E3 במיקרוגל עד התפרקה לחלוטין agarose.</li>
	<li>שופכים את agarose חם כייר שלילי PDMS, להסיר את כל הבועות ב agarose המכסה את המכשיר על-ידי agarose חם זורם מעל תכונות בעלות פיפטה העברה.</li>
	<li>ברגע בועות יוסרו, להכניס למקרר ב 4 ° C כדי להגדיר את agarose.</li>
	<li>להסיר את הבלוק agarose כייר PDMS שליליים על ידי עיוות את PDMS מ מתחת בעבודת יד, להעביר את גוש agarose חדש צלחת פטרי, ו רטוב עם E3 המכיל MS-222.</li>
</ol>4. הכנת PDMS התקני הדמיה
<ol><li>כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק PDMS, באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של יוזם (כמו בשימוש בשלב 2.1), לערבב ביסודיות ב פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.</li>
	<li>שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.</li>
	<li>דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.</li>
	<li>. כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.</li>
	<li>לחתוך את ההתקנים מ כשהפחד מאסטר, אגרוף יציאות באמצעות אגרוף 1.5 מ מ.</li>
	<li>פינוק המכשירים ו 6-ובכן זכוכית-תחתון טוב צלחת עם חמצן פלזמה עבור 35 s, כפי שמתואר בשלב 2.6.</li>
	<li>בונד אחד התקן תכונה לצד השני על כל coverslip זכוכית של צלחת 6-טוב על-ידי הצבתו על פלטה 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: כדי לאשר התקשרות מוצלחת, החל בלחץ חזק לצד אחד של המכשיר בונדד באמצעות מלקחיים. המכשיר צריכים להישאר קשור coverslip זכוכית.</li>
</ol>5. דג זברה תרבות
<ol><li>תרבות עוברי דג זברה כדי dpf 2 באמצעות טכניקות רגיל3.</li>
	<li>Dechorionate עוברי באמצעות מלקחיים או 1 מ"ג/מ"ל, פרוטאז מערבבים (ראה טבלת חומרים)3 לפחות 30-60 דקות לפני טעינה להתקן, כדי לאפשר להם ליישר.</li>
	<li>להרדים עוברי באמצעות פתרון מניות (168 מ ג/ליטר) MS-222 (pH 7.5) על-ידי הוספת 1 מ"ל של 25 X E3 ב שלהם צלחת פטרי.</li>
</ol>6. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - מערכים דיבוט
<ol><li>להכין את הרחוב PDMS צעד 2.7 (איור 3A) של צלחת פטרי כזה כי הוא מכוסה על ידי שכבה (1-2 מ מ עובי) של E3, שמאפשר מניפולציה קל של העוברים.</li>
	<li>להעביר את המספר הנדרש של עוברי (בדרך כלל 10-20 לכל תנאי) על פני הרחוב PDMS באמצעות פיפטה של העברה.</li>
	<li>בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), לדחוף את העוברים החורים microstructured (איור 3 א). השימוש וגושים מתאימה בעיקר אוריינטציות הגבי ו הגחון. הערה: לקבלת החורים עם הדוק יותר מתאים (הגבי ו הגחון), נסה מיצוב העוברים על פני הרחוב במקביל דיבוט ולאחר מכן לגלגל אותם בעזרת לולאה שיער. דוחף אותם עמוק יותר לתוך דיבוט יסייע לשמור אותם יציבים.</li>
</ol>7. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - ערוצי Microstructured
<ol><li>צייר E3 לא ברחוב PDMS בדוגמת לערוצי microstructured (איור 3B) באמצעות פיפטה העברה של עד הרמה של E3 יורד מתחת לקצה הרחוב, אך היא עדיין נוכחים המאגר ואת ערוצי בשכבה דקה על PDMS.</li>
	<li>העברת העוברים 10 מהשלב 5.3 לתוך המאגר באמצעות פיפטה העברה, נזהר שלא תציף את הקצוות.</li>
	<li>באמצעות לולאה שיער, לתמרן כל העובר לאבדון בכניסה של הערוץ המתאים, אוריינט כזה כי ראשו של העובר לכיוון התעלה, העובר יש את הכיוון המתאים המתאוששת הערוץ.</li>
	<li>החלק כל העובר למטה הערוץ באמצעות לולאה שיער עד שהוא מגיע את microfeatures orienting בקירות הערוץ המסייעים לשמור אותו במקום. השימוש ערוצי microstructured מומלצת במיוחד בכיוון לרוחב. הערה: כדי לצמצם את העובר הזזה במהלך microinjection, נסה לכוונן את הכמות של מתח על ידי ציור E3 מן המאגר.</li>
</ol>8. microinjection של דג זברה
<ol><li>
להכין את המחט microinjection.
	<ol>
<li>להפוך מחטים microcapillary זכוכית בורוסיליקט באמצעות של פולר micropipette כמו שתואר לעיל4. . המחטים וכתוצאה מכך צריך צמצום עד לנקודה בקצה אחד, באורך להתחדד של 10 מ מ.</li>
		<li>להכין פתרון כדי להיות מוזרק, ב- chemoattractant ננומטר זה מקרה 100 (N-Formylmethionine-leucyl-פנילאלנין (fMLP) או Leukotriene B4 (LTB4)) ו- 100 ננומטר של 70 kDa Rhodamine לתוספי מעקב ב- PBS.</li>
		<li>לטעון µL 5 של פתרון לתוך המחט בעזרת פיפטה דק מחודדות עצה (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לטעון את המחט לתוך micromanipulator רכוב על דוכן מגנטי ומחובר microinjector picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשבור את קצה המחט בזווית של 45 מעלות על-ידי צובט את הטיפ מחודדות עם מלקחיים.</li>
