כתב יד זה נתמך על ידי R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ו-R01HD105301 (MG) מהמכונים הלאומיים לבריאות, מענק יוזמת צ'אן צוקרברג 2022-316749 (MG), פרס קריירה מוקדמת של קרן המחקר Thrasher Research Fund (LCF), מענק חוקר קריירה מוקדמת של התפתחות ילדים של UNC (LCF) באמצעות תמיכתם הנדיבה של תורמים לאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

מודל Necrotizing Enterocolitis למחקרים מכניסטיים וגילוי תרופות

<ol>
	<li>Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+incidence+of+Necrotizing+Enterocolitis:+a+systematic+review+and+Meta-analysis.">Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis.</a> BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).</li><li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).</li><li>Frazer, L. C., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelium+in+early+life.">Intestinal epithelium in early life.</a> Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+2'-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine.">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li><li>Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Necrotizing+Enterocolitis.">A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis.</a> Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).</li><li>Afrazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+in+intestinal+crypts+induces+necrotizing+enterocolitis.">Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).</li><li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+is+expressed+on+intestinal+stem+cells+and+regulates+their+proliferation+and+apoptosis+via+the+p53+up-regulated+modulator+of+apoptosis.">Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).</li><li>Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+animal+models+for+the+study+of+necrotizing+enterocolitis.">The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis.</a> Disease models &amp; mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).</li><li>Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+and+necessity+of+using+animal+models+in+the+study+of+necrotizing+enterocolitis.">The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).</li><li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+necrotizing+enterocolitis:+pathophysiology,+translational+relevance,+and+challenges.">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).</li><li>Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+induction+of+experimental+necrotizing+enterocolitis+in+neonatal+mice.">A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice.</a> STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).</li><li>Egan, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4-mediated+lymphocyte+influx+induces+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).</li><li>Stanford, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+comparison+of+mouse+and+human+intestinal+development+using+epithelial+gene+expression+patterns.">A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns.</a> Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).</li><li>Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Collaborative+Cross:+A+Systems+Genetics+Resource+for+Studying+Host-Pathogen+Interactions.">The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions.</a> Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).</li><li>Ericsson, A. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiome+of+laboratory+mice:+considerations+and+best+practices+for+translational+research.">The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research.</a> Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+Enterocolitis:+Overview+on+In+Vitro+Models.">Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+a+pharmacokinetic-pharmacodynamic+(PK-PD)+model+on+a+chip.">A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip.</a> Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).</li><li>Sung, J. H., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro+cell+culture+analog+(microCCA)+with+3-D+hydrogel+culture+of+multiple+cell+lines+to+assess+metabolism-dependent+cytotoxicity+of+anti-cancer+drugs.">A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs.</a> Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Jang, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducing+human+and+cross-species+drug+toxicities+using+a+Liver-Chip.">Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip.</a> Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).</li><li>Chou, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+recapitulation+of+clinical+bone+marrow+toxicities+and+patient-specific+pathophysiology.">On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology.</a> Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies.">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+radiation+injury-induced+cell+death+and+countermeasure+drug+responses+in+a+human+Gut-on-a-Chip.">Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (2), 223 (2018).</li><li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro.">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+3D+neuromuscular+model+for+drug+screening+and+precision+medicine+in+neuromuscular+disease.">On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease.</a> Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Migration+Chip+for+Chemotaxis-based+Microfluidic+Selection+of+Heterogeneous+Cell+Populations.">Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations.</a> Scientific Reports. 5, 9980 (2015).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-chip:+Recreating+human+intestine+in+vitro.">Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro.</a> Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).</li><li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+device+facilitates+in+vitro+modeling+of+human+neonatal+necrotizing+enterocolitis-on-a-chip.">Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip.</a> JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).</li><li>Emulate. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Duodenum Intestine-Chip Protocol. , (2022).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactobacillus+rhamnosus+HN001+decreases+the+severity+of+necrotizing+enterocolitis+in+neonatal+mice+and+preterm+piglets:+evidence+in+mice+for+a+role+of+TLR9+.">Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 .</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Dilutions+and+Plating:+Microbial+Enumeration.">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> JoVE. , (2023).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים הקשורים לכתב יד זה.

