פרוטוקול זה מאפשר ייצור של תריסים של מטריצה חוץ תאית בתפזורת מקווי תאים מתורבתים, המאפשר מחקר לתוך אינטראקציות מטריצת התא, כמו גם מחקר לתוך הפוטנציאל של ביו-חומר זה לתיקון פצע. סיבים סינתטיים אלה יכולים למנוע את תגובת הגוף הזר מכוונת נגד חומרים סינתטיים, תוך עדיין ציור מן הרפרטואר העשיר של טכניקות ייצור טקסטיל כדי ליצור מגוון רחב של מושתלים ארוגים. הדגימה של ההליך תהיה קסנדרה ריד, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.
לפני זריעת התאים, autoclave את קרום סיבים חלול ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ואחריו טיפול עם 50 מיליליטר של פלזמה בקר fibronectin ב PBS ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, השתמש במספריים מיקרו סטריליים כדי לחתוך את הסיבים לשישה סנטימטרים או פחות, ולהשתמש מזרק מיליליטר אחד מצויד מחט מד 21 לזרוע פעם אחת 10 לתאי fibroblast החמישי ישירות לתוך הלומינה של קרום סיבים חלול. מניחים שישה סיבים זרעים לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 אינץ', בקצרה דגירה סיבים זרעים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני.
לאחר חמש דקות, להעביר את הסיבים מהאינקובטור לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטר חדש המכיל בינוני תרבות fibroblast בתוספת חומצה L-אסקורבית, חומצה L-אסקורבית 2 פוספט, והפיכת בטא גורם גדילה 1 עד שלושה שבועות בממבה תרבות התא. בסוף הדגירה, השתמש במטס o להעביר את הסיבים התרבותיים לתוך בקבוקונים בודדים scintillation, ולהטות כל בקבוקון כדי לאפשר תוספת של עד חמישה מיליליטר של N-מתיל-2-pyrrolidone בצד של הבקבוקונים. לאחר מכן השתמש פיפטה סרולוגית לאט לשאוף את N-מתיל-2-pyrrolidone מכל סיב, ולהעביר את הסיבים לתוך בקבוקונים scintillation חדש עבור טבילה שנייה טרי N-מתיל-2-pyrrolidone.
לאחר הטבילה השלישית, שטפו את חוטי המטריצה החוץ-תאיים שנוצרים שלוש פעמים במים שעברו דה-מיון באופן דומה, והמקמו פיסת גומי מלבנית בגודל 3 אינץ', ברוחב 1/23 אינץ' עם תבנית מלבנית מרכזית של שמונה על ארבעה מילימטרים על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטית של 3 על 1 אינץ'. לאחר הפעלה אוטומטית, הניחו כל סיבי מטריצה חוץ-תאיים זה לצד זה בתבנית הסיליקון של שמונה על ארבעה מילימטרים עד שלא יהיה שטח פתוח נראה לעין. מניחים את התבנית לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולהקפיא את הסיבים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד קפוא לחלוטין.
לדקלולריזציה, הדגירה את התבנית ב 1% נתרן dodecyl סולפט במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר על נדנדה עם תסיסה עדינה. למחרת, לשטוף את מטריצה חוץ תאית שחולצו עם שלוש שטיפות בשלושה מיליליטר של PBS לכל לשטוף, ולמלא את התבנית עם חיץ עיכול DNAs / RNAs מוכן טרי עבור דגירה של שש שעות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף העיכול, שאפו את פתרון העיכול ושטוף את התבנית שלוש פעמים ב- PBS סטרילי כפי שהוכח.
לאחר הכביסה השלישית, הדגירה את הפיגומים ב 10%פניצילין-סטרפטומיצין ב PBS בארבע מעלות צלזיוס לילה לפני הקפאה בצינור חרוט 50 מיליליטר ב שלילי 80 מעלות צלזיוס במשך כשעה. כאשר רשת המים קפאה לחלוטין, ליופילים את רשת החוץ-תאית המבודדת בן לילה, או עד לייבוש מלא, ומעבירים את הפיגומים הליופיליים למיכל סטרילי בתוך מכסה המנוע של בטיחות ביולוגית ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. כאן מוצג חתך רוחבי של קרום סיבים חלול פוליסולפון מפוברק באמצעות פרוטוקול זה, המציג שכבות החיצוניות והפנימיות של נקבוביות דמויי אצבע האופייניות לממברנה אסימטרית.
לאחר זריעת תאים fibroblast ותרבות, N-מתיל-2-pyrrolidone שטיפה כמו הוכח, חוטים שקופים של מטריצה חוץ תאית מיוצרים. המטריצה החוץ-תאית המייצרת תאים נשארת בת קיימא בתוך קרום הסיבים החלול לאורך כל תקופת התרבות של שלושת השבועות. מטריצה שחולצו יש מראה שקוף כאשר hydrated, המציג צבע לבן מחוץ ומראה סיבי עם יישור אורך ברוטו על הרכבה רשת lyophilization.
הצעד הקריטי ביותר הוא תהליך המסת קרום הסיבים החלול המתורב בממס N-מתיל-2-pyrrolidone על מנת לחלץ את מטריצה חוץ תאית. החומר המיוצר בשיטה זו יכול לשמש לייצור שתלים מהונדסים רקמות לחקירת תיקון רקמות במחקרים פרה-קליניים. N-מתיל-2-pyrrolidone המשמש בפרוטוקול זה הוא מעצבן עור ועין, ולכן מומלץ לטפל בכימיקל באמצעות כפפות ניטריל, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ולטפל בו בתוך מכסה המנוע אדים.
