Siderophores הם משקל מולקולרי נמוך, ביומולקולות מתכת-chelating מעורב רכיבה על אופניים ברזל בסביבה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת תפוקה גבוהה ומהירה של פעילות siderophore בדגימות קרקע וצמחים. שיטות קודמות לגילוי siderophore חיסלו את הסביבה הקריטית של הקהילה המיקרוביאלית.
הטכניקה שלנו מאפשרת זיהוי בתוך הקהילה המיקרוביאלית השלמה יחסית ובית הגידול שבו היא מעורבת. מכיוון שזמינות הברזל חיונית לפרודוקטיביות החקלאית, כך בפרוטוקול זה ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את תפקידם של מיקרואורגניזמים בהוסת את הזמינות של ברזל לצמחים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את ההשפעה של שיטות ניהול החווה על בריאות הקרקע וקהילות המייצרות siderophore, כמו גם את הפיתוח של קהילות כאלה לאורך זמן.
כדי להתחיל, חומצה לשטוף את כל כלי הזכוכית ב 100 מילימולרית הידרוכלורית 100 מילימולרית חומצה חנקתית לפחות שעתיים לפני ניצול במבחן CAS. מכינים תבנית אפייה מאלומיניום במילוי חול ברמה מעבדתית ומכסים אותה בנייר אלומיניום. אוטוקלאב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומניחים בצד.
הכן HDTMA על ידי הוספת 0365 גרם ל 20 מיליליטר של מים כפולים deionized, ולמקם את הפתרון באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לקדם מינון. מוסיפים 0302 גרם של CAS ל-25 מיליליטר של מים כפולים, בעודם תוך ערבוב עדין עם פס ערבוב מגנטי סטרילי. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של הקסהידראט ברזל טוחן אחד ל-25 המיליליטרים של פתרון CAS תוך המשך ערבוב עדין.
עכשיו, לאט להוסיף את 20 מיליליטר של פתרון HDTMA לתוך פתרון ברזל CAS מורכב תוך ערבוב עדין. הכן את פתרון החיץ על ידי המסת 15.12 גרם של PIPES לתוך 375 מיליליטר של מים כפולים deionized עם ערבוב עדין. כוונן את ה- pH ל- 6.8 עם חמישה נתרן הידרוקסידי טוחן.
לאחר מכן מוסיפים מים כדי להביא את הנפח ל 450 מיליליטר. עכשיו להוסיף חמישה גרם של אגרוז לפתרון. יש לבודד באופן אוטומטי את פתרון המאגר PIPES ואת הפתרון המורכב של ברזל CAS ב-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
בזהירות להוסיף את כל הפתרון מורכב CAS ברזל לאורך כל מאגר PIPES בארון biosafety לאחר כל אחד מהם כבר autoclaved. מניחים את הפתרון המעורב באמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס. עכשיו מניחים סירת ריג'נט סטרילית בחול הסטרילי בתוך הארון הביו-בטיחותי וחום ל-50 מעלות צלזיוס.
העבר את אגר קומפלקס CAS ברזל לסירה, ואז במהירות aliquot 100 microliters לכל באר של מיקרופלסטיק סטרילי שטוח 96-well ברור. הכינו תקן פיוברדין 800 מיקרו-מולארי במדיום M9 שהוכן בעבר. לדלל את הפתרון לפתרונות 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ו- 6.25 מיקרומולרים.
הוסף EDTA ל 500 מיליליטר של מדיום M9 שהוכן בעבר כדי להכין את תקן EDTA 3.2 מילימולר. לדלל פתרון זה לתוך 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, ו 6.25 מיקרומולרים פתרונות. כדי ליצור עקומה סטנדרטית, להוסיף 100 microliters של כל ריכוז של פיוברדין ו EDTA להפריד בארות של מיקרופלסטיק 96 היטב המכיל 100 microliters של ברזל CAS מורכב אגר בינוני.
בצע שכפולים טכניים כפולים של כל ריכוז. הוסף גם בארות ריקות עם M9 בלבד. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, למדוד ספיגה לאחר אחד, שש, ו 24 שעות דגירה ב 22 מעלות צלזיוס, ולהשתמש מדידות ספיגה כדי ליצור עקומות סטנדרטיות. לשטוף את ציוד הדגימה עם 22 מיקרון מסנן כפול deionized מים ואחריו 70% אתנול ולנגב עם מגבות נייר.
בצע את הכביסה לפני הדגימה ובין דגימות כדי לשמור על טכניקה סטרילית ולהפחית זיהום צולב. לאחר כריתת רקמות הצמח וחפירת כדור שורש קטן מצמחים בשטח, מניחים את כדור השורש בשקית ניילון נפרדת המסומנו להפרדת דגימה בסביבת המעבדה. מניחים את כל הדגימות ישירות על קרח ולשמור על ארבע מעלות צלזיוס עד דגימות מעובדים עבור הבדיקה ייצור siderophore.
דגימות אדמה משויכות שורש נפרדות לאדמה ריזוספירה בתפזורת, כבולות באופן רופף ואדמה רזופרית קשורה היטב. כדי לעשות זאת, להוציא את כדורי השורש מתוך השקיות בעדינות לנער את האדמה מכדור השורש. מזועזעים מהאדמה, יחד עם האדמה שנותרה בשקית, מהווים את האדמה בתפזורת.