מערכת NEC-on-a-chip זו היא כלי חדש רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי למדל את הפתופיזיולוגיה של NEC. פלטפורמה זו מספקת מיקרו-סביבה מורכבת הדומה יותר לסביבת המעי in vivo מאשר דגמים קודמים על ידי שילוב מערכת תרבות משותפת עם זרימה ומתיחות לומינליות רציפות. התנאים האלה מקדמים את התפתחותה של ארכיטקטורה תל?...

Necrotizing enterocolitis (NEC) משפיע על פגים, עם שכיחות של עד 10% אצל אלה שנולדו במשקל < 1500 גרם1. הפתופיזיולוגיה של NEC מורכבת וכוללת נזק לאפיתל המעי, הפרעה בצמתים הדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, חוסר ויסות חיסוני ומוות תאי אפיתל 2,3. הבנתנו את המנגנונים המעורבים בפתוגנזה של NEC נותרה חלקית, ולמרות עשרות שנים של מחקר, עדיין אין טיפולים ממוקדים יעילים.
חסם משמעותי לקידום מחקר ה-NEC הוא הזמינות המוגבלת והגודל הקטן של רקמת המעי הראשונית שבודדה מתינוקות אנושיים. רקמת מעי שנכרתה מתינוקות עם NEC היא לעתים קרובות נמקית ופגומה קשות, מה שמסבך מחקרים על מנגנונים שמקדימים את הופעת המחלה. לדוגמה, המעי הדק של תינוקות עם NEC מוצף בתאי מערכת החיסון, ומספר מופחת של תאי גזע במעי, ירידה בשגשוג תאי אפיתל ואפופטוזיס מוגבר של תאי אפיתל נצפים גם הם 4,5,6,7. זה מוביל לקשיים בגידול תאי אפיתל מעיים מדגימות אלה ובבידוד RNA וחלבונים, שיכולים להתפרק בסביבה דלקתית עוינת זו. בנוסף, מכיוון שתהליך המחלה כבר מתקדם בתינוקות עם NEC ניתוחי, מחקרים מכניסטיים על גורמים הגורמים למחלה אינם ישימים. מגבלות אלה הובילו להסתמכות על מודלים של בעלי חיים למחקרים מכניסטיים של NEC.
מודלים של בעלי חיים של NEC הוקמו עבור עכברים, חולדות, חזרזירים, ארנבות ובבונים 5,8,9,11. חוזק של מודלים של בעלי חיים הוא שמחלת מעיים דמוית NEC נגרמת על ידי גורמים הקשורים להופעת NEC בבני אדם, כולל מיקרוביום דיסביוטיקה, אפיזודות חוזרות ונשנות של היפוקסיה, והיעדר חלב אם מזין 5,8,10,11. בנוסף, התגובה הדלקתית והשינויים הפתולוגיים שנצפו במהלך ניסוי NEC מקביל למחלה אנושית 5,9,12. בעוד מודלים אלה מחקים רבים מהמאפיינים של NEC אנושי, ישנם הבדלים מובנים בין הפתופיזיולוגיה של NEC בבעלי חיים ובבני אדם. לדוגמה, מודל מורין של NEC מושרה בעכברים שנולדו לטווח מלא, ולמרות שהתפתחות המעי שלהם אינה שלמה, הפתופיזיולוגיה של NEC שונה מטבעה בהקשר קליני זה. ביטוי גנים במעי מורין בלידה דומה לעובר אנושי בר קיימא ואינו מתקרב לזה של פג בהריון של 22-24 שבועות עד היום ה-14 (P14)13. זה מבלבל את מודל NEC מורין מכיוון שבדרך כלל לא ניתן לגרום לפגיעה במעיים בעכברים לאחר P10. בנוסף, זנים גזעיים של עכברים חסרים את המגוון החיסוני14 והמיקרוביולוגי של יילודים אנושיים15, המשמש גורם מבלבל נוסף. לפיכך, שילוב מוגבר של דגימות אנושיות ראשוניות במחקר NEC משפר את הרלוונטיות הקלינית של מחקרים בתחום זה.
מחקרים על המנגנונים של NEC במבחנה השתמשו באופן מסורתי בשורות תאים מונוטיפיים שמקורם בתאי סרטן מעיים בוגרים, כגון אדנוקרצינומה של המעי הגס (Caco2) ותאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי (HT-29)16. מודלים אלה נוחים אך מוגבלים ברלוונטיות הפיזיולוגית שלהם בשל גדילתם מתאי סרטן בוגרים, ארכיטקטורה לא מקוטבת ושינויים פנוטיפיים הקשורים למעברים חוזרים ונשנים בתרבית. אנטרואידים במעיים משפרים מודלים אלה מכיוון שניתן לגדל אותם מהקריפטות של רקמת המעי, להתמיין לכל תת-סוגי אפיתל המעי, וליצור מבנה תלת ממדי (3D) דמוי וילוס17,18,19,20. לאחרונה, אנטרואידים במעי שולבו עם טכנולוגיה מיקרופלואידית כדי לפתח מודל מעי דק על שבב ולספק מערכת מודל במבחנה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית21.
המכשירים המיקרופלואידים הראשוניים של איבר על שבב הוצגו בתחילת שנות ה-200022,23,24. המודל הראשון של איבר על שבב היה ריאות על שבב25. אחריו הופיעו מודלים רבים של איברים בודדים כגון מעי 21, כבד 26, כליות 27, מח עצם 28, מחסום דם-מוח 29 ולב30. מודלים אלה של איבר על שבב שימשו לחקר מחלות חריפות, כרוניות ונדירות, כולל תסמונת קרינה חריפה,31 מחלת ריאות חסימתית כרונית,32 ומחלות נוירודגנרטיביות 33. האופי המקוטב של התאים על שבבים אלה ונוכחותם של שני תאי תאים המופרדים על ידי קרום נקבובי מאפשר מידול של תהליכים פיזיולוגיים מורכבים כגון זילוח, שיפועי ריכוז כימיים וכימוטקסיס34,35 של תאי מערכת החיסון. מערכות מיקרופלואידיות אלה מספקות אפוא כלי חדש לחקר הפתופיזיולוגיה והמנגנונים של מחלות אנושיות.
