כדי להעריך את היעילות והבטיחות של גישות מבטיחות וחידוש ריפוי גנטי, הבדיקה המקיפה של תאים שעברו שינוי גנים במודלים פרה-קליניים מאומתים ב-vivo היא קריטית. שימור תגובתיות צולבת של סמני פני תאים רלוונטיים של מגיבים, ויכולת ליישם את אותם טיפולים תומכים המנוהלים לחולים לאורך מודלים פרימטים לא אנושיים כדי לחקות מקרוב פרמטרים קליניים. הדגמת ההליך איתי תהיה אני פרז, טכנאי מחקר מהמעבדה של ד"ר הנס-פיטר קיאם.
התחל על ידי הוספת 10 עד 12 aliquots מיליליטר של מח עצם מבודד מתורם פרימטים לא אנושי בריא לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר. מביאים את נפח הצינור עד 50 מיליליטר עם חיץ המוליטי, ו דגירה התאים עד שבע דקות בטמפרטורת החדר. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה, ושואפים את כל 2-5 המיליליטרים האחרונים של העל-טבעי.
תן מחדש את גלולה בנפח על טבעי שיורית על ידי הבהוב הצינור, ולהעביר את מתלי מח העצם לתוך צינור חדש 50 מיליליטר באמצעות מסננת תא נקבובית 70 מיקרומטר כדי להסיר את כל קרישי הדם. מוסיפים חיץ המוליטי טרי כדי להביא את עוצמת הקול עד 50 מיליליטר, ו דגירה התאים במשך חמש דקות נוספות בטמפרטורת החדר לפני האוסף שלהם על ידי צנטריפוגה. שאף את כל העל-טבעי והתן מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של חיץ מרבי.
לפני סינון ההשעיה התא דרך מסננת נקבובית נוספת של 70 מיקרומטר, שטפו את הצינור עם 40 מיליליטר של חיץ טרי, ובריכה לשטוף עם המתלה התא. לאחר העשרה עבור תאים חיוביים CD34 על פי פרוטוקולי מיון תאים בסיוע מגנטי סטנדרטי, לשטוף את התאים מבודדים חרוזים עד 50 מיליליטר של מאגר מרבי טרי, ו resuspend את גלולה במדיום HSPC. ואז צלחת 10 עד 20 מיליליטר של התאים לתוך רקמות מאווררות בתרבות מטופלים T75 flasks לתרבות הלילה שלהם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.
כדי להעריך את טוהר ההעשרה לפני ולאחר של דגימות התא של מח העצם ליצור פרוטוקול cytometry זרימה עם חלקות מתאימות היררכיה האוכלוסייה מראה את כל השערים עבור כל האירועים להתפזר, CD34 חיובי, תאי גזע hematopoietic, רב תכליתי א-אריתרו מיאלואידים האבות מיאלואידים. לאחר מכן, הפעל דגימת תאי דם לבנים לא מזוהמים, טרום העשרה, כדי להתאים את המתחים לפרמטרים של פיזור קדימה וצד, וכל תעלות הפלואורסצנטיות ואחריהן חרוזי פיצוי מוכתמים בודדים כדי להתאים את הפיצוי בין הערוצים הסמוכים. לאחר מכן הפעל את כל הדגימות הנותרות שאינן מוכתמות ומוכתמות בפרוטוקול המותאם והמפוצה כדי לתעד את יעילות ההעשרה של CD34.
כאשר כל הפיצויים נקבעו להגדיר את סדרן התא עבור טיהור המיון של ערכות המשנה CD34 לתוך המושבה להרכיב מעין תא, ולטעון את צינור מדגם מועשר CD34 מוכתם על הציטרומטר. לאחר מכן הקליטו 2000 עד 3000 אירועים, והתאיימו עין את שערי המיון כך שיתאימו לעוצמת האות ולאוכלוסיות היעד. לאחר השלמת ההתקנה, התאים המתכווים את קצב הזרימה ל- 500 עד 1000 תאים לשניה, ומיון 800 עד 1200 תאים מהפיזור, CD34 חיובי, תא גזע hematopoietic, רב תכליתי א-אריתרו מיאלואיד אבי העורקים לימפו מיאלואיד שערים לתוך צינורות נפרדים המכילים 3.6 מיליליטר של המושבה להרכיב תא בינוני לכל צינור.
בסוף המערבולת סוג צינורות האיסוף, ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיית תאים לשלושה סטרילי 3.5 ס"מ, תרבות שאינה רקמה מטופלים צלחות פטרי להגדיר בתוך בודדים 15 ס"מ פטרי מנות לכל אוכלוסיית התא עבור הדגירה שלהם 10-14 יום ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר להשתמש פיפט 10 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות את התאים חסידים מתחתית כל בקבוק עם HBSS סטרילי, ולאסוף את התאים שנקטפו על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר בתאים במדיום ההעתקה בריכוז של 1 x 10 לתאים השישיים למיליליטר.
