Os ecossistemas costeiros e marinhos são importantes como reservatórios, para a remoção de nitrato de ecossistemas terrestres. O nitrato no ambiente aquático pode ser consumido por vários processos simultaneamente. Como denitrificação, anammox e DNRA.
Embora estudos anteriores tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente culpado pela denitrificação, estudos que medem a atividade do DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação. Em nosso protocolo, fornecemos um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Acreditamos que a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir do acúmulo de amônio rotulado N15 com adição de nitrato rotulado N15.
A vantagem do nosso método em comparação com outros métodos, é que o amônio é finalmente convertido em óxido nitroso, que tem um baixo fundo atmosférico. Também não é sábio que medimos óxido nitroso através de espectrômetro de massa de gás quadrupole. O que é menos caro e fácil de gerenciar do que um espectrômetro de massa de razão de isótopos.
Primeiro, coloque um pedaço de fita PTFE de 60 milímetros em uma pequena folha de papel alumínio. Ash um filtro de fibra de vidro a 450 graus Celsius por quatro horas em um forno de abafa. Em seguida, coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita.
Em seguida, local 20 microliters de 0,9 mols por litro de ácido sulfúrico no centro do filtro de fibra de vidro, e imediatamente dobre a fita PTFE usando selo de final plano e pinças retas. Vire a fita PTFE sobre o filtro de fibra de vidro e, em seguida, sele ambos os lados da fita PTFE dobrando e, em seguida, pressionando firmemente a borda com a pinça. Usando a pinça, dobre a extremidade aberta da fita PTFE e pressione a borda.
Sele a extremidade aberta da fita PTFE pressionando firmemente a borda com a pinça, tomando cuidado para não pressionar o filtro de fibra de vidro. Transfira 30 miligramas de óxido de magnésio cinzas para um frasco de vidro de 20 mililitros, e coloque o envelope PTFE no frasco. Transfira cinco mililitros de uma amostra ou padrão previamente preparado para o frasco contendo o óxido de magnésio e o envelope PTFE.
E imediatamente feche o frasco com uma rolha de borracha de butyl cinza. Em seguida, sele o frasco com uma tampa de alumínio. Agite os frascos a 150 RPM por três horas a quatro graus Celsius em condições escuras.
Na sequência, remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl de cada frasco. Remova o envelope PTFE de cada frasco usando pinças de ponta e enxágue completamente o envelope e a pinça com água trocada por íons. Em seguida, limpe o envelope e as pinças com papel limpo, e coloque o envelope em papel de limpeza fresco.
Abra o envelope PTFE com pinças pontiagudas e pontas em ordem inversa das etapas dobráveis. Usando pinças de ponta plana, segure a área periférica do filtro de fibra de vidro, onde o ácido sulfúrico deve ser não absorvido. E transfira para um tubo de teste de tampa de parafuso de 11 milímetros.
Enxágüe as pinças com íons trocadas de água e limpe-as com papel de limpeza. Adicione um mililitro de íon trocado água a cada tubo de ensaio. Feche os tubos de ensaio com tampas de parafuso forradas ptfe e deixe-os ficar em pé por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente, para iludir completamente a cáção de amônio do filtro de fibra de vidro.
Na sequência, abra a tampa do parafuso, adicione dois mililitros de um reagente de solução oxidante persulfeto previamente preparado ao tubo de ensaio e feche o tubo firmemente com uma tampa de parafuso, para evitar qualquer perda ou contaminação durante as etapas seguintes. Coloque os tubos de ensaio em um rack, enrole-os em papel alumínio em camada dupla e autoclave-os em uma posição vertical por uma hora a 121 graus Celsius. Misture 100 mililitros de 40 mililitros por litro tampão fosfato, e 100 mililitros de 30 mililitros por litro de glicose asepticamente.
Adicione um estoque de glicerol de P.chlororaphis a 200 mililitros da solução de glicose tamponada fosfato, em um frasco de 300 mililitros Erlenmeyer. E purgar com um fluxo de hélio ultra puro por uma hora. Em seguida, dispense dois mililitros de uma suspensão denitrifier previamente preparada em frascos de cinco mililitros.
Tampe cada frasco com uma rolha de borracha de butyl cinza, e um fechamento de alumínio. Substitua o ar do Headspace por hélio ultra puro, aspirando por três minutos e carregando o hélio por um minuto. Coloque a pressão positiva do gás Headspace em 1,3 atmosferas, para evitar contaminação de ar não intencional.
Injete um mililitro de uma amostra ou padrão através da rolha de borracha butil, usando uma seringa descartável de um mililitro. Em seguida, incubar os frascos durante a noite a 25 graus Celsius, em condições escuras. No dia seguinte, injete 0,3 mililitros de seis mols por litro de hidróxido de sódio para parar a denitrificação e absorver o dióxido de carbono do Headspace, que de outra forma perturbará a análise de óxido nitroso.
Porque dióxido de carbono e óxido nitroso têm o mesmo peso molecular. Determine as quantidades de óxido nitroso com um peso molecular de 44, 45 e 46, no gás Headspace usando quadrupole GC/MS com uma porta de injeção modificada. Os resultados representativos foram derivados de 15 experimentos de rastreamento de nitrogênio de sedimentos de pântanos de sal criados a partir do Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área lunar da cidade de Kesennuma e da província de Miyagi, no Japão.
Observou-se aumento da concentração de amônio rotulado ao longo do período de incubação para todos os sedimentos coletados nas zonas subtidal e intertidacidade. As taxas de DNRA estavam dentro da faixa de 24,8 a 177. E são comparáveis aos valores relatados em estudos anteriores, mas superiores aos valores derivados de ambientes semelhantes.
A alta taxa de DNRA pode ser explicada pelo pântano de sal sendo usado como um campo de cultivo antes do terremoto. Consistente com a especulação, a taxa de DNRA na zona intertidal, que é rica e orgânica em comparação com a zona subtidal, foi maior. Nosso protocolo é amplamente aplicável à análise de vias metabólicas, que envolve formação de amônio e adições de traços N15.