מודל המעי הדק על שבב תואר על ידי Kasendra et al. בשנת 2018, שהשתמשו בדגימות ביופסיה של מעי דק ילדים (גילאי 10-14) שהתמיינו לאנטרואידים וגודלו בתרבית במכשיר מיקרופלואידי21. תאי אנדותל של כלי הדם, זרימת מדיה רציפה ומתיחה/הרפיה שולבו גם הם במודל זה. הם צפו בהתמיינות תת-סוג אפיתל במעי, היווצרות צירים תלת-ממדיים דמויי וילוס (villus), ייצור ריר ודפוסי ביטוי גנים במעי הדק21. מודל מיקרופלואידי זה יושם על מחלות יילודים עם פיתוח מערכת NEC-on-a-chip, המשלבת אנטרואידים של מעיים בילוד, תאי אנדותל ואת המיקרוביום מיילוד עם NEC36. NEC-on-a-chip משחזר רבים מהמאפיינים הקריטיים של NEC אנושי, כולל ביטוי גנים דלקתיים, אובדן תאי אפיתל מיוחדים ותפקוד מופחת של מחסום המעי36. לפיכך, למודל זה יש יישומים רבים בחקר NEC, כולל מחקרים מכניסטיים וגילוי תרופות. בכתב יד זה מסופק פרוטוקול מפורט לביצוע מודל NEC-on-a-chip.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, serum free (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Bio-kit</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>&#160;7131000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td>759085D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Opus Real-Time PCR Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12011319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1 Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TC-treated Multiple Well Plates,&#160; 48 well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit&#160;</td>
			<td>Cell Biologics</td>
			<td>H-1168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;D7132</td>
			<td>Permeability dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M,&#160; pH 8.0</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-1 surface activation reagent</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ER-1</td>
			<td>Chip Activation Reagent 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-2 surface activation reagent&#160;</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ER-2</td>
			<td>Chip Activation Reagent 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Petri Dishes with Clear Lid, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-Based Coating Solution&#160;</td>
			<td>Cell Biologics</td>
			<td>6950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie Temp-Shaker 300</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td>SI-G300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Collagen Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CC050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Cell Biologics</td>
			<td>H-6054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-000-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (LB) agar, Miller</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>L3027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Cells&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Cell Culture Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1009005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAILSTAR UV LAMP</td>
			<td>NailStar</td>
			<td>NS-01-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop OneC&#160;Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-274200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1 Hub Module</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>047392.9L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips TR LTS 1000&#181;L S 768A/8</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod Portable Module</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)&#160;</td>
			<td>Avantor Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>205313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers, 70um</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes, 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight, fine, sharp point scissors</td>
			<td>Miltex&#160;Instruments</td>
			<td>MH5-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75016052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 &#177; 0.5</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Enzymatic Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-998-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235;-CM1 Culture Module</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model of necrotizing enterocolitis incorporating human neonatal intestinal enteroids and a dysbiotic microbiome