	<li>התאם גודל בולוס הזרקת 1 nL על-ידי התאמת זמן הזרקת בבקר picopump.</li>
	<li>להתאים את הזווית של המחט microinjection. זווית המחט של 45 מעלות על הבקר המיקרומניפולציה בדרך כלל נקודת התחלה טובה, עם מחט מקבילים באורך של העובר. זווית תלולה עשוי לשמש כדי למזער את התנועה לרוחב של העובר במהלך microinjection.</li>
	<li>שליטה על צלחת פטרי עם יד שמאל ועל את המחט micromanipulator בימין, להביא את המחט קרוב ככל האפשר לאתר המיועד של microinjection, במקרה זה שלפוחית otic. הערה: ניתן לזהות את שלפוחית otic כמו האיבר מלבני האחורי לעין המכיל שני קטן יותר ברורים כהה מלבני מבנים (otoliths).</li>
	<li>באמצעות הבקר חוץ-גופית, לחדור את רקמת המטרה (במקרה זה שלפוחית otic) כך קצה המחט נמצא שלפוחית, ולהזריק האחסון מראש באמצעות המתג הרגל picopump. הערה: אם הרקמה יתנגד חדירה, לנסות בעדינות הקשה על הידית בקר המיקרומניפולציה.</li>
	<li>כדי לשחרר את העוברים, זורמים E3 מעל פני השטח מלמעלה למטה באמצעות פיפטה העברה, או על ידי מתערבל המנה כך העוברים משוחררים לתוך E3 שמסביב.</li>
	<li>העברת העוברים תבשיל שחזור של E3 ללא באמצעות פיפטה העברה של MS-222.</li>
</ol>9. הקרנת עוברי באמצעות PDMS את התקן הדמיה
<ol><li>פריים המכשיר משלב 4.7 מאת זורם E3 (+ MS-222) דרך היציאה. ניתן לבצע זאת באמצעות פיפטה 1,000 µL או פיפטה של צרות-קצה העברה.</li>
	<li>למלא את הבאר E3 + MS-222 עד המכשיר מכוסה.</li>
	<li>לספק 4 העוברים מוזרק משלב 8.7 לתוך כל טוב באמצעות פיפטה של העברה. עוברי ניתן מראש anesthetized במידת הצורך על-ידי המקננת ב E3 + MS-222 למשך 1-2 דקות לפני טעינת (שלב 5.3).</li>
	<li>בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), אוריינט העוברים בכניסות של ערוצי הדמיה בכיוון הרצוי (זנב-הראשון או ראש-הראשון, בהתאם למכשיר בשימוש), לדחוף אותם באופן חלקי המכשיר (איור 4A). זה יעזור למשוך אותם לתוך המכשיר באופן שווה.</li>
	<li>צייר E3 דרך המכשיר מן הנמל באמצעות פיפטה µL 1,000 או פיפטה העברה עד העוברים נמשכים לתוך תעלות לכיוון הנכון הדמיה (איור 4B). הערה: תיזהר שלא לשאוב את העוברים מעבר לנקודה השמנה, זה נזק העוברים ולשנות את חוש ההתמצאות שלהם.</li>
	<li>להעביר היטב-לוחית מיקרוסקופ הדמיה (איור 4C).</li>
	<li>
התמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה.
	<ol>
<li>התאם הגדלה על-ידי בחירת העדשה המתאימה. 10 X הוא בדרך כלל ההגדלה שימושי הדמיה ההעברה נויטרופילים דג זברה.</li>
		<li>התאם עוצמה מקור האור וזמן חשיפה לכל ערוץ כך כל אות היא ברורה, אבל לא רוויות.</li>
		<li>לכידת תמונות לכל ערוץ. כאן, השתמשנו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP, לשעבר: 470/22, Em: 525/50), טקסס אדום (TxRed, לשעבר: 585/29, Em: 628/32) ולהעביר ערוצי. ניתן לשלב תמונות רב-ערוצי במהלך עיבוד שלאחר (איור 4B-אני).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae.">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li><li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+(ZEBRA)+device:+a+low-cost,+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging.">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+elastomeric+high-aspect-ratio+microstructures+using+polydimethylsiloxane+(PDMS)+double+casting+technique.">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li><li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis.">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li><li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhagoSight:+an+open-source+MATLAB&#174;+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model.">PhagoSight: an open-source MATLAB&#174; package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636 (2013).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hemmil&#228;, S., Cauich-Rodr&#237;guez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple,+and+cost-effective+treatments+to+achieve+long-term+hydrophilic+PDMS+surfaces.">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish-on-a-chip:+microfluidics+for+zebrafish+research.">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li><li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system.">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li><li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

