חיפושית עץ משטח הגוף שלהם תמיד קשה ב- SEM. Tween-20 מתווסף פתרון תיקון וכביסה. משטח הגוף של חיפושית עץ ב TEM, Tween-20 יכול לשפר חדירה קיבוע לתוך קיר הגוף טוב יותר לתקן רקמות ואיבר בגוף.
מיקרוסקופ הפלואורסצנטי מסייע בשיפור דיוק ההיתוק. הטכניקה מסייעת לשטיפת משטח הגוף וחדירה לקיר הגוף חיפושית העץ. לכן, זה ינקה את ראיית SEM ו- TEM.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מועיל לשיפור דיוק ה חיתוך ב- TEM. הדגמת ההליך תהיה ג'אנג יארו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. באזור שבו כלורופורוס קרגנה לחיות, למקם מלכודות שדה פיתיון עם מושך צמחים כגון איזופורון על מלכודת משפך.
משוך מבוגרים חיפושית עץ לתוך המלכודות. שמרו על גופם הנקי של כלורופורוס קרגאנה הבוגרת ב-0.1 שומה לליטר PBS ב-pH 7.2, במשקל של 2.5% לפי נפח glutaraldehyde ונפח של 0.06% לפי נפח Tween-20. לתקן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים.
מוציאים את הגופות מנוזל השימור ושטיפת PBS. תחת מיקרוסקופ סטריאו, להשתמש במטליות כדי להסיר את התוספות ולנקות אותם באולטרסאונד ב 40 קילוהרץ ב PBST. לאחר הניקוי למשך 100 שניות, מעבירים את הדגימה למיקרוסקופ כדי לבדוק אם היא נקייה.
אין לנקות יותר מ-400 שניות כדי למנוע נזק. ואז לטבול את הדגימות באתנול בסדרה של ריכוזים במשך 20 דקות כל לבצע התייבשות. לאחר ההתייבשות, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בקלטת דבק דו-צדדית פחמן כדי לתקן בנפרד שלושה משטחי תצפית, הגב, הגחון, וצדדי, על גבי ספחים.
ודא שכל משטחי הצפייה נשמרים נקיים ונקיים מזיהום. מניחים את שלב הדגימה בצלחת פטרי המכילה יומר ג'ל סיליקה למשך 48 שעות. לאחר מכן, על מכשיר sputtering יון, לסובב את השסתום הראשי למיקום פתוח, להסיר את כיסוי תא המדגם ולשים את המדגם לתוך התא.
הפעל את מתג ההפעלה וודא שהאור מוכן. קבע את זמן ההתכה כ-45 שניות ואת עובי הציפוי כ-70.875 אנגסטרום. לאחר אינדקס חיוג ואקום משאבה מכני יורד מתחת לשבע, לחץ פריקה ולהתחיל ריסוס פלטינה.
בסוף ההליך, לכבות את אספקת החשמל ולקחת את הדגימה מחוץ לתא. לחשב את עובי סרט ספריי D ב אנגסטרום שווה K פעמים אני פעמים V פעמים T.K הוא קבוע שנקבע על ידי מתכת וגז sputtered. אני זרימת הפלזמה במיליאמפר בעוד V הוא המתח המוחל בקילו-וולט ו- T הוא הזמן בשניות.
הכנס את ה- Stub המכיל את הדגימה לשלב ה- SEM. ודא שלב הדגימה עם ה- Stub לדוגמה יש מספיק גובה כדי לאפשר תמונה טובה. פתח את תוכנת SEM ובחר את מתח ההפעלה הרצוי החל מ- 20 קילו-וולט.