Necrotizing enterocolitis (NEC) היא מחלת מעיים חמורה וקטלנית שקשה לחקור בשל הפתוגנזה המורכבת שלה, שנותרה מובנת לחלוטין. הפתופיזיולוגיה של NEC כוללת הפרעה בצמתים ההדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, מוות של תאי אפיתל, דיסביוזיס מיקרוביאלי ודלקת לא מווסתת. הכלים המסורתיים לחקר NEC כוללים מודלים של בעלי חיים, קווי תאים ואורגנואידים של מעיים אנושיים או עכברים. בעוד שמחקרים המשתמשים במערכות מודל אלה שיפרו את הבנת התחום של פתופיזיולוגיה של מחלות, יכולתם לשחזר את המורכבות של NEC אנושי מוגבלת. כעת פותח מודל משופר במבחנה של NEC בטכנולוגיה מיקרופלואידית, בשם NEC-on-a-chip. מודל NEC-on-a-chip מורכב ממכשיר מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם ביילוד מוקדם, בתרבית משותפת עם תאי אנדותל אנושיים ובמיקרוביום מתינוק עם NEC חמור. מודל זה הוא כלי רב ערך למחקרים מכניסטיים על הפתופיזיולוגיה של NEC ומשאב חדש לבדיקות גילוי תרופות למחלות מעיים בילוד. בכתב יד זה יסופק תיאור מפורט של מודל NEC-on-a-chip.