כאן, אנו מתארים את השימוש של ההתקנים שפיתחנו לאחרונה להקל על 2 dpf דג זברה microinjection5, ולהציג את התקן הרכבה פשוטה ללא agarose עבור הדמיה נוח של העוברים. כלים אלה מדגישים את התועלת של טכניקות photolithographic להרכבת התקנים שימושי עבור דג זברה טכניקות.
מצאנו למתקן התקנים שימושי ב...

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה עבור שדות רבים, מחקרים של יסוד ביולוגיה התפתחותית כדי בקנה מידה גדול גנטי, כימית מסכי1,2. שינויים גנטיים שגרתיות, כגון ביטוי גנים, נוקאאוט, מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9 transgenesis לסמוך על microinjection של חומר גנטי לתוך הזיגוטה מתא בודד, אשר הובילה להתפתחות של פשוט, קל לשימוש, מסחרית כלים זמינים עבור המכוונת וייצוב ביצים הזרקת3. גישות אחרות, כגון השתלת זיהום, דורשים לעיתים קרובות microinjection לתוך העוברים בשלב מאוחר יותר, הזחלים באמצעות מד גדול מחטים נימי4. עם זאת, השימוש מחטים מד גדול מציג אתגרים טכניים משמעותיים, כמו זה יותר קשה לחדור את רקמת המטרה בלי לדחוף או מגלגלים את העובר. בתנאים אלה, קבלת מתח מים המתאים הנדרש כדי לייצב את העובר תוך הימנעות ייבוש במהלך ההליך קשה, העוברים לא יכול להיות אידיאלי אוריינטציה להזרקה לתוך רקמת המטרה.
בעקבות microinjection, הוא לעיתים קרובות שימושי למסך עוברי מוזרק סמן הוזרק בהצלחה, וכדי ללכוד תמונות של נקודת הזמן הראשוני. לטפל באתגרים אלה, פיתחנו מגוון של מכשירים microstructured המסייעים לייצב את העוברים dpf 2 הכיוונים השונים הן עבור microinjection5, והן עבור מיון המבוסס על תמונות מהיר שלאחר ההזרקה.
כדי להשיג רזולוציה מבנית מספיק במכשירים האלה, אנחנו מנוצל טכניקות photolithographic. נפוץ תעשיות מיקרו-אלקטרוניים ועוד אקסטרפולציה לאחרונה microfluidic פבריקציה נוספת, גישות אלה ניתן להשיג מבנים אנכיים הנע בין 1-1, 000 מיקרומטר, בקנה מידה המתאימה מניפולציה של דג זברה עוברי וזחלים. כל ההתקנים הללו זוייפו באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS), שהינו זול חזקים פיזית, אינרטי מבחינה ביולוגית, שקוף.
מערכים משטח microstructured (שימי) שעוצבו כבלוקים של PDMS עם משטח עליון בדוגמת, מקביל הערוצים פשוט בבלוקים agarose הנפוץ עבור הביצה microinjection. להקרנה שלאחר ההזרקה, 6 התקני הדמיה יכול להיות ערוכים תת 6-ובכן צלחת רגילה. התקנים אלה מיועדים לטעינה קלה של העוברים, בעוד ההליך לפריקת בנוחות מאפשר חילוץ העובר ספציפיים, הקלת מבוססת תמונה הקרנת גישות בצורה יותר ידידותית למשתמש מאשר התקנים אלה שפותחו בעבר על ידי ביב מעבדה6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>For casting agarose devices</td></tr><tr><td>PFDTS silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>For casting of negative PDMS molds</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>To anesthetize zebrafish</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>To trace microinjections</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>For Casting from the master wafer</td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>For imaging devices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass microcapillaries</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>For microinjection needles</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>For transferring zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>For loading the microinjection needles</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>To punch ports in PDMS imaging devices</td></tr><tr><td>No. 11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For cutting PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>For manipulating microinjection needle</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>For mounting micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>To control microinjection volume and timing</td></tr><tr><td>EVOS inverted fluorescent microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>To image injected embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>For visualizing microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה של מחלות אנושיות שונות, כלי שימושי עבור טווח גדל והולך של מחקרים ניסיוניים, פורש יסוד ביולוגיה התפתחותית דרך מסכי גנטי וכימיים בקנה מידה גדול. עם זאת, ניסויים רבים, במיוחד אלה הקשורים לזיהום, מודלים xenograft, לסמוך על microinjection הדמיה של עוברי וזחלים, אשר מפרך טכניקות הדורשות מיומנות ומומחיות. כדי לשפר את הדיוק ואת התפוקה של טכניקות microinjection הנוכחי, פיתחנו סדרה של התקנים microstructured אוריינט ולייצב את העוברים דג זברה-2 ימים שלאחר ההפריה (dpf) בכיוון הגחון, הגבי או לרוחב לפני נוהל. כדי לסייע ההדמיה של העוברים, עיצבנו גם מכשיר פשוט עם ערוצים אוריינט דג זברה 4 רוחבית במקביל נגד החלקה כיסוי זכוכית. יחד, בכלים אותם אנו מציגים כאן להדגים את היעילות של גישות photolithographic כדי ליצור התקנים שימושי עבור אופטימיזציה של טכניקות דג זברה.

