הרחבת Vivo של תא גזע hematopoietic מיחידה דם טבור להחזיק הבטחה גדולה עבור יישום HSC ברפואה רגנרטיבית וטיפול השתלה. פרוטוקול זה להשתמש קוקטייל ציטוקינים בשילוב עם טיפול חומצה valproic להרחיב במהירות מספר רב של HSCs פונקציונלי עם מאפיינים הדומים מאוד HSCs פרימיטיבי ראשי. בשל ההשפעות המהירות של טיפול חומצה valproic, שיטה זו יש גם פוטנציאל להתגבר על אובדן HSCs הקשורים לעריכת גנים.
שיטה זו עשויה להועיל לדור של מספר גבוה יותר של תאים מהונדסים גנטית בתוך פרק זמן הרלוונטי לפרוטוקולים של שינוי גנים הנמצאים בשימוש כיום. פרוטוקול הרחבת חומצה valproic ex vivo הוא פשוט יחסית ואמין. טיהור תאים חיוביים CD34 עם התקן מפריד התא הוא מאוד לשכפל ומהיר, המאפשר התאוששות מהירה של תאים חיוביים CD34 מטוהרים מאוד.
24 שעות לפני הבידוד של תאים חיוביים CD-34 מדם חבל הטבור, להכין את חיץ ההפרדה על ידי הוספת שני מיליליטר של EDTA טוחן 0.5 ו 33 מיליליטר של 7.5%BSA ל 465 מיליליטר של 1X PBS. מערבבים את המאגר בעדינות ושומרים עליו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ביום הטיהור, לחמם את התקשורת לטמפרטורת החדר.
מחלקים את כל יחידת הדם של חבל הטבור לבקבוק של 75 ס"מ. מדללים את הדם בנפח שווה של PBS בטמפרטורת החדר ומערבבים בעדינות. לאחר מכן, לקבוע את מספר הצינורות הנדרשים לעיבוד כל יחידת הדם חבל הטבור.
הוסף 15 מיליליטר של מדיה הדרגתית צפיפות לכל צינור. מחלקים את הדם המדולל לאט מאוד על גבי שיפוע הצפיפות תוך החזקת הצינור בזווית של 45 מעלות כדי ליצור שתי שכבות. צנטריפוגה הצינור ב 400 גרם במשך 30 דקות עם האצה נמוכה וקצב האטה.
לאחר הצנטריפוגה, התאים המונונוקלאריים ימוקם בשכבה הלבנה בין שכבות המדיה הפלזמה והצפיפות. מעבירים בזהירות את שכבת המעיל באפי לצינור חדש של 50 מיליליטר. לאסוף את כל התאים mononuclear מאותה יחידת דם חבל הטבור לתוך צינור 50 מיליליטר עד שהגיע 25 מיליליטר.
מוסיפים 25 מיליליטר של PBS קר לצינור המכיל 25 מיליליטר של תאים mononuclear ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב 400 גרם וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות שאף את supernatant ולתלות את גלולת התא ב 50 מיליליטר של PBS קר.
לאחר מכן, להסיר 20 microliters של ההשעיה התא לספירה. השתמש מונה תאים אוטומטי כדי לספור את מספר התאים מוכתמים עם או תפוז אקרידין או יודיד פרופיד ולחשב את המספר הכולל של תאים mononuclear. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 400 גרם וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
ראשית, לערבב 300 microliters של חיץ הפרדה עם 100 microliters של האדם FCR IgG ו 100 microliters של חרוזים מגנטיים CD34 כדי לבודד את התאים החיוביים CD34 מ 10 מיליון תאים mononuclear. לאחר מכן, הסר בזהירות את העל-טבעי מצינור של תאים מונונוקלאריים שהיו צנטריפוגניים בעבר. השתמש מחדש את גלולה בתת פתרון חרוז מגנטי באמצעות 500 microliters לכל 10 מיליון תאים.
מערבבים בעדינות ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, הכן את התקן מפריד התאים על-ידי החלפת פתרון האחסון במאגר העבודה והפעלת תוכנית כביסה ואחריה תוכנית שטיפה. לאחר מכן, להוסיף מפריד תאים קרים פועל חוצץ לצינור המכיל את תערובת התא עד הצינור מתמלא לחלוטין.
צנטריפוגה הצינור ב 400 גרם וב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. שאף את העל-טבעי והפעל מחדש את גלולת התא במאגר ריצה של מפריד קר באמצעות שני מיליליטר לכל 10 מיליון תאים. מעבירים את תערובת המתלים של שני מיליליטר לצינורות של 15 מיליליטר.
טען שלושה סטים של הצינורות לתוך מתלה מפריד התאים, אשר כבר מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס. קבוצה אחת של צינורות מכיל MMCs, הקבוצה השנייה של צינורות ישמש כדי לאסוף את השבר השלילי, וקבוצה שלישית של צינורות ישמשו לאיסוף תאים מטוהרים CD34 חיובי. טען את ארון התקשורת להתקן מפריד התאים והפעל את התוכנית המוגדרת מראש.
לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות המכילים את השבר החיובי ב 400 גרם ב וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים החיוביים המטוהרים CD34 במיליליטר אחד של מדיה נטולת סרום. לאחר מכן, השתמש מונה תאים אוטומטי לספור את התאים מוכתמים עם תפוז אקרידין או יודיד פרופידיום.
ראשית, הכן נפח מספיק של מדיה כדי ל הלוח CD34 חיובי תאים מטוהרים בצפיפות של 33, 000 תאים למיליליטר. צלחת תאים חיוביים CD34 מטוהרים בצלחת 12 באר בצפיפות תאים של 50, 000 תאים ב 1.5 מיליליטר של מדיה ל הבאר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח פחמן דו חמצני 5% במשך 16 שעות.
מוסיפים חומצה ולפרואית לתרבויות כך שהריכוז הסופי הוא מילימולר אחד. המשך culturing התאים באותם תנאים במשך שבעה ימים נוספים. בפרוטוקול זה ex vivo, מספר תאי גזע hematopoietic פרימיטיבי שנוצר תאים חיוביים CD34 מבודדים מדם חבל הטבור מוגברת.
המספר הכולל של תאים גרעיניים גבוה משמעותית בתרבויות שטופלו בקוקטייל הציטוקין בלבד. למרות המספר הגבוה יותר של תאים גרעיניים הכולל, מספר תאי גזע hematopoietic בתרבויות קבלת קוקטייל ציטוקין לבד נשאר נמוך במהלך כל תקופת ההתפשטות, לעומת תרבויות שטופלו קוקטייל ציטוקיני וחומצה valproic. המספר הגדול ביותר של תאי גזע hematopoietic נוצר בתרבויות שטופלו בשילוב של קוקטייל ציטוקין וחומצה ולפרואית.
בפרט, ההתרחבות הגדולה ביותר היא להגיע לאחר חמישה עד שבעה ימים לאחר הטיפול עם חומצה valproic. מספר גדל זה של תאי גזע hematopoietic בקורלציה עם עלייה מהירה באחוז תאי גזע hematopoietic, אשר בולט בתוך 24 שעות של טיפול עם חומצה valproic. בעוד העלייה באחוז נשמרת בארבעת הימים הראשונים של תרבות האקס ויוו, היא יורדת בהדרגה לאחר חמישה עד שבעה ימי טיפול.
עם זאת, ירידה זו מתואמת הפוך עם עלייה במספר המוחלט של תאי גזע hematopoietic. העלייה המהירה באחוז תאי הגזע המטופויטיים בתרבויות שטופלו בחומצה ולפרואית נובעת מרכישת הפנוטיפ CD90. תאים חיוביים CD34 המבטאים את הסמן הפנוטיפי CD90 מגיעים כמעט 40 עד 50% מהתאים המורחבים בתרבות אקס ויוו שטופלו בקוקטייל ציטוקין וחומצה ולפרואית במשך ארבעה ימים.
הרכישה של פנוטיפ CD90 הוא אישר לאחר מכן על ידי הרחבת ex vivo של תאים חיוביים CD34 מטוהרים מאוד, כי חסר ביטוי של סמן CD90. בתוך 24 שעות של טיפול בחומצה ולפרואית, כמעט 75% מהתאים המורחבים של אקס ויוו מבטאים CD90. פנוטיפ זה נשמר מאוד במהלך ארבעת הימים הראשונים בתרבויות אלה.
דם טבור מדולל צריך להיות מחלק לאט מאוד על גבי שיפוע הצפיפות תוך החזקת הצינור בזווית של 45 מעלות כדי ליצור שתי שכבות נפרדות. בעקבות הליך הרחבת ex vivo זה, ניתן להזריק את התאים המורחבים לעכברי NSG לקויי מערכת החיסון כדי לבדוק את הפונקציונליות שלהם ואת פוטנציאל חריטה. התאים המורחבים יכולים לשמש כדי לבדוק מגוון רחב של שאלות לגבי הביולוגיה של HSC האדם והעכבר ואת התפקיד של גנים שונים או שחקן קריטי על השלמות התפקודית של HSCs.
הפונקציונליות של אקס ויוו הרחיבה את HSC מיחידה אנושית של דם חבל הטבור, באמצעות טכניקה זו, תיבדק בקרוב בניסוי קליני בחולה עם ממאירות המטולוגית הזקוקה להשתלת מח עצם אלוגניים. טכניקה זו גם אפשרה לנו לחקור את המנגנון שבבסיס הרחבת ex vivo עם טיפול VPA ולקבל תובנות על הביולוגיה של HSCs פרימיטיבי.
