הכנת דגימות תואמות ספקטרומטריית מסה באיכות גבוהה לניתוח פרוטאום מקיף של דגימות עינית היא קריטית כדי להבהר את המנגנונים המולקולריים ולסמן מסלולים המעורבים בבריאות ומחלות. זרימת העבודה המתוארת מייצגת גישה פשוטה אך חזקה לצעדי הכנה מחמירים מדגם קייטרינג במיוחד לניתוח של דגימות מוגבלות במסה כגון כלי דם מיקרו עינית. למרות שהמטרה העיקרית של המחקר היא להקים מתודולוגיה תואמת MS לכלי דם עיניים, זרימת העבודה המתוארת יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על דגימות שונות המבוססות על תאים ורקמות.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהזיהוי והבידוד של העורק האחורי הקצר שנבחר, או ענפי האגודה, יכולים להיות מאתגרים. עיני פורצ'ין טריות, יחד עם עצב הראייה ורקמות חוץ עיניות, התקבלו מבית המטבחיים המקומי מיד לאחר המוות. מניחים את כדור העין בתא ניתוח המכיל חיץ קרבס-הנסלייט קר כקרח.
חותכים בזהירות את השרירים והרקמות שמסביב עם זוג מספריים חדים של מאיו. לעשות חתך עם אזמל, לחתוך את הגלובוס לאורך מישור קו המשווה עם זוג מספריים מאיו חדה עד העין מופרדת לתוך החצאים הקדמיים האחוריים. הסר כמה שיותר גוף צנום מהמחצית האחורית של העין באמצעות זוג ממטרות דפוס סטנדרטיות.
לאחר שימוש סיכות ניתוח כדי להצמיד בזהירות את החצי האחורי של העין, בעדינות לחתוך את רקמות החיבור המקיפות את עצב הראייה, כדי לחשוף את כלי הדם רטרובולבר הבסיסי עם זוג מספריים האביב ואנה סטודנט. בודדו את העורק האחורי הקצר והדיסטלי יחד עם רקמות החיבור שמסביב עם זוג פינצטה מדויקת מסוג 5 ומספריים של Vannas capsulotomy. הסר בעדינות רקמות חיבור ממקטעי העורקים באמצעות פינצטה ומספריים עדינים במיוחד לפני שטיפת העורקים המבודדים ב- PBS קר כקרח כדי להסיר מזהמים ושאריות דם.
עורקי בריכה משתי עיניים כדי להשיג שכפול ביולוגי אחד, ולאחר מכן לשקול את הדגימות באמצעות איזון אנליטי. לכל צינור, מוסיפים תערובת של 0.5 ו 1 מילימטר תחמוצת זירקוניום חרוזים ואחריו בריאגנט מיצוי חלבון רקמה. עכשיו, לטעון את צינורות המדגם לתוך homogenizer בלנדר.
הגדר את שעון הזמן לשתי דקות, הגדר את רמת המהירות לשש והתחל הומוגניזציה. לאחר הריצה, בדוק את הדגימות עבור הומוגניזציה מלאה ולשמור דגימות על קרח בין כל ריצה. חזור על המחזור עד דגימות הם הומוגני לחלוטין.
בזהירות פיפטה הומוגנית לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה טריים. צנטריפוגה הדגימות ב 10, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה חלבונים מסיסים. בזהירות פיפטה supernatant המכיל את החלבונים מסיסים מבלי לגעת בשכבת גלולה, ולהעביר לתוך צינורות microcentrifuge טריים.
הוסף 200 microliters של חיץ מיצוי 2A וחמישה microliters של קוקטייל מעכב פרוטאז לכל דגימת גלולה. לאחר מכן, להשעות את גלולה מספר פעמים עם פיפטה. השתמש homogenizer קולי כדי הומוגניזציה לחלוטין את גלולה.
הגדר את משרעת ל 60 ומחזור לאחד. השתמש בדיקה עשוי טיטניום, אשר מתאים הומוגניזציה של דגימות עם כרכים קטנים. לטבול את החללית בתערובת חיץ גלולה וחילוץ על קרח, ולחץ על כפתור ההתחלה.
Sonicate את המדגם עד גושים גלולה הם הומוגני לחלוטין, השהיה במשך כמה שניות בין כל sonication. בדוק אם יש הומוגניזציה מלאה באופן חזותי. מערבבים את homogenate מספר פעמים עם פיפטה כדי להבטיח כי אין גושים.
השתמש בהתקני סינון צנטריפוגליים עם ניתוק של שלושה קילודלטון עבור הליך זה. הכנס את יחידת מסנן החיתוך של שלושה קילודלטון לצינור מיקרוצנטריפוגה. פיפטה 200 מיקרוליטרים של הומוגנט מדגם למכשיר סינון אחד, ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של מים deionized לאותו מסנן.
לאחר מכסה אותו בבטחה, למקם את יחידת הסינון לתוך צנטריפוגה, ולסובב במשך 14, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, יש להפריד את יחידת הסינון המכילה את ריכוז הדגימה מצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל את הסינון, ולהשליך את הסינון. מכוננים מחדש את הריכוז על ידי הוספת 400 מיקרוליטרים של מים deionized ליחידת הסינון.