הגישה המתוארת כאן מדגים את העיצוב (איור 1) ועל פבריקציה נוספת של התקנים לשימוש עם דג זברה 2 dpf, באמצעות photolithographic (איור 2) וטכניקות רך-ליטוגרפיה (איור 3). שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של איטראציות עיצוב ושינויים רבים, שינויים ואופ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengineering

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Neuroscience

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune cell migration. Microfluidic devices are used for entrapment to support long-term imaging of multicellular organisms, including zebrafish. However, the fabrication of these devices using soft lithography requires specialized facilities and competency in 3D printing, which may not be accessible to every lab. Our adaptation of a previously developed low-cost polyethylene terephthalate lamination method for constructing microfluidic devices increases accessibility by enabling design fabrication and iteration for a fraction of the technical investment of conventional techniques. We use a device made with this method, the Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), to accommodate drug treatment, manual wounding, and long-term imaging of up to four embryos in the same field of view. With this new design, we successfully capture gross morphological characteristics of the calcium&#160;signal around laser ablation and manual transection wounds for multiple embryos in the 2 h immediately following injury, as well as neutrophil recruitment to the wound edge for 24 h.

An innovative method for fabricating microfluidic devices using polyethylene terephthalate (PET) lamination significantly reduces the cost and complexity of entrapping and imaging multiple live zebrafish embryos.

תכני מיקרופלואידיקה למינציה פוליאתילן טרפתלט בעלות נמוכה עבור הדמיית דג זברה מרובה

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune ...

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

התקני microfluidic פשוטים עבור