Necrotizing enterocolitis (NEC) affects preterm infants, with an incidence of up to 10% in those born weighing &#60; 1500 g1. The pathophysiology of NEC is complex and includes damage to the intestinal epithelium, disruption of intestinal tight junctions, increased gut barrier permeability, immune dysregulation, and epithelial cell death2,3. Our understanding of the mechanisms involved in the pathogenesis of NEC remains incomplete, and despite decades of research, there are still no effective targeted therapies.
A significant barrier to advancing NEC research is the limited availability and small size of primary intestinal tissue isolated from human infants. Intestinal tissue resected from infants with NEC is often necrotic and severely damaged, which complicates studies into mechanisms that precede disease onset. For example, the small intestine of infants with NEC is inundated with immune cells, and a reduced number of intestinal stem cells, decreased epithelial cell proliferation, and increased epithelial cell apoptosis are also observed4,5,6,7. This leads to difficulties in culturing intestinal epithelial cells from these samples and in isolating RNA and proteins, which can be degraded in this hostile inflammatory environment. Additionally, since the disease process is already advanced in infants with surgical NEC, mechanistic studies into factors that induce disease are unfeasible. These limitations have led to a reliance on animal models for mechanistic studies of NEC.
Animal models of NEC have been established for mice, rats, piglets, rabbits, and baboons5,8,9,11. A strength of animal&#160;models is that NEC-like intestinal disease is induced by factors associated with NEC onset in humans, including a dysbiotic microbiome, repeated episodes of hypoxia, and the absence of breast milk feeds5,8,10,11. In addition, the inflammatory response and pathologic changes observed during experimental NEC parallel human disease5,9,12. While these models mimic many of the features of human NEC, there are inherent differences between the pathophysiology of NEC in animals and humans. For example, the murine model of NEC is induced in mice born full-term, and although their intestinal development is incomplete, the pathophysiology of NEC is inherently different in this clinical context. Murine intestinal gene expression at birth is similar to a pre-viable human fetus and does not approximate that of a preterm neonate of 22-24 weeks gestation until day 14 (P14)13. This confounds the murine NEC model because intestinal injury cannot generally be induced in mice after P10. In addition, inbred strains of mice lack the immunologic14 and microbiologic diversity of human neonates15, which serves as another confounding factor. Thus, increased incorporation of primary human samples into NEC research improves the clinical relevance of studies in this field.
Studies into the mechanisms of NEC in vitro have traditionally utilized monotypic cell lines derived from adult intestinal cancer cells, such as colorectal adenocarcinoma (Caco2) and human colon adenocarcinoma (HT-29) cells16. These models are convenient but limited in physiologic relevance due to their growth from adult cancer cells, non-polarized architecture, and phenotypic changes related to repeated passages in culture. Intestinal enteroids improve upon those models since they can be grown from the crypts of intestinal tissue, differentiated into all intestinal epithelial subtypes, and form a three-dimensional (3D) villus-like structure17,18,19,20. Recently, intestinal enteroids have been combined with microfluidic technology to develop a small intestine-on-a-chip model and provide a more physiologically relevant in vitro model system21.
The initial organ-on-a-chip microfluidic devices were introduced in the early 2000s22,23,24. The first organ-on-a-chip model was the human breathing lung-on-a-chip25. This was followed by numerous single-organ models such as intestine21, liver26, kidneys27, bone marrow28, blood-brain barrier29, and heart30. These organ-on-a-chip models have been used to study acute, chronic, and rare diseases, including acute radiation syndrome,31 chronic obstructive pulmonary disease,32 and neurodegenerative diseases33. The polarized nature of the cells on these chips and the presence of two cellular compartments separated by a porous membrane allows for the modeling of complex physiologic processes such as perfusion, chemical concentration gradients, and immune cell chemotaxis34,35. These microfluidic systems thus provide a new tool for studying the pathophysiology and mechanisms of human disease.
The small intestine-on-a-chip model was described by Kasendra et al. in 2018, who utilized pediatric (ages 10-14 years old) small intestinal biopsy specimens differentiated into enteroids and cultured on a microfluidic device21. Vascular endothelial cells, continuous media flow, and stretch/relaxation were also incorporated into this model. They observed intestinal epithelial subtype differentiation, formation of 3D villus-like axes, mucus production, and small intestinal gene expression patterns21. This microfluidic model was applied to neonatal disease with the development of the NEC-on-a-chip system, which incorporates neonatal intestinal enteroids, endothelial cells, and the microbiome from a neonate with NEC36. NEC-on-a-chip recapitulates many of the critical features of human NEC, including inflammatory gene expression, loss of specialized epithelial cells, and reduced gut barrier function36. Thus, this model has numerous applications in the study of NEC, including mechanistic studies and drug discovery. In this manuscript, a detailed protocol for the performance of the NEC-on-a-chip model is provided.

Author Spotlight: שיפור אסטרטגיות הבנה וטיפול באמצעות מודל NEC-on-a-Chip 

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

Research in this field is challenging because the pathophysiology of necrotizing enterocolitis is complex, and this complexity is not reflected in many commonly used in vitro models. Studies using human samples are often limited by small sample volumes and the rarity of samples obtained at the time of intestinal surgery. Our goal is to determine the mechanisms that lead to the development of NEC in preterm infants and to identify new treatment strategies.The NEC-on-a-Chip system improves upon previous models by more closely reflecting the physiology of the neonatal intestine. In this model, we combine patient-derived intestinal organoids, endothelial cells, and the microbiome from a neonate who had severe NEC onto the microfluidic chip.