ולהוסיף מיליליטר אחד של תאים לשליטה מדומה באר אחת של שבר פיברונקטין רקומביננטי מצופה 12 צלחת גם עבור דגירה לילה באינקובטור תרבות התא. לאחר מכן להוסיף 10 aliquots מיליליטר של התאים הנותרים לתוך שבר פיברונקטין רקומביננטי מצופה T75 בקבוקים עבור דגירה 30 דקות באינקובטור תרבות התא עם הכובעים מאווררים. במהלך הדגירה להפשיר וירוס מותנה דגימות בינוניות ולחשב את כמות הנגיף להתווסף על סמך טיטר ומספר יחידות זיהומיות של תאים למיליליטר.
מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור ומוסיפים את הנפח המתאים של הנגיף המותנה בינוני לכל בקבוקון לפני החזרת התאים ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. למחרת בבוקר להעביר את התאים מהבקבוק לתוך צינורות חרוט בודדים 50 מיליליטר. לשטוף את התאים עד 50 מיליליטר של HBSS לכל לשטוף, ולחזור על צעד זה עד שלוש פעמים כדי להסיר וירוס שיורית.
הדגירה את התאים במשך שעתיים במדיה HSPC בתוספת פרוסטגלנדין E2. לאחר מכן לשטוף את התאים ו resuspend התאים ב 10 מיליליטר של HBSS בתוספת 2% סרום אוטולוגי לכל צינור. ואז שאף את מתלי התא באמצעות מזרק 20 מיליליטר מצויד במחט מד 16.5. לשטוף את החלק הפנימי של הצינור עם HBSS טרי בתוספת 2% סרום אוטולוגי, ולשאוף לתוך המזרק.
בזהירות לכסות את המזרק עם מכסה המחט לפני הנחת פתרון התא על קרח עד עירוי שלה לתוך מארח אוטולוגי. כדי לקבוע את יעילות שינוי הגנים של התאים המתומרים, לוח 1 x 10 לתאים השמורים השישית או התומרה למיליליטר של מדיום HSPC על לוחות שטופלו בתרבות שאינה רקמה. בימים 2, 5 ו-12 לאחר ההעתקה, לקצור ול לספור את התאים.
בימים 2 ו-5, יש להכפיל את עצמם ל-33% מהתאים במדיום HSPC טרי בריכוז של 1 x 10 עד השישי למיליליטר. בימים 2, 5 ו-12, להקפיא 33% מהתאים במאגר מיצוי DNA עבור PCR כמותי בזמן אמת, ולנתח את 33% הסופי של התאים על ידי cytometry זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי להעריך את ההרכב הפנוטיפי של הצאצא hematopoietic. כדי לכמת את ביטוי הטרנסג'ין לפי ציטומטריית זרימה, הוסף שלושה פיזור צד נוסף לעומת.
עלילות טרנסג'נדריות;ושער העלילה הראשונה על תאי הגזע המטופויטיים, העלילה השנייה על הא-אריתרו מיאלואידים הרב-תכליתיים, והמזימה השלישית על אבי הלימפה מיאלואידים, כולם נגד הטרנסג'ין. לאחר מכן הקליטו 2000 עד 3000 אירועים והתאיימו עין את שערי המיון כך שיתאימו לעוצמת האות ולאוכלוסיות היעד.
באמצעות פרוטוקול זה מספר ה-CD34 החיובי של הפרימט הלא אנושי המועשר הוא בדרך כלל פרופורציונלי לספירת תאי הדם הלבנים הכוללת של הקלט. כמו ממצאים קודמים הראו כי המוצר הכולל CD34 חיובי HSPC כולל תאים כי הם לא נכון לטווח ארוך השתלת תאי גזע hematopoietic, אלה cytometry זרימה מבוסס ומושבה להרכיב טכניקות תא יכול לשמש כדי לזהות ולהבדיל באופן אמין תת קבוצות מועשר עבור תאי גזע hematopoietic לטווח ארוך מן הצאצאים מחויבים. CD34 תאי גזע אנושיים חיוביים מועשרים תאים ניתן לשנות ביעילות באמצעות וקטורים lentiviral.
תאים הנושאים עותק לא משולב של הווקטור מדוללים החוצה במהלך תקופת ההתזה של 12 הימים של התרבות הנוזלית, ואילו וקטורים משולבים היטב בגנום מועברים לכל בני העורב. כפי שאושר על ידי הביטוי של הווקטור במושבה ויוצרים משגיחי תאים. שיטה פרה-קלינית זו יכולה לשמש לבידוד מהונדס גנטית בגזע הפרימטים המטופויטיים הנשלטים על ידי איכות ותאי פרימטים ראשוניים לריפוי גנטי.
שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות עבור מינים אחרים, מקורות של גזע hematopoietic ותאי ההדגנה, כלי ריפוי גנטי ומחלות. פרוטוקול זה נבדק ביסודיות מראה הבטחה גדולה עבור מידול של טיפולים יעילים עבור מחלות אנושיות רבות. זכור שעבודה עם רקמות פרימטים לא אנושיות דורשת אמצעי אבטחה משופרים, כולל ציוד מגן אישי.
