מערכות אקולוגיות חופיות וימיות חשובות כמאגרים, להסרת חנקות ממערכות אקולוגיות יבשתיות. חנקת בסביבה מימית ניתן לצרוך על ידי מספר תהליכים בו זמנית. כגון דה-ניטריפיקציה, אנאמוקס ו-DNRA.
בעוד מחקרים קודמים הראו כי DNRA הוא אשם פוטנציאלי denitrification, מחקרים מדידת פעילות DNRA עדיין מוגבל מאוד בהשוואה לאלה מדידת denitrification. בפרוטוקול שלנו, אנו מספקים הליך מפורט למדידת שיעור DNRA הפוטנציאלי בדגימות סביבתיות. אנו מאמינים כי שיעור DNRA פוטנציאלי ניתן לחשב מן N15 שכותרתו הצטברות אמוניום עם N15 שכותרתו תוספת חנקתית.
היתרון של השיטה שלנו בהשוואה לשיטות אחרות, הוא כי אמוניום מומר בסופו של דבר תחמוצת חנקן, אשר יש רקע אטמוספרי נמוך. כמו כן זה לא חכם שמדדנו תחמוצת חנקן באמצעות ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה גז מרובע. וזה פחות יקר וקל לניהול מאשר ספקטרומטר מסה יחס איזוטופ.
ראשית, מניחים חתיכה 60 מילימטר של סרט PTFE על גיליון קטן של רדיד אלומיניום. אפר מסנן סיבי זכוכית ב 450 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בתנור עמום. לאחר מכן מקם את מסנן סיבי הזכוכית קצת מעל נקודת האמצע של הציר הארוך יותר של הקלטת.
לאחר מכן, ספוט 20 microliters של 0.9 שומות לליטר של חומצה גופרתית במרכז מסנן סיבי זכוכית, ומיד לקפל את קלטת PTFE באמצעות בול שטוח הסתיים פינצטה סוף ישר. הפוך את קלטת PTFE על מסנן סיבי הזכוכית, ולאחר מכן לאטום את שני הצדדים של קלטת PTFE על ידי קיפול ולאחר מכן בחוזקה לחיצה על הקצה עם פינצטה. באמצעות פינצטה, לקפל את הקצה הפתוח של קלטת PTFE, ולחץ על הקצה.
לאטום את הקצה הפתוח של קלטת PTFE על ידי לחיצה הדוקה על הקצה עם פינצטה, דואג לא ללחוץ על מסנן סיבי זכוכית. מעבירים 30 מיליגרם של תחמוצת מגנזיום אפר, לבקבוקון זכוכית 20 מיליליטר, ומנחים את מעטפת PTFE בבקבוקון. מעבירים חמישה מיליליטר של מדגם או תקן שהוכנו בעבר לתוך הבקבוקון המכיל את תחמוצת המגנזיום ואת מעטפת PTFE.
ומיד לסגור את הבקבוקון עם פקק גומי בוטיל אפור. לאחר מכן, לאטום את הבקבוקון עם כובע אלומיניום. לנער את הבקבוקונים ב 150 סל"ד במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בתנאים כהים.
לאחר מכן, להסיר את מכסה אלומיניום פקק גומי בוטיל מכל בקבוקון. הסר את מעטפת PTFE מכל בקבוקון באמצעות פינצטה הסתיימה, ולשטוף ביסודיות את המעטפה ואת פינצטה עם מים מוחלפים יון. לאחר מכן, נגב את המעטפה ואת פינצטה עם נייר ניגוב, והצב את המעטפה על נייר ניגוב טרי.
פתח את מעטפת PTFE עם פינצטה שטוחה הסתיימה ומחודדת בסדר הפוך של שלבי הקיפול. באמצעות פינצטה שטוחה הסתיימה, להחזיק את האזור ההיקפי של מסנן סיבי זכוכית, שבו חומצה גופרתית אמור להיות unabsorbed. ולהעביר אותו למבחנה 11 מילימטר כובע בורג.