לאחר קבלת התוספות מן הבוגר כלורופורוס caragana, לשטוף את הדגימות PBST באמבטיה קולית במשך שלוש שעות ולאחר מכן לאחר לתקן אותם 1% משקל לפי נפח osmium tetroxide ב PBS במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס. ייבש את הדגימות באמצעות טיפולים רצופים של 20 דקות בנפח של 50%60%70%80%85%90%95%100%ונפח של 100% לפי אתנול נפח בטמפרטורת החדר. עם מדפים, להחיל שף מחומם בתבנית הטבעה שטוחה להטמיע את הדגימות ברשף.
ודא כי המדגם נמצא בתחתית הצלחת והניח קרוב ככל האפשר לקצה החריץ שקוע. תווית ולאחר מכן דגירה את הצלחת המכילה את המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. לאחר הדגירה, מוציאים את הצלחת מהחמה ומוודאים שהשרף עבר פולזמרציה.
לאחר שהדגימה התגבשה, מניחים כל בלוק שרף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מזיזים את מקור האור הפלואורסצנטי של המיקרוסקופ כדי להקרנת המדגם באור כחול מלמעלה ולצלם אותם. ודאו שהנסילה בבלוק האם נראית בבירור. למדוד את המרחק בין הקצה של בלוק שף ואת חיישן היעד כדי למקד את sensilla.
עיין בתדמית SEM של החיוכים וגזור בערך את בלוק שרף עם סכין גילוח קרוב לקולטן היעד. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של אור כחול, התאימו את מקור האור מלמעלה כך שהנסילה נצפתה בבירור. מוסיפים את המיקרומטר האובייקטיבי לשלב המיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
צלם את בלוק שף לחתוך בערך ולאחר מכן באמצעות ImageJ למדוד את המרחק בין היעד ואת קצה של שף. מניחים את דגימת הרף על אולטרה מיקרוטום וחותכים 50 עד 60 ננומטר עבה חלקים עד מיקום היעד הגיע. הר את החלקים על 100 רשתות נחושת מצופות formvar במנות פטרי.
הכתם את הרשתות בתווית מסוננת רוויה של אצטט אורניל בטמפרטורת החדר. מכסים את החלקים במהלך הכתמים כדי לחסום משקעים הנגרמים על ידי אור. כתם במשך 10 דקות.
במכסה המנוע של האדים, יש לשטוף פעמיים ב-50% מתנול, ואז פעמיים במים מסוננים. מניחים טיפות של כתם ציטראט עופרת מוכן על הריבועים של מנות פטרי פלסטיק ולתת להם לשבת במשך שמונה דקות. יש לשטוף במים מסוננים מיגאסים ויבשים.
תן את הרשתות לשלב לדוגמה בתוך מחשב TEM. הגדר את המתח ל 80 קילו-וולט ולבחון את החלקים. בפרוטוקול זה, באמצעות ניקוי פתרון תיקון עם Tween-20, תמונת SEM ברורה נצפתה יותר מזה ללא Tween-20.
עם פתרון תיקון Tween-20 המאפשר פתרון תיקון glutaraldehyde לחדור את הרקמה, מבנים microtubule נראו בבירור בתדמית TEM בעוד המבנה הפנימי של המדגם מוכן ללא Tween-20 היה מטושטש. השקפות חתך מתמשך של היתד של סוג אחד sensilla twig basiconica על palps maxillary הראה כי נדן דנדריטי הקיף את הקטעים הדנדריטיים החיצוניים והרחיב את הנקבובית קצה. שבעה מקטעים דנדריטיים החיצוניים ללא מים היו קיימים בתוך חלל הלימפה של הקולטן הפנימי שהיה מוקף בחלל החיצוני.
הגוף הצינורי הופרד על ידי נדן דנדריטי ממקטעים דנדריטיים חיצוניים אחרים בכל בסיס שקע סנסילארי. באזור ciliary, שמונה דנדריטים בקטרים שונים זוהו המציין את נוכחותם של שמונה נוירונים דו קוטביים. הטכניקה יכולה לשמש כדי להמשיך לחקור את הפונקציה של עצבים כגון הקלטת תא יחיד או היברידיות situ.