לאחר סינון חוזר שלוש פעמים, בזהירות pipette המדגם ניקה להתרכז לתוך microtube נקי. הכינו את הדגימות לאלקטרופורזה חד מימדית של ג'ל כמפורט בפרוטוקול הטקסט, וערבבו היטב עם פיפטה. מחממים את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס בתנור בלוק יבש במשך 15 דקות, ומצננים לטמפרטורת החדר.
טען בזהירות 50 מיקרוגרם של דגימה לכל נתיב באמצעות פיפטה, כמו גם את תקן החלבון prestained כסמן מסה מולקולרית. הפעל את הג'לים במשך כ 60 דקות במתח קבוע של 175 וולט. בסוף הריצה, מוציאים בזהירות את הג'ל מצלחת הקלטת בעזרת סכין ג'ל, ומעבירים את הג'ל לקופסת כתמי ג'ל.
בצע תיקון וכתמים של הג'ל כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לנער את הג'לים בתסיכת הכתמים בן לילה לקבלת התוצאות הכוללות הטובות ביותר. בזהירות decant את פתרון הכתמים ולהחליף עם 200 מיליליטר של מים deionized לפני לנער את הג'לים לפחות שבע עד שמונה שעות במים כדי לנקות את הרקע.
יש לפזר את רצועות החלבון מהסמל בעזרת להבי מיקרוטום חדשים ונקיים. חותכים את הרצועה לחתיכות קטנות, ומעבירים בזהירות את חתיכות הג'ל לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון destaining המכיל 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט ואצטוניטריל.
הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, עם רעידות מדי פעם. בזהירות pipette את הפתרון destaining. בדוק ויזואלית עבור כל צינורות עם כתם שיורית, ולחזור על שלב זה אם חתיכות ג'ל עדיין מוכתמים כחול.
הוסיפו כ-400 מיקרוליטרים של תותב DTT טרי, ודגירה ב-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר השלכת הפתרון המפחית עם פיפטה, מוסיפים כ-400 מיקרוליטרים של תט"א טרי, ומטגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הסר את מאגר alkylating עם פיפטה ולהשליך.
מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אצטוניטריל מסודר בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות, עד שפיסות הג'ל מתכווצות והפכו אטומות. פיפטה את האצטוניטריל, ומייבש אוויר את חתיכות הג'ל במשך חמש עד עשר דקות מתחת למכסה המנוע. לאחר מכן, פיפטה 50 microliters של פתרון טריפסין לתוך כל צינור כדי לכסות לחלוטין את חתיכות ג'ל, ו דגירה הצינורות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר 30 דקות, להוסיף נפח מספיק של חיץ טריפסין כדי לכסות לחלוטין את חתיכות ג'ל במידת הצורך. דגירה הדגימות לילה ב37 מעלות צלזיוס. כדי לבצע מיצוי פפטיד, בזהירות pipette פתרון פפטיד שחולצו מן הצינורות ולהעביר microtubes נקי.
יבש את העל-טבעי באידוי ואקום צנטריפוגלי. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי לכל צינור עם חתיכות ג'ל, ו דגירה במשך 30 דקות עם רעידות. פיפטה העל-טבעית לאותם מיקרו-צינורות המכילים את הפפטידים המופקים לפי הלהקות שלהם, ומתייבשת בצנטריפוגה ואקום.
המשך לטיהור פפטיד וניתוחי כרומטוגרפיה-אלקטרוספריי נוזליים MS/MS כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכמות הכוללת של חלבונים בדגימות שחולצו עם כל סוג של חומר ניקוי מתואר כאן. התשואה הגבוהה ביותר הגיעה מרקמות שחולצו עם מאגר מיצוי חלבון רקמה, ואחריו DDM, CHAPS, ASB-14, ואת התשואה הנמוכה ביותר מ ACN ו TFA.
באופן עקבי, סך החלבונים שזוהו היו גם הגבוהים ביותר במאגר מיצוי החלבון הרקמה שחולץ מדגם, ועקבו אחר אותה מגמה כמו התשואה הכוללת. מוצג כאן הוא ההשוואה של פרופילי חלבון אלקטרופורזה ג'ל ממד אחד של האגודה, לפני ואחרי להיות נתון לצעדי הכנה וניקוי מדגם אופטימיזציה. בסך הכל, רמה גבוהה של מריחה והפרדה לקויה של רצועות החלבון נצפתה בנתיב שלוש.
פרופיל זה מדגים כי הדגימות עשויות להכיל reagent החילוץ, וגם מזהמים כגון שומנים ופסולת הסלולר. עם זאת, דגימות האגודה שהופרדו לתוך על טבעי גלולה, ולאחר מכן נתון לפרוטוקול אופטימיזציה, הביא פרופילי אלקטרופורזה ג'ל חד מימדי למופת. השיטה הממוטבת להפקת חלבונים מהירה, חזקה ויעילה ממיקרובוסלים עיניים יכולה להיות מיושמת בקלות גם על דגימות אחרות המבוססות על רקמות.
מוצגים כאן פרופילי חלבון של העל-טבעי והכדור של דגימות מוח מורין ורקמות לב. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחשוף את הדגימות כדי להשלים הומוגניזציה, להפריד את supernatant מן גלולה, ולהסיר את מזהמים ואת reagents החילוץ. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום רפואת העיניים הניסיונית והתרגומית לחקור ביסודיות את הפרוטומה של כלי הדם האונקולוגיים באמצעות עיני החזיר כמודל.