זוהי אדמת הריזוספירה הכבולה באופן רופף. צור אדמה rhizopshere קשור היטב על ידי לקיחת שורשים עם מדגם קשור בחוזקה ולשים אותם בצינור צנטריפוגה. מוסיפים 30 מיליליטר של מים כפולים ומערבולת במשך שתיים עד שלוש דקות.
הסר את השורשים כדי לקבל את דילול תרחיף הקרקע rhizosphere קשור היטב. הומוגניזציה כל דגימת אדמה בתוך שקית המדגם על ידי ערבוב והפיכת הקרקע ככל האפשר מבלי לפתוח את השקית. לאחר כל מדגם כבר מעורבב ביסודיות, aliquot ולהשעות שני גרם של כל דגימת אדמה ב 20 מיליליטר של מדיום M9 שונה בתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר.
מדללים את הדגימה ולאחר מכן לאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי כדי לאפשר aeration. לדגימות ריזוספירה קשורות היטב, הוסיפו שני מיליליטר של תרחיף אדמת הריזוספירה ל-20 מיליליטר של מדיום M9 שונה בתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר. מדללים את הדגימה ולאחר מכן לאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי כדי לאפשר aeration.
כדי להכין את דגימת הרקמה, פני השטח מעקרים את השורש, היורה והתבואה עם 70%אתנול. Macerate שני גרם של רקמה טרייה ב 20 מיליליטר של מדיום M9 שונה באמצעות בלנדר על גבוה במשך 30 שניות. לאחר מכן, להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר, לדלל, ולאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי.
כדי להעשיר את ייצור siderophore באמצעות הגבלת ברזל דגירה צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר לנער ב 160 סל"ד. בגיל 24, 48 ו-72 שעות לאחר ייזום תרבות ההעשרה, יש להסיר תת-דגימה אחת מצינורות ההעשרה בטכניקה סטרילית. צנטריפוגה תת דגימות ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת בשני צינורות צנטריפוגה מיליליטר כדי גלולה את התאים.
באמצעות טכניקה סטרילית, להוסיף 100 microliters של supernatant לפתרון 100 microliter של ברזל CAS מורכב אגר כפול או טריפלג בתוך המיקרופלסטיק. כמו כן להוסיף 100 microliters של בינוני M9 סטרילי כמו ריקים. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס.
כל צלחת צריכה להיות אטומה ומכסה בנייר כסף לפני המיקום באינקובטור. להשעות את העל-טבעי הנותר ואת גלולה עבור כל מדגם לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי משלו שני מיליליטר. הוסף 400 microliters של גליצרול סטרילי לתוך כל צינור על טבעי מדגם מחדש להשעות את גלולה כדי ליצור מניות גליצרול.
להקפיא את המניה במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר. למדוד את הספיגה בשש, 24, 48, ו 72 שעות באורך גל של 420 ננומטר. תערובת פיוברדין biosynthesized על ידי פלואורסצנטים Pseudomonas שימש כסטנדרט לפרש ולכימת ספיגה של דגימות בדגימות של שקילות פיוברדין במיקרומולר.
הקשר בין ספיגה ב 420 ננומטר ואת הריכוז ההתחלתי של פיוברדין מוצג כאן. פעילות Siderophore של העשרה 72 שעות הוערך ב 48 שעות דגירה כדי לקבוע את ההשפעה של גנוטיפ וסוג המדגם על בידוד siderophore. פעילות Siderophore בדגימות קרקע בתפזורת הייתה נמוכה יחסית ולא הציגה הבדלים בין גנוטיפ החיטה שממנו נדגמה הקרקע בתפזורת.
עם זאת, העשרות של אדמה קשורה באופן רופף מבודד מן הגנוטיפ 725 הציג ייצור siderophore גדול יותר לעומת האדמה קשורה באופן רופף מדסן ו 727 אבל לא מ Lewjain. לעומת זאת, ייצור סיידרופור בהעשרות מאדמה קשורה היטב לא הושפע במידה רבה על ידי גנוטיפ. תרבות העשרה של רקמת תבואה הניבו ייצור siderophore נמוך יחסית ללא קשר גנוטיפ.
העשרה של רקמת לירות Lewjain היה ייצור siderophore נמוך באופן משמעותי מאשר גנוטיפים אחרים, ו 725 לירות תרבות רקמה הביא ייצור siderophore משתנה יותר. ההבדל הגדול ביותר בפעילות siderophore נצפתה בתרבויות העשרה רקמת השורש שבו 725 היה יותר מ 200% פעילות siderophore גדול יותר מאשר כל genotypes אחרים. אחד ההיבטים הממיסויים ביותר של ביצוע הפרוטוקול הוא שמירה על תנאים ספיטיים תוך השלמת השלבים הרבים ליצירת מיקרופלסטיק אגר ברזל CAS ובדיקת דגימות עבור פעילות siderophore.
ניתן ליישם מגוון רחב של טכניקות מבוססות תרבות כרומטוגרפית או מבוססות דנ"א על באר המיקרוטיטר בפועל או על התרבות השתמרה גליצרול לבדיקות ביוכימיות נוספות או אפיון גנטי ומידול מטבולי. על ידי שימוש בפעילות siderophore פרוטוקול זה יכול להיות קשור מאוחר יותר עם אורגניזמים ספציפיים האחראים על פעילות זו או לאחר מכן ממוקד כמנגנון להשפעות אקולוגיות גדולות יותר. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות שונה כדי להעריך את ייצור siderophore בתרבויות העשרה שנוצר מדגימות שנאספו תאים סביבתיים אחרים כולל אוויר, מים, ומעים.