שוטפים את פינצטה במים מוחלפים ומנגבים אותם בנייר ניגוב. מוסיפים מיליליטר אחד של מים מוחלף יון לכל מבחנה. סגור את המבחנות עם כובעי בורג מרופדים PTFE, ולאפשר להם לעמוד לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחמוק לחלוטין את הקטיון אמוניום ממסנן סיבי זכוכית.
לאחר מכן, לפתוח את מכסה הבורג, להוסיף שני מיליליטר של reagent פתרון חמצון שכנוע שהוכן בעבר למבחנה, ולסגור את הצינור בחוזקה עם מכסה בורג, כדי למנוע כל אובדן או זיהום במהלך השלבים הבאים. עמדו במבחנות על מתלה, עטפו אותן בנייר אלומיניום דו שכבתי, ובודדו אותן בתווית זקופה למשך שעה אחת ב-121 מעלות צלזיוס. מערבבים 100 מיליליטר של חיץ סטרילי 40 מילימול לליטר פוספט, ו 100 מיליליטר של סטרילי 30 מילימול לליטר גלוקוז באופן בלתי ניתן לדקה.
הוסף מלאי גליצרול של P.chlororaphis ל 200 מיליליטר של תמיסת גלוקוז מאוגר פוספט, בבקבוק ארלנמאייר 300 מיליליטר. וטיהור עם זרם הליום טהור במיוחד למשך שעה. לאחר מכן, מחלקים שני מיליליטר של השעיה denitrifier מוכן בעבר לתוך חמישה בקבוקונים מיליליטר.
מכסים כל בקבוקון עם פקק גומי בוטיל אפור, וסגירת אלומיניום. החלף את האוויר Headspace עם הליום טהור במיוחד, על ידי שאיבת אבק במשך שלוש דקות טעינת הליום במשך דקה אחת. הגדר את הלחץ החיובי של גז Headspace ל-1.3 אטמוספרות, כדי למנוע זיהום אוויר לא מכוון.
להזריק מיליליטר אחד של מדגם או סטנדרטי דרך פקק גומי בוטיל, באמצעות מזרק חד פעמי מיליליטר אחד. לאחר מכן, הדגירה את הבקבוקונים לילה ב 25 מעלות צלזיוס, בתנאים כהים. ביום שלמחרת, להזריק 0.3 מיליליטר של שש שומות לליטר נתרן הידרוקסיד כדי לעצור את denitrification ולספוג את פחמן דו חמצני Headspace, אשר אחרת להפריע ניתוח תחמוצת החנקן.
כי לפחמן דו-חמצני ולתחמוצת חנקן יש את אותו משקל מולקולרי. לקבוע את כמויות תחמוצת החנקן עם משקל מולקולרי של 44, 45 ו 46, בגז Headspace באמצעות QUADRUPOLE GC / MS עם יציאת הזרקה שונה. התוצאות הייצוגיות נגזרו מ-15 ניסויי מעקב חנקן של מים של ביצות מלח שנוצרו מרעידת האדמה הגדולה במזרח יפן בשנת 2011 באזור הירח של העיר קסנומה ומוח מיאגי, יפן.
עלייה בריכוז אמוניום שכותרתו לאורך כל תקופת הדגירה נצפתה עבור כל המעים שנאספו באזורים subtidal ו intertidal. שיעורי DNRA היו בטווח של 24.8 עד 177. והם דומים לערכים שדווחו במחקרים קודמים, אך גבוהים יותר מהערכים הנגזרים בסביבות דומות.
שיעור DNRA גבוה, עשוי להיות מוסבר על ידי הביצה מלח בשימוש כשדה טיפוח לפני רעידת האדמה. בהתאם לספקולציות, שיעור ה- DNRA באזור הבין-אזורי, שהוא תרכובות עשירות ואורגניות בהשוואה לאזור התת-קטגורי, היה גבוה יותר. הפרוטוקול שלנו ישים באופן נרחב לניתוח של מסלולים מטבוליים, הכולל היווצרות אמוניום ותוספות עקבות N15.