אנטרואידים נזרעו על המכשיר המיקרופלואידי (איור 1) וגודלו בתרבית כפי שתואר לעיל. גדילת האנטרואידים במטריצת הידרוג'ל של תרבית תאים לפני הזריעה, ולאחר מכן ההתרחבות של חד-שכבה של תאי אפיתל המעי לאחר הזריעה, נוטרו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2). חד-שכבה חד-שכב...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Understanding and Treatment Strategies with the NEC-on-a-Chip Model at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, ...

המחקר בתחום זה מאתגר מכיוון שהפתופיזיולוגיה של אנטרוקוליטיס נמקית היא מורכבת, ומורכבות זו אינה באה לידי ביטוי במודלים נפוצים רבים במבחנה. מחקרים המשתמשים בדגימות אנושיות מוגבלים לעתים קרובות על ידי נפחי דגימה קטנים ונדירות הדגימות המתקבלות בזמן ניתוח מעיים. מטרתנו היא לקבוע את המנגנונים המובילים להתפתחות NEC בפגים ולזהות אסטרטגיות טיפול חדשות.מערכת NEC-on-a-Chip משפרת מודלים קודמים בכך שהיא משקפת באופן הדוק יותר את הפיזיולוגיה של המעי המולד. במודל זה אנו משלבים אורגנואידי מעיים שמקורם במטופלים, תאי אנדותל והמיקרוביום מיילוד שהיה לו NEC חמור על השבב המיקרופלואידי.

microfluidic-model-necrotizing-enterocolitis-incorporating-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome

933 Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. המחקר בתחום זה מאתגר מכיוון שהפתופיזיולוגיה של אנטרוקוליטיס נמקית היא מורכבת, ומורכבות זו אינה באה לידי ביטוי במודלים נפוצים רבים במבחנה. מחקרים המשתמשים בדגימות אנושיות מוגבלים לעתים קרובות על ידי נפחי דגימה קטנים ונדירות הדגימות המתקבלות בזמן ניתוח מעיים. מטרתנו היא ל?...

Video: Author Spotlight: שיפור אסטרטגיות הבנה וטיפול באמצעות מודל NEC-on-a-Chip 

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, which remains incompletely understood. The pathophysiology of NEC includes disruption of intestinal tight junctions, increased gut barrier permeability, epithelial cell death, microbial dysbiosis, and dysregulated inflammation. Traditional tools to study NEC include animal models, cell lines, and human or mouse intestinal organoids. While studies using those model systems have improved the field&#39;s understanding of disease pathophysiology, their ability to recapitulate the complexity of human NEC is limited. An improved in vitro model of NEC using microfluidic technology, named NEC-on-a-chip, has now been developed. The NEC-on-a-chip model consists of a microfluidic device seeded with intestinal enteroids derived from a preterm neonate, co-cultured with human endothelial cells and the microbiome from an infant with severe NEC. This model is a valuable tool for mechanistic studies into the pathophysiology of NEC and a new resource for drug discovery testing for neonatal intestinal diseases. In this manuscript, a detailed description of the NEC-on-a-chip model will be provided.

This protocol describes an in vitro model of necrotizing enterocolitis (NEC), which can be used for mechanistic studies into disease pathogenesis. It features a microfluidic chip seeded with intestinal enteroids derived from the human neonatal intestine, endothelial cells, and the intestinal microbiome of a neonate with severe NEC.

