באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

בהתחשב בתפקיד המתעוררים של מיקרוביום המעיים במחלות אנושיות שונות, מספר אפנן מיקרוביום המעיים כמו פרוביוטיקה, פרה-ביוטיקה, דיאטות ותרופות יכול לעזור בהשראת מחלות בריאות הקשורות למיקרוביום במעיים. עם זאת אין מערכת סינון מהירה ובמחיר סביר זמינים כדי לחזות את ההשפעות של אפנוני מיקרוביום המעיים כאלה, אבל מערכת זו היא פשוטה מספיק כדי לחזות כיצד התערבויות מסוימות יכולות להשפיע על מיקרוביום המעיים שבסופו של דבר יכול להשפיע על בריאות המארח. פרוטוקול זה הוא פשוט, סביר ומעשי עבור מעבדות לחקור את אפנוני המיקרוביום במעיים ואת ההשפעות שלהם על microbiota ובריאות המארח.

תחזוקה של תנאים אספטיים ואנאירוביים חיונית לניסוי זה. כמו כן יש להשתמש בדגימה הצואה מחדש, מיד עם איסוף. אחרת אם הניסוי מתוכנן מאוחר יותר, המדגם צריך להיות מאוחסן במינוס 80 מיד עם איסוף, ללא כל חשיפה לטמפרטורת הסביבה ואוויר.

טיפול בדיוק במהלך הכנת aliquot וצנרת חשוב גם לשמירה על דיוק ושחזור. זה ייקח פחות מ -12 שעות בשעות היום. אנחנו יכולים לבנות תרבות בן לילה אם הם צריכים את הדגימות ב24 שעות.

לאחר מכן, ואחריו חומצות שומן קצרות שרשרת ונחישות המיקרוביום. את התהליך הזה יפגינו שני תלמידי יוני גדולים, שוקו אחמדי ורבינה מינלי מהמעבדה שלי. להכנת מדיית תסיסה מתחת למכסה המנוע של אדים, בבקבוק ריאגנט על תערובת מגנט, יש לערבב פתרון A, פתרון B, פתרון מינרלי קורט, תותב ויטמין מסיס במים, תותב ביוטין חומצה פולית, פתרון ריבופלבין, פתרון המין, תערובת חומצות שומן קצרות שרשרת ורסזורין.

לאחר מכן מוסיפים לתוך תמצית שמרים בקבוק, נתרן קרבונט, ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט, טריפטיקאז. הוסף 296.1 מיליליטר של מים מזוקקים, להתאים את ה- pH עם הידרוכלוריד נורמלי אחד או נתרן הידרוקסיד כדי להבטיח שזה סביב 7.0. העבר את המיקרו-מטר לתחנת עבודה אספטית, ולהשתמש במסנן ואקום עם גודל נקבובית ב- 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את המדיה לחיטוי.

כדי להכין פתרון דילול אנאירובי ליטר אחד, להמיס חמישה גרם של נתרן כלורי, שני גרם של גלוקוז, ו 0.3 גרם של ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראקט במים מיוינים. יש לאחסן אותו בתוך התא האנארובי ב-121.1 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לפני תחילת ניסוי התסיסה, שמרו את כל החומרים, הפתרונות והכלים הדרושים לניסוי התסיסה בתוך התא האנארובי למשך 48 שעות לפחות, כדי להבטיח שכל שאריות החמצן יוסרו.

לפחות 24 שעות לפני ניסוי התסיסה, שוקלים 300 מיליגרם אינולין, ומעבירים אותו לצינור 50 מיליליטר, אשר ממוקם לאחר מכן בתוך התא האנירובי. הוסף 26 מיליליטר של מדיה תסיסה מעורקת לתוך הצינור, ומערבולת לערבב. אפשר הידרציה של סיבים במשך כ 24 שעות.

ביום של ניסוי התסיסה, להכין inoculum צואה. ראשית, לשקול חמישה גרם של מדגם צואה טרי בצינור חרוט 50 מיליליטר. הוסף פתרון דילול אנאירובי לצינור כדי להגיע לנפח סופי של 50 מיליליטר.

מערבולת במשך 15 דקות, או עד הומוגני לחלוטין. שמור את הצינורות מחוסנים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך התא אנאירובי, ולהפוך בעדינות פעם בשעה כדי לעכל מחדש את הסיבים ואת inoculum. לאחר שלוש, שש, תשע או 24 שעות, להוציא את הכמות הנכונה של מדיה מותססת, צנטריפוגה הדגימות ב 14, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

מיד להקפיא את supernatant ו גלולה בחנקן נוזלי, ולאחר מכן לאחר הקפאת הצמד, לאחסן את supernatant לניתוח חומצות שומן קצר שרשרת, ו גלולה לניתוח מיקרוביום, במינוס 80 מעלות צלזיוס. פרוטוקול זה משמש להדגמת ההשפעה של פרה-ביוטיקה ספציפית. הצואה של נבדקים אנושיים בריאים, לאחר טיפול עם אינולין, הראה pH יציב יחסית במשך תשע שעות, בעוד ירד באופן דרמטי לאחר 24 שעות.

החיסון של אינולין הגדיל באופן משמעותי את רמות חומצות השומן קצרות השרשרת לקטט בדגימה צואה שטופלו אינולין מושווה לתרבות microbiota צואה לא מטופלים. ניתוח קואורדינטות ראשי מראה הרכב מיקרוביוטה שונה לאמצעי UniFrac משוקלל ולא משקל של גיוון בטא בין אינולין מטופל דגימות מטופלות. מדדים של גיוון אלפא לעומת מגוון פילוגנטי באמצעות עץ שלם PD, עושר מינים, יחידות אירונומיות תפעוליות, שווה מינים, כמו גם שפע יחסי של פילה וג'נה מרכזיים, כולם מציגים חתימות microbiota מעיים שונים בין אינולין מטופל דגימות מטופלות.

cladogram אטיונומית, נגזר ניתוח גודל אפקט מפלה ליניארי של רצפי 16S, מייצג את המסה בשפע דיפרנציאלי בין קבוצות שונות של דגימות. בצע את כל השלבים בזהירות. הדבר החשוב ביותר הוא לשמור על תנאים אספטיים ואנאירוביים קפדניים.

העל-טבעי ומהניסוי יכול לשמש לטיפול בשינויים ברמת חומצות השומן בשרשרת קצרה כתוצאה מהתסיסה המבוססת על סיבים. בנוסף, גלולה יכול לשמש לניתוח השינויים בהרכב המיקרוביום במעיים. כמה כימיקלים המשמשים להכנת תקשורת התרבות עלולים להיות מסוכנים.

נא את גיליון MSDS ולנקוט אמצעי זהירות בהתאם.