Microfluidic Necrotizing Enterocolitis-on-a-Chip Model for Studying NEC Pathophysiology

To begin, place the chip and chip carrier into the chip cradle located in a sterile tissue culture dish and keep it aside in the tissue culture hood while preparing the chip activation reagent. Add one milliliter of the CR2 solution to the vial containing CR1 powder. Transfer the solution from the vial to a 15-milliliter tube wrapped in aluminum foil.Repeat this process until four rinses and four milliliters of CR2 have been flushed through the CR1 vial. For the last rinse, cap the vial and invert it to remove residual powder. Next, add six milliliters of CR2 to the 15-milliliter tube containing CR1.Mix the final 10-milliliter solution with a pipette without introducing bubbles. Using a 200 microliter pipette tip, add 20 microliters of CR1 solution to the bottom channel inlet of the chip until the solution begins to exit the bottom channel outlet. Add 50 microliters of CR1 solution through the top channel inlet until the solution begins to exit the top channel outlet.Then, place the chips under ultraviolet light for 15 minutes. After exposure, remove any CR1 solution from the top and bottom channels. Wash both channels with 100 microliters of CR2 solution.Then, wash twice with 100 microliters of DPBS. Prepare the extracellular matrix solutions for the top and bottom channels of the chip. Add 50 microliters of extracellular matrix solution to the bottom channel inlet until the drop appears on the outlet.Then, add 50 microliters to the top channel inlet until the drop appears on the inlet. Add DPBS to the chip cradle reservoir. Place the lid on the plate and incubate the chips overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide incubator.The next day, flush the epithelial or top channel of the chip with 100 microliters of prewarmed chip expansion media. Then, flush the endothelial or bottom channel with 100 microliters of prewarmed HIMEC media. After counting, add 10 microliters of HIMECs to the endothelial channel.If required, add organoid growth media or chip expansion media to the epithelial channel and check the seeding density of the HIMECs. Next, invert the chip into the chip cradle placed in the cell culture dish, add DPBS to the reservoir in the chip cradle, and place the chip at 37 degrees Celsius for two to three hours to allow HIMECs to attach to the chip membrane. After incubation, return the chip cradle to an upright position.Gently wash the endothelial channel with 100 microliters of warm HIMEC media and the epithelial channel with organoid growth media or chip expansion media, leaving the media in the channel. For harvesting enteroids, gently aspirate the media and wash the wells containing cell culture matrix hydrogel with 500 microliters of warm DPBS. Add 250 microliters of cold cell recovery solution to each well and scratch the bottom of each well with a fresh pipette tip to disrupt cell culture matrix hydrogel.Add the disrupted cell suspension to a cold 15-milliliter tube on ice and incubate for 45 minutes. After incubation, centrifuge the suspension and remove the supernatant. Then, add two milliliters of warm enteroid dissociation media to the pellet and place the tube in a 37 degrees Celsius water bath.For 60 to 120 seconds, next, add 10 milliliters of cold tissue washing media to the tube. Then, centrifuge and remove the supernatant before resuspending the pellet in 200 microliters of chip expansion media. Using a P200 pipette, dissociate the enteroids and add the suspension into a 1.5-milliliter micro centrifuge tube.Count the cells and adjust the volume of chip expansion media to achieve a concentration of six times 10 to the six cells per milliliter. Then, add 30 microliters of resuspended cell suspension to the top channel of the chip. After returning the chips to the chip cradle, add DPBS to the reservoir and incubate the chips overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.The next day, flush the epithelial channel twice with 100 microliters of chip expansion media and the endothelial channel with 100 microliters of HIMEC media. Then, add two milliliters of the chip expansion media to the top channel inlet reservoir and 300 microliters to the top channel outlet reservoir. Add two milliliters of the HIMEC media to the bottom channel inlet reservoir and 300 microliters to the bottom channel outlet reservoir.Prime the pods and add the chips to the pods. Then add the pods to the culture module. Set a flow rate of 30 microliters per hour and initiate the cycle.The intestinal epithelial cells grown using the neonatal intestine on a chip formed a confluent cell monolayer, and subsequently developed into mature three-dimensional villus-like structure. The addition of a dysbiotic microbiome from a neonate with severe necrotizing enterocolitis to the neonatal intestine on a chip model showed increased expression of TNF-alpha compared to the control.